HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE LITERATURA J, Throek Watson 0, David Sptirkmau introduction to Mass Spectrometry Edrnoncf de Hoflmůrin and Vincent Str Mass >pectrometn Principles and Applications Sfcoml Edition Electrospray and MALDI Mass Spectrometry FundantBntalS, liKtfunmntallM Ptaciitaliiies, and Bmlonicai Applications HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MS - mimořádně citlivá metoda, - destruktivní metoda, - minimální spotřeba vzorku, - určení MW a dalších strukturních informací. HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MUNI SCI HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE ■ 1922 F.W. Aston Izotopy MUNI SCI HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE ■ 1930 W. Paul Iontová past HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE ■ 1930 J.B. Fenn HISTORIE HMOTNOSTN SPEKTROMETRIE ■ 1930 K.Tanaka MALDI HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Milestones ( Foundational Steps Ionization Methods Applications and Separation Techniques Mass Analyzers SF Magnetic Sector 1918 Ne 20 and 22 < separated 1913 Crookes Tube 1870 Cyclotron 1931 ESI 1968 ICR 1949 GC MS 1952 MS/MS 1966 ESI used to ionize biomolecules 1984 IMS 1997 Ambient Ionization 2004 DOF 2011 1870 V A 1886 1912 1929 Canal Rays MS Born - Parabola EI Spectrograph Electron Discovered -^k ^ 1897 DF Magnetic Sector 1934 1946 TOF 1974 FTICR 1985 1999 MALDI Orbitrap ► QMS and QU 1953 ^ FAB SIMS 1981 1949 HISTORIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Historický vývoj MS - souhrn 100 let od katodové trubice k modernímu spektrometru _ • - : II f s PRVNÍ MS V ČR Konstrukce prvního hmotnostního spektrometru (1953) • V. Čermák, V. Hanuš, Č. Jech, J. Cabicar • Ústav fyzikální chemie a elektrochemie ČSAV Hmoicvy ipektwmetr Lhuvu tflĚUM chemie ČSAV IttpMMMMW >~* ..,—»*- .v---- ř- SEB1 k i-i'"t I i«ř mlnrt - 1 ■ 4< ■. í i . i-1, n - lnHn. rn *tiiÉkn f>10Q gas Ä . * • C ° •: •: • [M + H]+ [M + NH4]+ [M-H] ([M ± zH]z±) t a 200 - 650 °C UV záření * 10 eV průtok m. f. 0,2 - 2 ml/min Ionizace za atmosférického tlaku Dopant: toluen, benzen (citlivost Ť) MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONISATION (MALDI) Laser ü To Mass Analyzer Matrix ton AnalyteJMatrix M i Kt u re 8 e ■ho V I h/ c=n oh V Hi '(■III .i.>DHH MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONISATION (MALDI) DESORPČNÍ IONIZACE ELEKTROSPRAYEM (DESI) DESORPCNI IONIZACE ELEKTROSPRAYEM (DESI) H&E stained Nontumor human liver tissue Tumor 0 ~F-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 2 4 6 S 10 12 14 16 10 20 24 Lateral distance (mm) PŘÍMÁ IONIZACE V REÁLNÉM ČASE (DART) He* + M = M+ + He + e- PRIMA IONIZACE V REÁLNEM ČASE (DART) ZOBRAZOVACÍ MS (IMS) 3D IMS g) Bollenbeck et al. 2009 h) Seeley et al. 2014 i) Reindl et al. 2011 j) Oetjen et al. 2013 HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY • hmotnostní analyzátor slouží k dělení iontů v plynné fázi za vakua podle poměru ejich hmotnosti a náboje (m/z) • analyzátor je umístněn za iontovým zdrojem (tzn. molekuly již byly převedeny na ionty) a před detektorem (před detekcí musíme ionty rozdělit podle m/z) • dělení iontů v analyzátoru probíhá za vysokého vakua (ca. 10 3-1011 Pa, podle typu analyzátoru) • dělení iontů podle m/z lze dosáhnout na základě různých