Biotechnologické procesy
Dnes o živočišných buňkách, potažmo pak o skupině živočišných buněk,
kterým říkáme kmenové buňky
Blok II.
Vladimír Rotrekl @ 2020
Biotechnologické procesy: Živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky:
Sylabus
1) Úvod do živočišných buněk a jejich specifik, potence a diferenciace, Hayflickuv limit, imortalizované linie, kultivace a
jejich diferenciace (včetně large scale, GMP a industry grade)
2) Použití živočišných buněk k výrobě léčiv, použití živočišných, potažmo kmenových buněk ve screeningu a výrobě
léčiv
3) Živočišné buňky a buněčná terapie, kde končí transplantace a začíná biotechnologie, metody, příklady, požadavky
SUKL/EMA na jejich výrobu a použití
4) Speciální aplikace a výhled do budoucna (3D kultivace, Organoidy, 3D tisk buněk, in vitro tvorba náhražek tkání a
orgánů, genová )
Vladimír Rotrekl @ 2020
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Živé vakcíny Oslabený mikrob/virus spalničky, příušnice, zarděnky, žlutá zimnice
Inaktivované Mrtvý mikrob/virus cholera, žloutenka A, obrna, vzteklina
Podjednotková Část mikroba/viru žloutenka B, černý kašel, COVID-19(spike protein)
Konjugovaná antigen konjugovaný s polysacharidy chřipka
Toxoidová inaktivovaný toxin tetanus, záškrt
DNA/RNA (transfekce) DNA/RNA do buněk organizmu DNA: zvířata (chřipka, herpes, HIV); RNA: CONV19
Rekombinantní (transfekce) vektoru do tkáňové kultury HIV, vzteklina, spalničky,
chřipka – hemaglutinin v bakuloviru (FDA approved)
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
V případě virů je třeba
hostitel k amplifikaci – často
tkáňová kultura
Živé vakcíny Oslabený mikrob/virus spalničky, příušnice, zarděnky, žlutá zimnice
Inaktivované Mrtvý mikrob/virus cholera, žloutenka A, obrna, vzteklina
Podjednotková Část mikroba/viru žloutenka B, černý kašel, COVID-19 (př. Astra Zeneca)
Konjugovaná antigen konjugovaný s polysacharidy chřipka
Toxoidová inaktivovaný toxin tetanus, záškrt
DNA/RNA (transfekce) DNA/RNA do buněk organizmu DNA: zvířata (chřipka, herpes, HIV); RNA: CONV19
Rekombinantní (transfekce) vektoru do tkáňové kultury HIV, vzteklina, spalničky,
chřipka – hemaglutinin v bakuloviru (FDA approved)
Inaktivace
Teplem
Ionizujícím zářením
Chemicky (formaldehyd)
v jiném organizmu:
Oslabení (genetické selekcí)
Tkáňové kultury (jiný druh)
Oplodněná vejce
Živá zvířata
Historicky nejrozšířenější, ale
problematické
- Nebezpečné (hlavně
imunokompromitovaným)
- Musíme mít kulturu/zvíře, kde se
virus množí
- Musí jít bezpečně inaktivovat
Náhodné procesy
- mnohdy obtížně
reprodukovatelné
- Poslední dobou kombinované s
editací virového genomu
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
V případě virů je třeba
hostitel k amplifikaci – často
tkáňová kultura
Živé vakcíny Oslabený mikrob/virus
Inaktivované Mrtvý mikrob/virus
Užití živočišné buněčné kultury při produkci vakcíny:
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
• Oslabení a selekce avirulentního kmene viru
• Amplifikace viru v susceptibilním buněčném typu
Užití živočišné buněčné kultury při produkci vakcíny:
• Oslabení a selekce avirulentního kmene viru
Virulentní
virus
Živočišná tkáňová
kultura
~ 40 pasáží (snížená teplota)
✓ ve zvířecích buňkách (ne lidských – jiný, suboptimální hostitel)
✓ Alternativa k použití zvířat jako suboptimálního hostitele
✓ Poslední dobou kombinováno s genetickou úpravou genomu viru
Avirulentní
virus
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Užití živočišné buněčné kultury při produkci vakcíny:
• Oslabení a selekce avirulentního kmene viru
Virulentní
virus
Živočišná tkáňová
kultura
~ 40 pasáží (snížená teplota)
