12
Úloha č. 1: MONO-, OLIGO- A POLYSACHARIDY
A. KVALITATIVNÍ REAKCE SACHARIDŮ
Cílem kvalitativních reakcí je rozdělení sacharidů dle jejich chemického složení.
Jednotlivé reakce provádějte v návaznosti dle Schéma 1: Postup kvalitativních reakcí
sacharidů
Schéma 1: Postup kvalitativních reakcí sacharidů
Pomůcky:
Zkumavky, lžičky, špachtle, pipetky, kádinky, stojan, žíhací kruh, síťka, vodní lázeň (vařič a
kádinka).
Vzorky:
Vzorky sacharidů – glukóza, fruktóza, sacharóza, laktóza, ribóza, dextrin, škrob, aj.
Závěr:
Do tabulky (Tab. 2: Tabulka výsledků kvalitativních zkoušek jednotlivých vzorků) uveďte
rekci každého vzorku. Vyplněnou tabulku uveďte to protokolu s popisem vlastních pozorování.
13
a. Thymolová reakce – důkaz sacharidů I.
Princip:
Účinkem koncentrované HCl na monosacharidy dochází k dehydrataci a vzniku furfuralu či
jeho derivátů. Furfural i jeho deriváty podléhají kondenzaci s fenoly (thymol) za vzniku barevného
produktu. Sacharidy poskytují reakcí s roztokem thymolu v přítomnosti HCl tmavočervené až
purpurové sloučeniny
Chemikálie:
Koncentrovaná HCl, 5% (w/v) ethanolový roztok thymolu, NaCl
Pracovní postup:
1. Do několika zkumavek nasypte na špičku špachtle různých druhů pevných sacharidů a
rozpusťte v destilované vodě. V případě kapalného sacharidu nalijte vzorek do zkumavky.
2. Do zkumavek se vzorky přidejte asi 5 kapek roztoku thymolu, 10 cm3
konc. HCl a několik
krystalků NaCl.
3. Zkumavku umístěte do vodní lázně a mírně zahřívejte, dokud nedojde ke změně barvy.
4. Připravte slepý vzorek – místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu.
5. Určete neznámý vzorek – podle bodu 1.–3. určete zda vzorek obsahuje sacharid.
b. Molischova reakce – důkaz sacharidů II.
Princip:
Účinkem koncentrované HCl na monosacharidy dochází k dehydrataci a vzniku furfuralu či
jeho derivátů. Furfural i jeho deriváty podléhají kondenzaci s fenoly (1-naftol) za vzniku barevného
produktu. Sacharidy poskytují reakcí s Molischovým činidlem fialový prstenec na rozhraní
koncentrované H2SO4 a roztoku sacharidu.
Chemikálie:
Molischovo činidlo – 3% ethanolický roztok 1-naftolu; koncentrovaná H2SO4
Pracovní postup:
1. Ke 2 ml roztoku vzorku ve zkumavce přidejte 5 kapek Molischova činidla a protřepejte.
2. Podvrstvěte 2 ml konc. H2SO4 (kyselinu nechte opatrně stékat po stěně zkumavky)
3. Na rozhraní kyseliny a sacharidu vznikne intenzivně zbarvený (červený, červenofialový,
fialový, modrý až hnědý) prstenec.
4. Zamícháním se kapalina zbarví tmavě fialově; zředěním vodou se vyloučí modrofialová
sraženina rozpustná v etheru za vzniku žlutého roztoku.
5. Připravte slepý vzorek – místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu.
6. Určete neznámý vzorek – podle bodu 1.–4. určete zda vzorek obsahuje sacharid.
Pozn.: reakce není specifická jen pro sacharidy a ovlivňují ji např. nečistoty v 1-naftolu (zelené
zbarvení) nebo přítomnost bílkovin ve vzorku (bílý pruh).
c. Nitrochromová reakce – důkaz mono- a oligosacharidů
Princip:
Reakcí koncentrované kyseliny dusičné a chromanu draselného se sacharidem dochází
k oxidaci mono- a oligosacharidů. Chroman (Cr+6
) se redukuje na modře zbarvené kationty
14
chromnaté (Cr+2
). Sekundární alkoholická skupina sacharidu reaguje s chromanem v kyselém
prostředí za vzniku modrého zbarvení. Polysacharidy nereagují.
