CENTRIFUGACE LITERATURA ologicaL Cen tri fuga ti Basics ■ tHVhVwlNW* Preparative Centrifuga tíon A Practical Ajipmach PURIFIKAČNÍ STRATEGIE mu t 03 O •*-> w >b Finální přečištění Zisk finálnítoproduktu ve vysokércistbtě ČÁSTEČNÉ PŘEČIŠTĚNÍ odstranění hlavních nečistot Zakoncentrování Izolace, koncentrace, tabilizace PŘÍPRAVA, EXTRAKCE, ODUŠENÍ Počet kroků analýzy SEPARAČNÍ METODY A Separace založené na velikosti molekul Dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová permeační chromatografie, SDS-PAGE B Separace založené na rozdílech v rozpustnosti Izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly C Separace založené na základě povrchového náboje Elektroforetické metody, iontově výměnná matografie, afinitní chromatografie m u li I SCI CENTRIFUGACE Urychlit sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí. Na sedimentaci má vliv 1. vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. vlastnost prostředí (rozpouštědla): hustota, viskozita n u r j SCI CENTRIFUGACE 20. léta 20. století - Svedberg - počátky laboratorních centrifug a analytické centrifugace; teoretické základy metody 50. léta - Brakke - centrifugace v gradientu hustoty THEODOR SVEDBERG (1884-1971) u íji SCI Nobelova cena za chemii 1926 pojmenována po něm Svedbergova jednotka pro vyjádření sedimentačního koeficientu centrifugace - použití PREPARATIVNÍ ANALYTICKÉ ■ Odstranění hrubých částic z roztoku Sediment (pelet) X supernatant ■ Izolace organel nebo biomakromolekul ■ Stanovení základních parametrů - MW, hustota, sedimentační koeficient rozdělení centrifug otáčky g g - &>2.r rad 1 co- úhlová rychlost (rad/s) f - otáčky/min muni SCI otacky g NOMOGRAM PRO PREPOCET RPM NA RCF 25.000 20.000 15.000 —= TO,OCX) —— 6.000 —= 4.000 3.000 2.000 —— I.OOO POO —— 30.000 =— 20,000 =— 1 O.OOO — 5.000 m— 2,000 = 1 .OOO - * =—200 —100 =— 50 m— 20 =—10 Nomogram is based on formula below, where : RCF = relative centrifugal lorce (g) RPM = centrifuge speed in revolutions per minute Radius = distance in mm from center of centrifuge spindle to bottom of Am icon device when in rotor RCF III18 x 10') (Radius in mm) = RPM 500 475 450 425 ■ Nutno připravit gradient CsCI } Gradient vzniká během centrifugac gradientova centrifugace gradientova centrifugace gradientova centrifugace Rate-zonal centrifugation Sample gradientova centrifugace diferenciální versus gradientova centrifugace ■oiirc,.- Emin Filtered LNuclm homogenito ntin řůurw: 2h Po..1 nu 4> 'Mitochondria '■Plaema '-Biboscjmal SoJubrt? chloroplasts, membrane, mtyim, parlkfl iysnsome$H mtoromnfll small of and fraction poiylbo- cytoplasm! peroxisomes tfragmflnlji nf gomes Icytosoll endoplasmic mticuluml, and large IA -C C 303 In 3 1 Organella J fraction Jill Lysosomos fl,12fl/Cin3|\ lil 1.19 Mimofinrii1n.il — e_ J Peroxisomes / 4 Before After zonální rotor 5 3c mi Tl -lí. j Umožňuje centrifugaci velkých objemů vzorků zonální rotor 332676 Push-Pull Capping Mechanism 011519 O-ring Inside Cap(Not Visible) 012780 O-ring (Visible) ROTOR LII> u T 332682 Cone 815472 O-ring 332691 Seal Fitting 011167 O-ring tor Fitting (Not Visible) 333856 Rotor Core 858506 O-ring 328948 Non-Extrusion Ring 328945 Rotor Gasket ROTOR BOWL centrifugace se zonálním rotorem centrifugace se zonálním rotorem