✓ ve zvířecích buňkách (ne lidských – jiný, suboptimální hostitel)
✓ Alternativa k použití zvířat jako suboptimálního hostitele
✓ Poslední dobou kombinováno s genetickou úpravou genomu viru
Avirulentní
virus
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Kmen 17D ŽLUTÉ ZIMNICE
byl oslaben pasážováním v
myších a následně v
kuřecích embryích
POLIOVIRUS obrny byl
oslaben pasážováním v
buněčné kultuře z opičích
ledvin
VIRUS PŘÍUŠNIC v kultuře
fibroblastů z kuřecího
embrya
Užití živočišné buněčné kultury při produkci vakcíny:
• Oslabení a selekce avirulentního kmene viru
• Amplifikace viru v susceptibilním buněčném typu
(jednodušší škálování oproti užití např. slepičích
vajec)
VAQTA – kultivována na
buněčné kultuře
lidských MRC-5 buněk
Zaočkování
virem
Živočišná tkáňová
kultura Kultivace Sběr
Purifikace
centrifugací,
ultracentrifugací
a filtrací
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
VAQTA:
vakcina proti hepatitidě A
MRC-5:
Primokultura fibroblastů z
(potraceného) 14 týdenního
kavkazského chlapce
Živočišná tkáňová
kultura
Zaočkování
avirulentním
virem
Kultivace Sběr
Purifikace
centrifugací,
ultracentrifugací
a filtrací
Průmyslový proces výroby vakcíny
VAQT – kultivována na
buněčné kultuře
lidských MRC-5 buněk
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
K dispozici několik oslabených
variant Příklad (často) používaného Morbiliviru
– virus spalniček
Díky plasticitě viru spalniček můžeme do jeho genomu (RNA virus) naklonovat (povrchové) peptidy jiných virů. Při
zachování pravidla šesti, lze virus silně modifikovat a použít jej jako nosič antigenu jiného viru a použít jej k vakcinaci
proti jiným virovým onemocněním.
Morbilivirus
Pravidlo šesti: celkový počet
nukleotidů v RNA genomu
některých Paramyxovirů je
dělitelný 6...
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
DNA/RNA peptid
(směsi peptidů)
(např. CoNV19 6 peptidů)
Klonování do genomu oslabeného kmene
(například oslabený kmen morbilliviru - spalniček)
Amplifikace viru v susceptibilní tkáňové kultuře
(např. lidské fibroblasty MRC5)
Izolát viru = vakcína (1.Fáze klinického testování)
Příklad tvorby anti-CoNV19 vakcíny
Launay a kol., Pasteur Institute, source: ClinicalTrials.gov
Tkáňová kultura fibroblastů
MRC-5
Linie odvozená z plicního epitelu 14 týdenního
plodu (těhotenství ukončené ze zdravotních
důvodů)
Morbilivirus
K dispozici několik oslabených
variant
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
DNA/RNA peptid
(směsi peptidů)
(např. CoNV19 6 peptidů)
Klonování do genomu oslabeného kmene
(například oslabený kmen morbilliviru - spalniček)
Amplifikace viru v susceptibilní tkáňové kultuře
(např. lidské fibroblasty MRC5)
Izolát viru = vakcína (1.Fáze klinického testování)
Příklad tvorby anti-CoNV19 vakcíny
Launay a kol., Pasteur Institute, source: ClinicalTrials.gov
Tkáňová kultura fibroblastů
MRC-5
Linie odvozená z plicního epitelu 14 týdenního
plodu (těhotenství ukončené ze zdravotních
důvodů)
Morbilivirus
K dispozici několik oslabených
variant
PŘÍKLAD:
rekombinantí inaktivovaný virus pravých neštovic
Cílená mutageneza viru
(virus defektní ve virulentních genech
Ale množící se v tkáňové kultuře)
Linie 4647 (fibroblasty)
Odvozené z ledvin
kočkodana - vervet monkey
48 hodin
1) Ultrazvuková dezintegrace
2) Centrifugace
3) 4 000g
4) 30 000g
Odstraní
Fragmenty buněk
Virus
Yakubitkiy a kol., Acta Naturae, 2015
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
infekce
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Obrázek: adaptováno z Wiki
Příklad vakcín odvozených od viru spalniček v
klinickém testování (2020)
Biotechnologie: využití živočišné
