BIOCHEMICKÉ METODY LITERATURA Understanding Bioanalytical Chemistry Principles and Applications Bioanalytical Chemistry S V S A A' R . M IKK E I. S E X EDUARDO CORTON bioanalytical LITERATURA Anzenbacher, Kovář: Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986. Kolektiv autorů - katedra biochemie, Univerzita Palackého Olomouc: Laboratorní technika ■ skripta. Olomouc 2021. https://www.prf.upol. cz/katedra-biochemie/studium/predmety-vyucovane-katedrou-biochemie/kbclabt/ Ing. Jiří Henych, Ph.D. (UJEP) Instrumentální metody - Studijní opora pro kombinované bakalářské studium https://chemistry. ujep. cz/userfiles/files/lnstrumentalni_metody. pdf NI I SEPARACÍMí METODY Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody SEPARACE Analytické kvantitativní Preparativní Charakterizace - pl, MW, spektra, AMK ... MU N I SCI PROBLÉMY SE VZORKEM • Komplexnost • Malá množství • Labilita MUNI SCI ZÁSADY PRACE S BIOLOGICKÝM MATERIÁLEM 1. 2. 3. 4. 5. 6. Teplota pH + iontová síla Koncentrace Pěnění Lokální přebytky Proteasy, RNAsy, DNAsy U [JI SCI SEPARACE BÍLKOVIN LITERATURA SCI É:iln!ty At mimin. BurjBS * Uwrif P Djuiidiff l/i' jbert K. Scope s Principles and Practic J 1 1 Third Edition 1 *W> . i 5n PLÁNOVÁNÍ SEPARACE CIL IZOLACE Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota i Závěr: získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí VOLBA VSTUPNÍHO MATERIÁLU Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot VOLBA A KOMBINACE SEPARAČNÍCH METOD Selektivita • Rozlišovací schopnost • Kapacita • Zpětný výtěžek • Náklady - materiál, přístroje, člověk • Stupeň zřeďování a koncentrace Slučitelnost mezi metodami Znalosti o dané bílkovině (pl, MW) ZÁKLADNI ZÁSADY Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením —» velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná —» ve vzorku již investovaná práce Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími Metody nepoužívat opakovaně sledovaní průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Prečistení Výtěžek extrakt 100 100 1 i f i 100 % HIC 50 99 1.99 1.99 99% IEX 25 75 3 1.5 75% 1 r MUÍJl SCI STANOVENI KONCENTRACE BÍLKOVINY ^^^^^^^^ na základě tických vlastno KJELDAHLOVA METODA - STANOVENÍ N2 • Mineralizace vzorku - převedení organického N na NH4+ • Stanovení NH4+- titrace, fotometrie, selektivní elektrody flUÍJl SCI KJELDAHLOVA METODA - UV SPEKTROFOTOMETRE 280 nm - aromatické AM K (Try, Ty r) interference nukleotidů ■ 180 - 230 nm - peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace uui 20 10 Trp \ / Tyr Piu 200 220 240 260 280 300 320 Vlnová délka (nm) UV SPEKTROFOTOMETR!E Vzorce pro přímé UV stanovení: (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)] UV SPEKTROFOTOMETRE Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e: Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M^.cm1) VIS SPEKTROFOTOMETRE ■ Přídavek činidla -» barevný derivát ■ Destruktivní metoda ■ Nutná kalibrační závislost o -I-,-,-,-,-,-,-,-,-1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 konc. proteinu [ug/ml] Princip : BIURETOVA METODA Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby U [JI SCI cu2- Měření: 540 - 560 nm 310 nm FOLINOVA METODA Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř MUÍJl SCI Tyrosin (Tyr;Y) LOWRYHO METODA Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření: 600 nm NI i LOWRYHO METODA METODA DLE BRADFORDOVE Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. SCI METODA DLE BRADFORDOVÉ <3» + O^iOK) Basic and Aromalic S ce Chams Nj03S so,- Coomassie 6-250 U SCI # Ami - 595 nm oc,Hs 465 nm Protein-Dye Complex BCA METODA Na+ sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu+tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+ 562 nm COOH COOH BCA METODA STEP 1. Protein ♦ Cu** 0H~. Cu1* step 2. Cu'*+2BCA sc •ooc ooc coo coo FLUORESCENCE Princip : vazba fluoroforu na bílkovinu -> měření vzniklé fluorescence (OPA) Měření: exc. 340 nm em. 440 nm - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny MUÍJl SCI NEJČASTĚJI POUŽÍVANE METODY Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová 0.5-5 okamžitý vývoj Lowryho 0.05 - 0.5 pomalý vývoj UV - 280 nm 0.05 - 2 interference UV - 205 nm 0.01 - 0.05 interference Bradfordové 0.01 - 0.05 sorpce barviva MUÍJl SCI NEJČASTĚJI POUŽÍVANE METODY Stanovení Citlivost Přesnost Interference Biuret 0 - 1 mg Vysoká, nezávislá na aminokyselinovém složení Aminoskupiny [Např. (NH4)2S04] 1 Low ry 0-0.1 mg Částečně závislá na aminokyselinovém složení Kyseliny, chelátory (EDTA), reduktanty (DTT, phenol), 1 (NH4)2S04 Bradford 0-0.01 mg Závislá na aminokyselinovém složení Detergenty (SDS, Triton X100, mýdlo) BCA 0 - 0.05 mg Většinou nezávislá na aminokyselinovém složení Redukující látky (2-merkaptoethanol, 1 DTT), chelátory 1 (EDTA) POLAROGRAFIE nncip : Brdičkova reakce - SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě -» proud OBECNE SCHEMA Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace VSTUPNÍ MATERIÁL MIKROORGANISMY Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody U [JI SCI lze jej snadno získat v dostatečné množství selekce mutantů o požadovaných vlastnostech termofilní organismy, psychrofilní organismy genetické inženýrství MIKROORGANISMY Czech Collection of Microorganisms CCM uchovává více než 3000 kmenů bakterií (asi 1 400 druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur. Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy). I I SELEKCE OPTIMÁLNÍCH PRODUCENTŮ maximální produkce enzymu optimální vlastnosti enzymu snadné získání producenta snadnost purifikačního postupu BEZOBRATLÍ Hmyz (Drosophila melanogaster), Háďátko obecné (Caenorhabditis elegans) plzi, mlzi Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává ŽIVOČIŠNÉ TKANÉ ■ Laboratorní zvířata - myši ( Mus musculus), potkan (Rattus norvegicus, Wistar albino rat), králíci ■ Jateční zvířata - orgány, krev ■ Člověk - tělní tekutiny ROSTLINNÉ TKANÉ špenát, řepa, hrách, tabák viržinský (Nicotiana tabacum), Nicotiana benthamiana), huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) Nevýhoda - problematický růst za MANIPULACE S BIOLOGICKÝM MATERIÁLEM Pokud možno zpracovat co nejdříve ROZBITI A EXTRAKCE Způsoby dezintegrace: ■ Mechanicky (fyzikálně) ■ Chemicky ■ Enzymaticky BAKTERIE GRAM-NEGATIVE GRAM-POSITIVE BAKTERIE Záleží na lokalizaci ■ extracelulární ■ intracelulární > cytoplasma > periplazma extracelulární cytoplasma Gram Positive Bacteria Gram Negative Bacteria Cytoplasm Plasma membrane Preiplasmic space - Peptldoglycan Outer membrane asma MECHANICKÁ DEZINTEGRACE Princip -jemné skleněné kuličky (Balotina) přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchány - nutno chladit FRENCH (X) PRESS Princip UIJI SCI - zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk T Mechanical Press ULTRAZVUK Princip - ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly - nutno chladit LYSOZYM + OSMOTICKÝ ŠOK (MÍRNÝ OSMOTICKÝ ŠOK) Princip - lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H20 - bakterie popraskají U [JI SCI KVASINKY Yeast Cell Wall *- Mannopnotein ^p-Gluan *-p-Glutan + Chitin <- Mannopnotein — Membrane SCI KVASINKY Toluenová autolýza Princip - toluen extrahuje při 35-40 °C fosfolipidy buněčné stěny -» osmotický šok -» enzymová autolýza Balotina, French press, NI i živočišné tkané Třecí miska s pískem Ruční homogenizatory - Potter - Elvehjemův U [JI SCI ŽIVOČIŠNÉ TKANÉ • Bez buněčné stěny Velmi křehké • Tkáňové kultury U l\l I SCI Microfilaments Lysoson Peroxisome Anatomy of the Animal Cell Mitochondria Cent rio