fyzikálních principu: 1/ zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém nebo elektrickém poli (magnetický nebo elektrostatický analyzátor) 21 různá stabilita oscilací iontu v dvoj- nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí (kvadrupól nebo iontová past) 3/ různá doba rychlosti letu iontů (analyzátor doby letu -TOF) 4/ různá frekvence harmonických oscilací v Orbitrapu 5/ různá absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli (iontová cyklotronová resonance - ICR) Podle způsoby dělení iontů: • skenující - postupně mění skenovanou veličinu (U, V, B) a propouští ionty o určité m/z (kvadrupólový analyzátor, sektorový magnetický analyzátor) • iontové pasti - zadržuje ionty pomocí napětí na elektrodách a následně je analyzuje (iontová past. orbitrap, FT-ICR) • průletový - měří čas iontů potřebný pro překonání určité vzdálenosti (TOF) • analyzátory pohyblivosti iontu - dělení iontů podle jejich velikosti a tvaru Základní parametry hmotnostních analyzátorů: • rozlišovací schopnost (rozlišení) - schopnost analyzátoru poskytnout rozlišené signály pro ionty s podobnou m/z • správnost určení m/z - míra schopnosti analyzátoru určit správnou hodnotu m/z • hmotnostní rozsah - rozsah m/z hodnot, přes který analyzátor muže zaznamenat spektra U|* dynamický rozsah - rozmezí koncentrací, v nichž je odezva (lineárně) závislá na (koncentraci ROZLIŠENÍ - RESOLVING POWER AJ definice založená na šířce jednoho píku (univerzální) - poměr hmotnosti iontu m a šířky tohoto iontu Am v polovině jeho výšky (Full Width at Haif Maximum, FWHM) 1 O-i 08- 0.6- 0.4- 0.2- 0.0 Max (50% Max = FWHM) 10% valley i / (5% of Max) Am ! '-1— ^1-' ■ I 1000.0 1001.0 1002.0 1003.0 Rozlišovací schopnost (Resolving power, RP): A/ RP = m/Am Príklad: paclitaxel C47H51N014 (Mw 853.3) 1 250 5 000 100 000 Nízké rozlišení vysoké rozlišení ROZLIŠENÍ - RESOLVING POWER PŘESNOST URČENÍ m/z MASS ACURRACY experimentálně naměřená hodnota m/z = 300.0463, teoreticky vypočtená hodnota m/z = 300.0473 Správnost určení m/z = -3.3 ppm (včetně znaménka! 300.0473 dle tabulek (nebo lépe s využitím softwaru) nejlépe odpovídá elementární složení C12H17N202Br, podle izotopů M:M+2 potvrzena přítomnost bromu MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR Zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém nebo elektrickém poli (magnetický nebo elektrický analyzátor). V poli dochází k zakřivení dráhy iontu závislé na hodnotě m/z (m/z je úměrné kvadrátu poloměru dráhy iontu r2). MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR KVÁDRU POL A IONTOVÁ PAST Různá stabilita oscilací iontů v dvoj-nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí (kvadrupól nebo iontová past). KVÁDRUPOL KVÁDRUPOL V daný okamžik jsou oscilace stabilní pouze pro určitou hodnotu m/z a tento ion projde kvádru pólovým analyzátorem, ionty s jinými hodnotami m/z mají nestabilní oscilace a jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu, změnou napětí postupně projdou etektor ionty se všemi hodnotami m/z. IKMt KVÁDRUPOL IONTOVÁ PAST ■ Trojrozměrná analogie kvadrupólu ■ Opakované selektivní vypuzení iontů podle hodnoty m/z z iontové pasti na detektor, ■ Možnost MSn analýzy. IONTOVÁ PAST (ION TRAP) Ring Electrode o o Entrance Endcap Exit Endcap ■— i , i ION TRAP (IT) vstupní uzavírací elektroda prstencová elektroda výstupní uzavírací elektroda ZACHYCOVANÍ r f VYPUZOVANI ION TRAP ION TRAP ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) Různá doba rychlosti letu iontů (analyzátor doby letu -TOF). Urychlené ionty se v oblasti bez pole pohybují různou rychlostí v závislosti na hodnotě m/z ("menší ionty se letí rychleji"). ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) 15-15-25 kV iorv iontů UNI SCI Letová trubice O Detektor O I J 1 ■ H UM* \ ilr ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) Různé absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli. riuui SCI IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) I excitace ^®nü Rf\ 1) I nr. before r *\ il.ihnn They are in their natural i yr Intn i radius within the II .1 r| ri r-1i -. field. Z\ Ions during excitation with a radio frequency. This excites the ions to a larger cyclotron radius. RtOn 3) Ions after excitation. The cyclotron radius remains in its larger state. MS)—v —1 ^ No Rf\ detekce Electrode 1 Electrode 2 a. Rl F>crilotion b. Detected Time Domain Image Current c. FourierTransform I- d. Resulting Mass Domain Spectrum' Time Timr IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) O Trapping plate (+ve) X X X = H (into page) Trapping plate (+ve) MUNI SCI IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) S 10 IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ RESONANCE (ICR) ORBITRAP separátory iontu - ORBITRAP s Fourierovou transformací ORBITRAP Typické parametry hmotnostních analyzátorů • typické parametry LC/MS hmotnostních analyzátoru Hmotnostní analyzátor Rozlišovací schopnost [*103] Správnost [ppm] m/z rozsah (horní limit) [*103] Rychlost [Hz] Lineární dynamický rozsah Cena Q 3-5 nízká 2-3 2-10 105-106 nízká IT 4-20 nízká 4-6 2-10 104 -1 o5 střední TOF 10-60 1 -5 10-20 10-50 104 -1 o5 střední Orbitrap 100-240 1 -3 4 1-5 5*103 vyšší FT-ICR 750-2.500 0.3-1 4-10 0.5-2 104 vysoká • rozdělení hmotnostních analyzátorů Rozlišovací schopnost (RP, FWHM) Správnost (MA, ppm) nízká <10.000 >5 vysoká 10.000- 100.000 <5 ultravysoká >100.000 <1 Porovnání různých typů hmotnostních analyzátorů Analyzátor RP [*103, FWHM] m/z rozsah [*103] Sken. rychlost LC/ MS Vakuum [Pa] Ceua *106Kč Q (QqQ) 3-5 3-4 střední ■rir * ir 103 2-3 (4-6) IT 5-20 10-20 vysoká * * * 150 HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY U Magnetický sektorový analyzátor Kvadrupólový analyzátor |» 3D a lineární iontová past Průletový analyzátor Orbitrap Iontová cyklotronová rezonance Analyzátor pohyblivosti iontu Hybridní hmotnostní spektrometry Ol I I IMS IT-TOF Orbit r»p DETEKTORY ELEKTRONOVÝ NÁSOBIČ IONTY DOPADAJÍCÍ NA POVRCH ELEKTRODY ZNÍ VYRAZÍ e-, DÁLE ZESÍLENY SYSTÉMEM DYNOD AŽ 108KRÁT, ŽIVOTNOST 1 -2 ROKY ELEKTRONOVÝ NÁSOBIČ IONTY DOPADAJÍCÍ NA POVRCH ELEKTRODY ZNÍ VYRAZÍ e-, DÁLE ZESÍLENY SYSTÉMEM DYNOD AŽ 108KRÁT, ŽIVOTNOST 1-2 ROKY FOTONÁSOBIČ IONTY DOPADAJÍ NA FOSFOROVOU DESTIČKU, CIMZ UVOLNÍ ENERGII VE FORMĚ FOTONU, ZESÍLEN SYSTÉMEM KONVERZNÍCH DYNODAŽ 105KRÁT, DELŠÍ ŽIVOTNOST VAKUOVÝ SYSTÉM VAKUOVÝ SYSTÉM vzorek Iontový zdroj Hmotn. analyzátor Detektor (vakuum); vakuum 103až 1010 Pa Hmotnostní analyzátor vždy pracuje za vysokého vakua, hodnota vakua se liší podle typu analyzátoru ca. 10"3 až 10"10 Pa • kromě ionizačních technik pracujících za atmosférického tlaku (ESI, APCI, APPI) musí