tkáňové kultury k amplifikaci antigenu
(oslabeného modifikovaného viru),
určeného k imunizaci pacientů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Antigen (např. protein) injikován do krve (opakovaně)
B-Buňky sleziny Myelomová linie
Buněčná fůze
hybridomy
Selekce hybridomů
a ředění na jednotlivé klony
Izolace
monoklonálních
protilátek z
jednotlivých klonů
hybridomů
Obrázek: adaptováno z Wiki
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Splenocyt Myelomové buňky
(stejný druh/kmen)
50% PEG
DMEM
Hybridomové buňky v tkáňové kultůře
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Antigen (např. protein) injikován do krve (opakovaně)
B-Buňky sleziny Myelomová linie
Buněčná fůze
hybridomy
Selekce hybridomů
a ředění na jednotlivé klony
Izolace
monoklonálních
protilátek z
jednotlivých klonů
hybridomů
Obrázek: adaptováno z Wiki
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Hybridomové buňky v tkáňové kultůře
Selekce klonů hybridomů..
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Příklady použití monoklonálních protilátek
Klinické aplikace monoklonálních protilátek
- protinádorová léčba (anti-TNFa, anti-VEGF)
- protijed bakteriálních toxinů (antrax)
- astma (anti-IgE)
atd.
Laboratorní aplikace monoklonálních protilátek
- imunodetekce
(westernův přenos, imunohistochemické barvení atd.)
- imunoprecipitace
- blokování funkčních domén proteinů
https://www.uptodate.com/contents/overview-of-therapeutic-monoclonal-antibodies
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánůNapř. blokování vazebných domén
Fibulinu 3 - extracelulární matrice (u
glioblastomu)
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Př.: Heterogenita N-glykozylace
rekombinantního interferonu-g
Na glykozylaci záleží:
• Biologická aktivita
• Imunogenicita
Fortin a kol., BioProcess Intl., 2018
Glykozylace záleží na:
• Organizmu
• Buněčném typu
• Fyziologických podmínkách
Song a kol., X-Mol, 2020
Bezpečnostní konsekvence
rozdílné glykozilace
Interferon-g: Léčba
autoimunitních poruch,
osteoporózy atd..
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Expresní systémy používané k produkci glykoproteinů
Příklad: Epoetin delta (DYNEPO®)
– Rekombinantní erythropoetin připravený v lidské tkáňové kultuře
- Vyšší míra homogenní glykosylace, než erythropoetin z buněk křečka (CHO - Chinese Hamster Ovary)
-Výsledek: Vyšší účinnost a obtížněji zjistitelný antidopingovým testem!!!
Lalonde a kol., J Biotechnology, 2017
Někdy je možné využít „humanized yeast“ nebo hmyzí buněčné linie)
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Buněčná transplantace
7. Tkáňové inženýrství
8. Výroba organoidů a orgánů
Příklad produkce růstového hormonu v CHO buňkách
Lalonde a kol., J Biotechnology, 2017Anton a kol., Cell Technology for Cell Products, 2007
Děti s nedostatečným růstem
Turnerův syndrom
Dsytrofičtí pacienti s AIDS
N-glykosilace prodlužuje
halflife v krvi…
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv/Toxikologické studie
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Knihovny malých molekul … dostupné jako kolekce tisíců látek na mikrotitračních destičkách
umožňují rychlý skríning tisíců látek v reálném čase
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Knihovny malých molekul … dostupné jako kolekce tisíců látek na mikrotitračních destičkách
umožňují rychlý skríning tisíců látek v reálném čase
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Známe tisíce chorob….
…a máme k dispozici stovky tisíc chemických sloučenin…
Testování účinků smogu (1956)
Jak ale testovat účinky tak velkého množství látek?
Jak ale testovat účinky tak velkého množství látek?