les Micro Tubules Golgi Apparatus I Cilia Rough Endoplasmic jjUaL. Reticulum Tfif\/^ Nucleus Nuclear Pores Plasma -Membrane Nucleolus Nuclear Envelope Chromatin Smooth Endoplasmic Reticulum Ribosomes Rough Endoplasmic Reticulum Figure 1 ŽIVOČIŠNÉ TKANÉ Mixery Osmotická lyse - erytrocyty Hypertonic Isotonic Hypotonie SCI ROSTLINNÉ TKÁNĚ • Silná buněčná stěna - celulosa ROSTLINNÉ TKÁNĚ Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony - melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny OPTIMALIZACE EXTRAKCE • Teplota - 4 - 6 °C chlazení • pH - optimální pro danou bílkovinu - práce v pufrech • I - v prostředí o definované iontové síle • Přídavky látek - EDTA, (3-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas m u NI SCI INHIBITORY PROTEAS General inhibitors for Cysteine proteases F-64 Protease Serine Inhibitor proteases Aprntiiiin Pefabloc SC and Pefabloc SC PLU Leupeptin (Inhibits serine and cysteine proteases with trypsin-like specific. PMS Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets cf mplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets a7-Macro£lobulin Metallo-proteases Phosphor» inklon Bestatin (ami no peptidases) Aspartic proteases PepMatin Inhibitors included in the set Specihcrty of inhibition Quantity Supplied Antipain-dihydrochloride Papain. Trypsin. Calhepsin A and ]\ 3 mg Aprotinin Tripsin, Plasmiri, Chviitoli ypsin. Kiillikivin 0.5 mg Bestatin Amino peptidases 0.5 mg Chymostatin a-. 3-, y-. o-Chymotrypsin 1 mg E-64 CvMfiiR- Pi ul eases 3 mg EDTA-Na7 Metalloproteases 10 mg Leupeptin Serine and Cysteine Proteases surh as Plasmin. Trypsin, Papain. Calhepsln B 0.5 mg Pefabloc SC Serine Protl—H 20 mg Pepstatin Aspartic Proteases 0.5 mg Phos phoramidon Mctalloprnteinases. sperltirally Thermolysin 3 mg SEPARACE SUBCELULARNICH ORGANEL Organela Tíhové zrychlení Čas Eukar.buňky 1 000 g 5' Jádra, chloroplasty 4 000 g 10' Mitochondrie, bakterie 15 000 g 20' Lysozomy, membrány 30 000 g 30' Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém 100 000 g 60' roírr SCI ENZYMY - MARKERY Organela Enzym Cytoplasma LDH Endoplazmatické retikulum Glukosa-6-fosfatasa Goldiho systém galaktosyltransferasa Peroxisom katalasa Lysozom Kyselá fosfatasa Mitochondrie in cytochromoxidasa Mitochondrie out monoaminoxidasa U [JI SCI MEMBRÁNOVÉ VAZANE BÍLKOVINY I integrální eieKirostatic ansmemoranove 1 single and multiple pass peripheral IZOLACE MEMBRÁNOVÝCH BÍLKOVIN • Chemicky - detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, Fyzikálně - homogenizace, sonikace • Enzymaŕ/c/cy-fosfolipasy, lipasy, proteasy MUÍJl SCI DETERGENTY micelle MUNI SCI DETERGENTY Detergent CMC m M MMW Da koncentrace odstranění aplikace ANIOGENNÍ GDG(dodecyl3ulfát sodný) 8,3 288.4 > 10 mg/mg prot denaturace proteinů, použití pro DNA, PAG E DOG(deoxycholát sodný) 1-4 416,6 0,1-10 mg membr lipidů solubilizace membránových proteinů N-lauroylsarkosin 7 488 0,1 -1,5 % solubilizace membr. prot., příprava antigénu KATIOGENNÍ CTAB (hexadecyltrimethyl amonium bromide) 4-5 337 0,1 - 1 % ??? rozpouští membrány, tvoří komplex s DNA. odstranění polysacharidu NEIONOGENNÍ Triton X-100 [octyl phenol po ly( ethy len g ryco lether)J 0.2 647 n=10 1 - 5 m M :,» solubilizace proteinů Tween 20 [poty(oxyethylene),, soroitan-monolaurate] 0.06 > 10 mg/mg membr. lipid; imunobloty, ELISA AMFOTERNÍ CHAPQ (3-[{3-chol am idop ropyljdimetnytam monio]-1 -propanesulfonate) 4 614,9 6,5-13 mM z- -•Ť. - solubilizace membránových proteinů DETERGENTY Examples of Detergents and Their Properties Name Structure CMC N (MW) Nonideť (N) P-40 sodium dodecyl sulfate (SDS) sulfobetaine (SB12) n-octylglucoside deoxycholate H,C- ^ // n = 9-11 o-(CH2CH2o)n— h 0.3 mM 3.6 mM 14.5 mM 20 mM 100-155 (647) )62 (288) 55 (336) 20-25 (292) 3-12 (417)