Chemikálie:
Konc. HNO3, 5% (w/v) roztok K2CrO4
Pracovní postup:
1. Ke 2 ml vzorku sacharidu přidejte asi 3 ml konc. HNO3 a 5 kapek roztoku K2CrO4.
2. Po chvíli (cca2 min) pozorujte vznik modrého zabarvení
3. Připravte slepý vzorek – místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu.
4. Určete neznámý vzorek – podle bodu 1.–2. určete, zda neznámý vzorek obsahuje
polysacharid.
Pozn.: z polysacharidů reaguje inulin a škroby, kdy po delší době dochází k hydrolýze. Hydrolýzou
vzniklé mono- a oligosacharidy pak poskytují pozitivní reakci
d. Jodový test – důkaz polysacharidů (rozlišení škrobu a celulózy)
Princip:
Škrob i celulóza jsou polysacharidy složené tisíce jednotek molekuly glukózy. Škrob se skládá
ze dvou různých polysacharidů (amylóza a amylopektin). Škrob reaguje s Lugolovým roztokem za
vzniku modrého zbarvení, které zahřátím mizí.
Chemikálie:
Lugolův roztok – 5 g I2 a 10 g KI v 85 ml destilované vody
Pracovní postup:
1. Ke 1 ml roztoku sacharidu přidejte asi 1 kapku Lugolova roztoku.
2. Po chvíli pozorujte vznik modrofialového až modročerného zabarvení.
3. Zkumavku zahřejte k varu dokud se směs neodbarví.
4. Po ochlazení se opět objeví modré zbarvení
5. Připravte slepý vzorek – místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu.
6. Určete neznámý vzorek – podle bodu 1.–2. určete, zda neznámý vzorek obsahuje škrob.
e. Fehlingova reakce – rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů I
Princip:
Oxidačně – redukční reakce probíhá pouze u skupiny tzv. redukujících cukrů. To jsou takové
cukry, které mohou mít v otevřené formě volnou, oxidace schopnou, karbonylovou skupinu. Může jít
jak o monosacharidy, tak disacharidy, trisacharidy či vyšší mery sacharidů. Má-li dojít k viditelné
reakci (změna barvy sloučeniny mědi z modré na žlutočervenou), musí být v roztoku dostatečná
koncentrace koncových merů, které mohou mít v otevřené formě volnou, oxidace schopnou,
karbonylovou skupinu. Pokud tomu tak není, jedná se o tzv. cukr neredukující. Oxidačně – redukční
reakce obvykle probíhá pouze do stupně redukce Cu+2
(Rov. 1) na Cu+1
. V případě vyšší koncentrace
redukujícího sacharidu může dojít k redukci až na Cu (Rov. 2).
2 –COH + O2 + 2 Cu+2
→ –COOH + 2 Cu+1
Rov. 1
2 –COH + O2 + 2 Cu+1
→ –COOH + 2 Cu Rov. 2
15
Obr. 13: Princip Fehlingovy reakce
Chemikálie:
Fehlingovo činidlo I: 4 g CuSO4 5H2O rozpusťte v destilované vodě a doplňte na 100 ml.
Fehlingovo činidlo II - 20 g KNaC4H4O6 4H2O a 15 g NaOH rozpusťte v destilované vodě a
doplňte na 100 ml.
Pracovní postup:
1. Do několika zkumavek nasypte na špičku špachtle různých druhů pevných sacharidů a
rozpusťte v destilované vodě. V případě kapalného sacharidu nalijte vzorek do zkumavky.