… když jen jedna látka – atropin – stála život nejen polovinu vojska Marka Antonia
… než jsme se ji naučili používat
Potřebujeme model…
Potřebujeme model…
Nevýhody zvířecích modelů:
- Mnohdy chybí relevance k lidským chorobám
- Není možné testovat rozsáhlé knihovny sloučenin
Potřebujeme model…
… buněčný model!
… buněčné modely:
• Nedostatečné množství z biopsií
• Omezené množství buněčných typů lze kultivovat in vitro
• Délka kultivace je omezena
Primokultury (primární tkáňové kultury)
… buněčné modely:
• Rakovinné linie
• Kmenové buňky a odvozené buněčné typy..
… buněčné modely:
• Rakovinné linie
• Kmenové buňky a odvozené buněčné typy..
Použití ve farmakologii a toxikologii
aibolita.com
Tisíce látek
Jednotky kandidátních molekul
… buněčné modely: rakovinné linie
Výhody:
Onemocnění na buněčné úrovni
Imortalizované linie
Nevýhody:
Velká diverzita v mechanizmu
onemocnění
Genomová nestabilita a s tím
spojená nestálost modelu
Celkem vzorků doposud …. 1010 (z toho 1010 celých genomů)
Analyzovaných genů …. 23699
Identifikovaných mutací …. 1141626
Z toho jedinečných variant …. 1021175
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Celkem vzorků doposud …. 1010 (z toho 1010 celých genomů)
Analyzovaných genů …. 23699
Identifikovaných mutací …. 1141626
Z toho jedinečných variant …. 1021175
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Pokud známe mutaci, můžeme přiřadit mechanizmus konkrétní účinné látce
2024: POKRYTO 621 SLOUČENIN NA 1000 BUNĚČNÝCH LINIÍ CÍLÍCÍCH 24 DRAH
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
130 látek v klinickém a preklinickém testováníNěkolik set rakovinných linií
Identifikace nových cílových molekul protinádorové terapie..
Garnet a kol., Nature 2012
Identifikován biomarker typický pro Ewingův sarkom responzivní na inhibitory PARP
Garnet a kol., Nature 2012
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Identifikace nových cílových molekul protinádorové terapie..
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Embryonální kmenové buňky
+ konzistentní genetické pozadí
+ “čistota“ genetické manipulace
- nutnost použití řízené manipulace genomu
- absence polygenních faktorů
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Bhartiya D. (ed.) Pluripotent Stem Cells, 2013
Reprogramace
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Diferenciace in vitro
fibroblasts cardiomyocytes neurons
Indukované pluripotentní kmenové buňky
mají obrovský potenciál pro medicínu - tzv. patient-specific cells
Využití tkáňových kultur odvozených
diferenciací kmenových buněk:
• Poznání mechanizmů patologie v
daném buněčném typu
• Skreening možných léčiv na cílovém
buněčném typu
• Buněčná transplantační medicína
• Skrínování léčiv
Rowe, 2019, Nature Rev Genet
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
• Skrínování léčiv
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
- Robustní a rychlá skríningová metoda k výběru
„lead compound“
- Až klinický kandidát („target compound“) může
být skrínován na
primokultuře/organoidech/zvířatech…
Image by Boghog, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Syndrom náhlé srdeční smrti (často u „zdravých sportovců“)
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
o Incidence: neznámá/odhad 1:10 000
o obtížně získatelná skupina pacientů
o Nemožný zisk biopsií
o Omezené možnosti diagnostiky
o Omezené možnosti post mortem analýzyElektrokardiogram pacientky s CPVT (40 let)
- Předpoklad:
- nestabilní vazba RyR a
calstabinu
- Únik kalcia ze
sarkoplazmatického
retikula
- Pomohly by stabilizátory
RyR?
Chceme je testovat na
srdečních buňkách!!!
hiPSC
Srdeční buňky
B-adrenergic receptor
cAMP
RyR
PKA
RyR
P
P P
Ca2+
calstabin
SR
Ca2+
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Syndrom náhlé srdeční smrti (často u „zdravých sportovců“)
Mutace RyR:
destabilizace
pomalý únik Ca2+
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
Clinical candidate – S107 (Rycals)
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
… aneb jak dostat srdeční
buňky z pacienta, který nám
je dát nemůže..