centrifugace se zonálním rotorem Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru NO 700 I Ml I o Si ío m co so eo Ťt> Bílkoviny + RNA 2,5 S DNA 26-35 S agregáty DNA 27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pufr pH 7,0 Cushion - 50 ml 42% sach. Overlay - 100 ml pufru Plnění - 2 000 ot/min Dělení - 40 000 ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml analytická ultracentrifugace Ctaem Listy JM, 1155-116,2 (2010) ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFVGA A JE JI VYCZITI V BIOCHEMICKÉ LABORATOŘI Referát Introduction to Analytical Ultracentrifugation BECKMAIM ONDŘEJ VANĚK** a KAREL BEZOUŠKAa,b J Karedra biochemie Piirodovědeckě Jakuln Univerzit} Kario\y v Praze. Hlen en a s, I2S 40 Praha 2, ^Mikrobiologickí- ústav A ľ ČR, \.vi.3 ndeňská 10S3, 142 20 Praha 4 kenavi useznam.cz, bezouska a biomed.cas.cz Došlo 15.7.10. přijato 26.8.10 Klíčová slova: analytická ultracentnfuea. sedimentační rychlost, sedimentační rovnováha. molekulová hmotnost, rovnovážná konstanta Obsah 1 Úvod 2. Historie anály octe ulrracentnfugy 3. Přistroj a jeho parametry 4. Přehled aplikaci 5. Sedimentační rvchlost 6. Sedimentační rovnováha 7. Anah-za sedimentačních dat S Přiklad)' analýz 9. Závěr L Úrod Cílem sedimentační analýzy prováděné pomoci analytické ultracentrcrugy je charakterizace sedimcntuucich částic z hlediska jejich molekulové hmotnosti, sedimentačního koeficientu a dalších hvdrod^iiamickych vlastnosti Ze sedimentačních dat lze získat odhad velikosti a tvaru částic, údaje o distribuci jednotlivých typů sedimentujicich částic ve vzorku a v neposlední řadě studovat rovnovážné systémy, včetně určeni príslušných rovnovážnych konstant Vztáhneme-h pojem sedimentujici Částice například na molekulu proteinu, je z výše uvedeného výčtu hlavních aplikací této metody zřejmé, že v oblasti výzkumu bio-makromolekul. především proteinů a nukleových kyselin, může mít sedimentační analýza ve Li: e uplatněni. Je to navíc jedna z nemnoha metod které umožňuji určit molekulovou hmotnost přímo, bez nutnosti kalibrace či interakce s matrici, a to přímo ve vodném prostředí (nejčastěji v pufřu) za fyziologických podmínek A tak přestože se jedná o metodu již bezmála sto let starou, nachází stále velké uplatněni nejen ve vede a \yzlTimu. ale i ve farmaceutickém průmyslu Cílem tohoto referátu je podat přehled o principech a praktických aplikacích sedimentační analýzy s důrazem na analýzu bioniakro molekul Tento referát je publikován ve zkrácené verzi, plnou verzi dvojnásobného rozsahu lze stáhnout ze stránek katedry biochemie UK PřF. hitu www nátur cínu cz chemie biochem služby. 2. Historie analytické uln aceuti i/usy His loni analytické ultracenrriruTV započal její konstruktér a obievrtel metoch- sedimentační analvzv Theodor Svedberg (1S&4-1971)1'Rodák ze švédského Fleräng. okres Gávleborg. se stal v roce 1904 studentem univerzity v Uppsale, která už také zůstala jeho hlavním celoživotním působištěm V letech 1912-1949 zastával na této univerzite funkci profesora fyzikální chemie Svedberaova práce se tykala převážně koloidů a makromoLekulármch látek Spolu s četnými spolupracovníky studoval fyzikální vlastnosti koloidů. zejména jejich difúzi, absorpci světla a sedimentaci, což mu umožnilo potvrdit že