2. Do zkumavek se vzorky přidejte 1 ml roztoku Fehling I a 1 ml roztoku Fehling II.
3. Zkumavku umístěte do vodní lázně a zahřívejte, dokud nedojde ke změně barvy.
4. Připravte slepý vzorek – místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu.
5. Určete neznámý vzorek – podle bodu 1.–3. určete neznámý vzorek (redukující x
neredukující)
f. Tollensova zkouška – rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů II
Princip:
Tollensovo činidlo (dusičnan diamminstříbrný [Ag(NH3)2]NO3) vzniká reakcí dusičnanu
stříbrného a koncentrovaného roztoku hydroxidu amonného za vzniku amonného komplexu (Rov. 3
a Rov. 4). Reakcí Tollensova činidla s aldehydickou skupinou sacharidů vzniká amonná sůl
karboxylové kyseliny a redukované stříbro (Rov. 5). Pozitivní reakce činidla s redukujícím cukrem
se projeví vznikem tzv. stříbrného zrcátka na stěnách zkumavky.
2 AgNO3 + 2 NaOH → Ag2O (s) + 2 NaNO3 + H2O Rov. 3
Ag2O (s) + 2 NaNO3 + 4 NH4OH → [Ag(NH3)2]NO3 + 2 NaOH + 4 H2O Rov. 4
2 Ag+
[NH3]0
+ R–HCO → 2 Ag0
+ R–COO NH4
+
+ 2 NH3 + H2O Rov. 5
Obr. 14: Princip Tollensovy reakce
Chemikálie:
5% roztok AgNO3 v H2O, 10% NaOH v H2O, koncentrovaný NH4OH, H2O
Pracovní postup:
1. Tollensovo činidlo připravte smísením stejného objemu roztoku AgNO3 a NaOH (Rov. 3).
Následně do zkumavky přidejte koncentrovaný NH4OH, přičemž se hnědá sraženina Ag2O
16
rozpustí (Rov. 4). Delším stáním ve směsi může vznikat velmi výbušné Bertholetovo
třaskavé stříbro Ag3N!
2. Do několika zkumavek připravte vzorky sacharidů ve formě vodného roztoku.
3. Ke vzorkům sacharidů ve zkumavkách přikápněte Tollensovo činidlo.
4. Za přítomnosti redukujícího cukru dojde dle Rov. 5 ke vzniku stříbrného zrcátka.
5. Porovnejte se slepým vzorkem. Místo vzorku sacharidů nadávkujte pouze vodu.
6. Určete neznámý vzorek
g. Selivanova reakce – roližení aldóz a ketóz I.
Princip:
Podstatou reakce je dehydratace sacharidů koncentrovanými kyselinami na
5-(hydroxymethyl)fural, který následně reaguje s resorcinolem za vývoje třešňově červeného
produktu (Obr. 5).
Obrázek 1: Princip Selivanovy reakce
Cílem reakce je rozlišení ketos (např. fruktóza) a aldos (např. glukosa). Ketosy reagují rychleji
než aldosy. Aldosy poskytují pouze slabě růžové zbarvení kvůli pomalejší dehydrataci, kdy nejprve
dochází k izomerizaci aldosy na ketosu. Reakce aldos je asi 20⨯ pomalejší.
Pozitivní výsledek poskytuje fruktóza a sacharóza zatímco glukóza nereaguje.
Chemikálie:
Selivanovo činidlo: 0,05 g resorcinolu se rozpustí ve směsi 50 cm3
HCl a 50 cm3
H2O
Pracovní postup:
1. Ke vzorkům sacharidů ve formě roztoku (cca 1 cm3
) přidejte cca 2 cm3
Selivanova činidla.
2. Sledujte změnu zbarvení
3. Porovnejte se slepým vzorkem
4. Určete neznámý vzorek
h. Reakce s močovinou – odlišení aldóz a ketóz II.
Chemikálie:
Močovina, konc. HCl
Pracovní postup:
1. Do zkumavky odvažte asi 0,5 g močoviny a přidejte 6 kapek HCl.
2. Ke směsi přidejte 3 kapky roztoku sacharidu.
3. Reakční směs promíchejte, aby se močovina rozpustila
4. Zkumavku zahřívejte 15 min na vodní lázni.
17
5. Sledujte změnu zbarvení – aldózy reagují vývojem zelenomodrého zbarvení, ketózy se barví
červeně.