být za vakua i iontový zdroj • PROČ tak vysoké vakuum? ionty musí mít dostatečně dlouhou střední dráhu a nesmí docházet ke kolizním srážkám s neutrálními atomy K získání tak vysokých hodnot vakua je obvykle potřeba dvou nebo i více (FT-ICR) stupňové čerpání velmi výkonnými vakuovými pumpami ■ -1. stupeň čerpání - rotační pumpy (výkon 80 l/s) ■ - 2. stupeň čerpání - turbomolekulární nebo difúzni pumpy (výkon 250 l/s) ROTAČNÍ OLEJOVÉ VÝVEVY DIFUZNÍ A TURBOPUMPY turbomolekulární pumpa MS" Kolizní eil er git 1)Ionizace B 2)Izolace MS/MS iontu Al 3) Fragmentace F2 O A F3 Fl Kolizní energie 4) Izolace 5) Fragmentace F5 Fl MUÍJ] F4 MS3 4-»Fl MS" U C P T V prostoru Gas Mutterion N, oder Ar Tochterion Ionen (Probe) Ol Quadrupol-Analysator 02 Stoßkammer (RF-Modus) Q3 Quadrupol-Analysator Detektor V čase Injpction Isolation o f orprurwr ior f ragmen tation Scanning oul TripleQ QTOF MS SPEKTRUM hmotnostní spektrum - osa y = relativní intenzita v %, osa x = poměr Ihmotnosti a náboje (m/z), ve většině případu je náboj roven jedné (kromě ESI) a potom hodnota na ose x odpovídá přímo hmotnosti iontu I 100-1 13 l I > dl 0Ĺ 50- H20 1 l 1 i mrz 20 100- 16 1 50" CH, Trn mrz 20 100-1 27 OJ c OJ CH 50- nvi 20 HCN 100-, T"1 ; sod > CO 16 28 J I 1^1 I MIM nKř 20 40 r—r~| MS SPEKTRUM ľ normalizace spekter - hmotnostní spektra jsou obvykle uváděna v Inormalizovaném tvaru, tzn. nejintenzivnějšímu píku spektra je přiřazena |relativní intenzita 100% a intenzity ostatních píku se dopočítají; kromě grafické Formy lze spektrum uvést i v tabelární formě (přesně uvedené intenzity, ale Iméně přehledné pro interpretaci) 100n 13 •s, C i) > o; a: 50- H20 nVZ 20 100-1 16 c = v 50 - CH mrz 20 100 n 50 H 27 HCN mři 20 m-1 50- CO 16 28 1 I ' I ' I I I ' m/z 20 40 MS SPEKTRUM 587.50 £8s5d 33B.5D / \J 5£c 536 ce7 j38 £69 590 587 50 565.50 £33 £0 B £8B 53 505 53G 5Q7 58B 509 590 spektrum profilové histogram MS KALIBRACE • externí kalibrace - kalibrace a vlastní měření není ve stejný okamžik, nejdříve kalibrace a pak měření (nebo naopak), což někdy může způsobit určitý posun m/z - obecně poskytuje mírně horší výsledky oproti interní kalibraci, aleje menší riziko hmotnostních interferencí analytu s kalibrantem • interní kalibrace - kalibrant i analyt jsou do iontového zdroje přivedeny ve stejný okamžik a ve spektru pozorujeme jak analyt tak i kalibrant - poskytuje nejpřesnější výsledky, ale hrozí riziko hmotnostních interferencí (tzn. analyt a kalibrant nesmí mít příliš blízké hmotnosti, aby je daný typ analyzátor dokázal spolehlivě rozlišit, pokud by se píky analytu a kalibrantu ovlivnily, pak vzniká chyba) - "lock mass" kalibrace - založena na kontinuální kalibraci na vybraný ion pozadí o známém složení nebo sprejování standardu druhým sprejem Inlet Analyzátor MALDI destička Direct Insertion (Infussion) Probe Iontový zdroj Iontový separator Detektor GC H PLC CE vakuum DIRECT INFUSION DIRECT PROBE U Mounting Flange Isolation Valve Rough Valve Line to Vacuum Pump Probe Shaft (1/4" dia) Probe Handle Indexed Guide Rods Probe Mount with Lock Release GC/MS > První chromatograíická metoda spojená s MS . malý průtok nosného plynu - kompatibilní s MS > Instrumentace . iontové zdroje: El, Cl . analyzátory: Q, IT r Analyty: . méně polární, termálně stabilní, s nízkou molekulovou hmotností r Široce využívaná