α-actininp-cTnI
Model lidského srdce na kultivační misce
Srdeční buňkyEmbryonální tělíska
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
Analýza pomocí mikroskopu atomárních sil
Mechanické vlastnosti:
Acimovic et al. 2018 J Clinical MedicinePribyl, CEITEC Nanobio Core
Biosenzor s 3D tkáňovou kulturou
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
Mechanické vlastnosti:
Acimovic et al. 2018 J Clinical Medicine
Fluorescenční
mikroskopie
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
Mechanické vlastnosti:
Acimovic et al. 2018 J Clinical Medicine
Sloučenina S107 stabilizovala vápníkový
kanál – fenotyp podobný zdravým
srdečním buňkám
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Možnosti: porovnánání více iPSC z pacientů nesoucích
stejnou mutaci se stejně širokou skupinou kontrolní
,nebo…….
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Cílená inverze mutace u iPSC z pacienta…
Modely chorob vyjma rakovin….
Cílená inverze mutace u iPSC z pacienta…
http://www.ctm-basel.ch/
Nejčastěji využívané
Programovatelné místně
řízené nukleázy
- Zinc-Finger nukleázy)
- Taleny
- CRISPR/Cas
Hemofilie A – nejčastější příčina je inverze části genu koagulačního faktoru 8
Park, CY, PNAS, 2014
Bonus: Stejným párem TALENů lze opravit mutaci v iPSC z pacienta – otevírá
cestu genové/buněčné terapie
Park, CY, PNAS, 2014
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Embryonální kmenové buňky
+ konzistentní genetické pozadí
+ “čistota“ genetické manipulace
- nutnost použití řízené manipulace genomu
- absence polygenních faktorů
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv / Toxikologické studie
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Primární kultury
Prasečí/kravská játra
Buňky z rybích žaber
atd.
Imortalizované linie
Buněčné linie odvozené
z hepatomu
např. HepG2
(Lidské) heaptocyty z kmenových
buněk
Nutná diferenciace, ale poskytují
informaci o vývojové toxicitě a
regeneraci jater
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
Toxikologie léčiv – využívá tkáňové kultury podobné cílové tkáni/buněčnému typu k testování účinku/toxicity léku
Enviromentální toxikologie – často vyžaduje biotransformaci, proto využívá jaterní buňky
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
Imortalizovaná linie
Např. odvozená z
hepatolecularního
karcinomu
Buněčné typy
diferencované z
kmenových buněk
Funkční analýza toxicity:
např. analýza integrity DNA (genotoxické látky)
„analýza komet“:
Např. HepG2
Biotransformace v savčích/lidských buňkách
Aszalos, 1977, Antibiotics
Daunomycin Daunomycinol
Klatrát s DNA
Zaražená replikační vidlice DNA
Dvojřetězcový zlom DNA
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
Daunomycin
Analýza komet = analýza zlomů DNA
CYTOTOXIC!!!
Léčba
akutní
myeloidní
leukémie
Biotransformace v savčích/lidských buňkách
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
Daunomycin
Analýza komet = analýza zlomů DNA
Primokultura z jater Hepatomová linie HepG2
ALE né vždy se chová linie stejně, jako buňky v těle
50mM DNM
Kontrolní jádro
Analýza komet
Wilkening, 2003, Drug metabolism and Dispossition
Vývojová toxikologie – užití hepatocytů
diferencovaných z kmenových buněk
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
Raška, 2018, Toxicological Scinces
Toxin uvolňvaný sinicemi ve vodách v ČR
• Malý efekt na dospělou jaterní buňku
• Velký na jaterní progenitory – HNF4a
- vývoj plodu
- regenerace jater
cylindrospermopsin
Detekce kontaminantů ve vodě biosenzorem s buněčnou kulturou
Tan, 2017, Curr Opinions in Biotechnology
Toxikologické využití živočišných tkáňových kultur
+ Změna signálu v případě apoptózy, nekrózy,
diferenciace, anoikis či senescence
- Omezená schopnost rozlišit jednotlivé kontaminanty
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv / Toxikologické studie
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Biotechnologie zahrnující kultury živočišných buněk
Aplikace živočišných tkáňových kultur
Příště…
Děkuji za pozornost..
Vladimír Rotrekl
vrotrekl@med.muni.cz