6. Porovnejte se slepým vzorkem
7. Určete neznámý vzorek
i. Barfoedova reakce – důkaz monosacharidů
Princip:
Roztoky sacharidů reagují s barefeodovým činidlem červenohnědou sraženinu
Octan měďnatý se v kyselém prostředí redukuje na oxid měďný (červená sraženina) a zároveň
dochází k oxidaci monosacharidů na příslušné aldonové kyseliny (např.: glukosa – k. glukonová).
Aldehydová skupina se oxiduje na karboxylovou skupinu, zatímco skupina –CH2OH zůstává
zachována. Přednostně se redukují monosacharidy. Všechny monosacharidy mají redukční účinky,
protože mají volnou aldehydovou skupinu (aldosy), nebo je možná izomerizace ketoskupiny na
aldoskupinu (ketosy)), až po delší době reagují redukující disacharidy.
Reakce sacharidů s Barfoedovým činidlem je podobně jako reakce sacharidů s Fehlingovým
činidlem založena na redukci Cu2+
na Cu2O (oranžová či červená sraženina). Redukce Cu2+
v
Barfoedově testu probíhá v kyselém prostředí (kyselina octová), na rozdíl nebo Fehlingova testu, kdy
Cu2+
se redukují v zásaditém prostředí hydroxidu sodného
Chemikálie:
Barfoedovo činidlo: 7 g octanu měďnatého Cu(CH3COO)2 a 0,9 ml konc. Kyseliny octové
CH3COOH se doplní po 100 ml destilovanou vodou.
Pracovní postup:
1. Ke 2 ml roztoku sacharidu přidejte 2 ml Barfoedova činidla.
2. Zkumavku ponořte do vodní lázně.
3. Sledujte změnu zbarvení – monosacharidy reagují vznikem červené sraženiny, ostatní roztoky
jsou modré.
4. Porovnejte se slepým vzorkem
5. Určete neznámý vzorek
Pozn.: reakce je specifická na důkaz redukujících monosacharidů, redukující disacharidy vzhledem
k slabě kyselé povaze Barfoedova činidla pozitivní reakci neposkytují vůbec nebo až po delší době.
j. Bialova reakce – důkaz pentóz a hexóz
Princip:
Bialova reakce odlišuje pentózy a hexózy. Dehydratací pentózy (5-uhlíkový sacharid) vzniká
furfural, který reaguje s Bialovým činidlem za vzniku modrého kondenzačního produktu.
Dehydratací hexózy (6-uhlíkový sacharid) vzniká 5-hydroxymethylfurfural reaguje
s Bialovým činidlem za vzniku hnědého, červenohnědého nebo zeleného kondenzačního produktu.
18
Obr. 15: Princip Bialovy reakce
Chemikálie:
Bialovo činidlo: 6,25 mg FeCl3 + 0,75 g orcinol (5-methylbenzen-1,3-diol CH3C6H3(OH)2 +
250 ml konc. HCl
Pracovní postup:
1. K 1 ml Bialova činidla přidejte 5–6 kapek roztoku sacharidu.
2. Zkumavku zahřejte k varu.
3. Sledujte změnu zbarvení (2–3 min) Porovnejte se slepým vzorkem
4. Určete neznámý vzorek
Pozn.: reakce je specifická na důkaz redukujících monosacharidů, redukující disacharidy vzhledem
k slabě kyselé povaze Barfoedova činidla pozitivní reakci neposkytují vůbec nebo až po delší době.
Tab. 2: Tabulka výsledků kvalitativních zkoušek jednotlivých vzorků
Vzorek/
Činidlo
Dextrin Fruktóza Glukóza Laktóza Ribóza Sacharóza Škrob
Slepý
vz.
Neznámý
vz.
Rozpustnost
Thymol
Molisch
Nitrochrom
Lugol
Fehling
Tollens
Selivan
Urea
Bafoed
Bial