technika . analýza složitých směsí (např. environmentálni a forenzní analýzy) • možnost prohledávat databáze MS spekter - rychlá identifikace látek HPLC/MS ^ Spojení HPLC později • odpaření - velký objem plynu = technický problém • řešení - API zdroje (APCI, APPI, ESI) > Instrumentace • iontové zdroje: APCI, APPI, ESI • analyzátory: Q, IT, orbítrap, TOF > Analyty: • od malých molekul po biopolymery • od málo polárních po iontové • omezeně kompatibilní MF s pufry a iont-párovými činidly • analýza potravin, léčiv, proteomika, atd. > Rychle se rozšiřující oblast MS CE/MS > Zatím málo rozšířená r~ Výhody • velmi vysoká separační účinnost • analýza iontů • nízká spotřeba vzorku > Technické problémy • ovlivňování separačního napětí a napětí zdroje • malá kompatibilita separačních pufrů s MS > Analyty • analýza peptidů, identifikace proteinů MS DETEKCE Režimy snímání dat: MS experiment Full SCAN (Total Ion Current TIC) cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z Rekonstruovaný chromatogram (RIC) * z TICu se vybere požadovaný ion a vykreslí se chromatografický záznam Selected Ion Monitoring (SIM) * cyklicky se snímají jen vybrané ionty citlivější než TIC režim napr. u kvadrupolu detegované absolutní množství anály tu činí: -> TIC řádově ng (10~9g) SIM řádověpg (10~12g) až fg (i(r15g) Product Ion Scan: Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce Instrumentace: Tripple Quad: Q-ToF (MS2); Ion Trap (až MS10) s vyšším MSn klesá citlivost! Precursor Ion Scan: Q1:TIC (m/z1 - m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Instrumentace: nelze na Ion Trap Constant Neutral Loss Scan: Q1:TIC (m/z1 - m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC ((m/z^ AN) - (m/z2-AN)) detekce; AN - rozdíl hmotností iontů - hmotnost odpadající neutrální částice z fontu Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap Selective Reacrion Monitoring (SRM): Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon) Precursor ion i scanning 1 ( I 1 I« Scanning Fixed m/z U sc (c) Neutral loss scanning (d) Multiple ion monitoring : Scanning ! 8 : Scanning Time C5 .<=> Fixed Fixed Time Identifikace sloučenin Sumární vzorec - téměř absolutně při dostatečně vysokém rozlišení Identifikace struktury - v závislosti na typu ionizace (možnost fragmentace) Identifikace porovnáním spekter - identifikace sloučeniny na základě tvorby a poměru četností iontu o určitých hodnotách m/z (knihovny) Kvantifikace sloučenin Univerzální - citlivost se liší podle schopnosti sloučenin poskytovat za daných podmínek ionty KVANTITATIVNÍ MS • výhodou je vysoká selektivita (pro MS/MS experimenty) a citlivost • je třeba vyvarovat se potlačení odezvy konkurenční ionizací (další látky, matrice) • důležitá je volba standardu, nezbytné je použití vnitřního (interního) standardu pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu, použití vnějšího standardu není vhodné a většinou je nepřijatelné KVANTITATIVNÍ MS • nejpřesnější postup je pomocí izotopicky značeného standardu analytu • izotopicky značený standard obsahuje atomy s těžšími izotopy, které způsobují posun m/z ve spektru a tím odlišení signálu od neznačené látky - látky mají stejné chemicko-fyzikální vlastnosti - nejčastěji deuterace (2D), 13C, 15N - doporučený posun alespoň +3 jednotky m/z - vysoká cena izotopicky značených standardů