termodynamické zákony plynů lze aplikovat také na disperzní systémy Pro studium sedimentace sestrojil analytickou ultracen1n.ru?u s niž sledoval sedimentaci velkých molekul (proteinů, sacharidů, polymerů) v roztoku a táto pozorováni uvedl do vztahu k molekulové velikosti a tvaru sedimentuj icich molekul. Ukázal tak. že molekuly daného čistého protemu maji všechny stejný tvar a že s využitím analytické ultra-cenrrifugv lze prokázat přítomnost kontaminujících látek Za práci na disperzních systémech mu byla roku 1926 udělena Nobelova cena za chemii 3. Přistroj a jeho parametry Vzhledem k tomu. že již přes padesát let se vývoji a výrobě analytické ultracentnfusy věnuje zejména firma Beckman Coulter. vyčet technologických možností metody je omezen na popis současného typu analytické ultra-c entnfugy ProteomeL ab XL-A/XL -1 tohoto výi obce Z hlediska odstředivé sily Lze dosahovat tíhového pole v rozmezí přibližné 60 až 300 000 * g (mm rychlost 1000 ot mm"1, max rychlost 60 000 ot m"1) Molekulové hmotnosn částic, které tak lze pomoci analytické centrifugy studovat se pohybuji približné v rozsahu 100 Da až 10 GDa Sedimentaci bio makromolekul lze sledovat pomoci dvou nezávislých optických systémů, absotbančm (XL-A) i interferenční optiky (XL-D. Abscrbančni opuka sestává ze zábleskové xenónové lampy, mo noc hro matom (200—S00 tun), pohyblivé štěrbiny a fotonásobiče V klasickém uspořádáni je vzorek umístěn do kyvety se dvěma sektor}*. Do jednoho je umístěn analyzovaný' vzorek, druhý sektor obsahuje kontrolní vzorek, zpravidla pufi. v němž je vzorek rozpuštěn, resp. do něhož je převe- 1155 analytická ultracentrifugace Ví í 11 oi Light path ----------Q-, Detector \ U It race nt r if uge Rotor Amioľc d chamber UV Light source Rotor Balance Cell Air Ei o Li« cíti r y Solvent Motor Sample Cell "Vacuum pump Schleirin Optics (schematic) Sample Cell goes here Cent rifu gal force analytická ultracentrifuga optický systém OPTICKÝ SYSTÉM Boundary co2 r OPTICKÝ SYSTÉM • Absorbční optický systém ■ UV-VIS od 200 do 800 nm detekce makromolekul obsahujících silný chromofor • Rayleighův interferenční optický systém ■ měří změny indexu lomu analýza makromolekul neobsahujících silný chromofor (např.polysacharidů) nebo vzorků obsahujících v pufru silně absorbující látky (např.ATP/GTP, DTT oxidovaný) optický systém a A d '-/ Solvent meniscus Boundary region * Plateau / Sample \ L/meniscus r Radius Zkřížená optika Interferenční optika Fotografický systém Absorbční systém analytická ultracentrifugace metoda sedimentační rovnováhy -t—f to C (D Diffusion Sedimentation Cell radius metoda sedimentační rovnováhy metoda sedimentační rovnováhy ♦ Termodynamické informace (závisí na Mr) ♦ Experimentálně lze stanovit: Relativní molekulovou hmotnost - sacharosa Mr (Mr = 360) až po viry (Mr = mnoho milionů) Stav molekul v roztoku - asociace Rovnovážné konstanty v roztoku, K -> výpočet volné energie asociačních reakcí metoda sedimentační rychlosti metoda sedimentační rychlosti sed. koeficient, S 72 metoda sedimentační rychlosti ♦ Hydrodynamické parametry (závisí na Mr a tvaru molekuly) ♦ Experimentálně lze stanovit: • Sedimentační koeficient s • Difúzni konstantu D nebo frikční faktor f • Relativní molekulovou hmotnost Mr • Tvar molekuly v roztoku