Mgr. Kateřina Dadáková, Ph.D.1
Rostlinné biotechnologie
2
Biotechnologie
Moderní rostlinné
biotechnologie
zahrnují především
rostlinné tkáňové
kultury a genové
inženýrství.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-381466-
1.00009-2
3
Rostlinné explantáty
̶ Ne příliš malý kus mladé zdravé
tkáně odebrané ideálně na jaře
̶ Výběr vhodného explantátu
̶ Pro množení postranní pupen
̶ Pro přípravu kalusové kultury
nejčastěji děložní lístek nebo
hypokotyl
̶ Pro izolaci protoplastů list
ISBN-13: 978-0124159204
4
Tkáňové kultury
̶ První úspěšně kultivovaná
byla nediferencovaná
meristematická tkáň
̶ Kultury odvozené z
rostlinných nádorů
̶ Po objevu hormonů i
(částečně) diferencované
kalusové kultury
http://www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.104.900160
5
Buněčné suspenzní kultury
̶ Vznikají rozsuspendováním kousků
kalusu v živném médiu
̶ Média obsahují zdroj uhlíku, dusičnany a
amonné ionty, další soli obsahující
všechny potřebné prvky, vitaminy a
hormony
̶ Nejčastější média: Murashige and Skoog,
Gamborg, Nitsch and Nitsch
6
Využití rostlinných kultur v primárním
výzkumu
̶ Studium primárního i
sekundárního metabolismu
̶ Izolace organel
̶ Studium morfogeneze,
organogeneze a
embryogeneze
̶ Studium interakcí rostlin a
mikrobů https://doi.org/10.1105/tpc.113.116053
7
Využití rostlinných kultur pro
mikropropagaci (množení in vitro)
̶ Zkrácení cyklu, vysoký
množitelský koeficient,
možnost načasování,
dobrý zdravotní stav
̶ Náročné na energie,
nutnost aklimatizace
8
Využití rostlinných kultur pro skladování a
převoz
̶ Uchování genofondu
rostlin
̶ Příprava rostlinného
materiálu neobsahujícího
mikroorganismy
(především viry)
Retno Mastuti: Plant Physiology
9
Využití rostlinných kultur pro tvorbu
produktů
̶ Rostlinné sekundární
metabolity s využitím ve
farmacii nebo průmyslu
̶ Komerčně ve velkoobjemových
reaktorech
̶ Využití vysoce výnosných
kmenů/mutantů nebo stimulace
DOI: 10.3109/07388551.2014.923986
10
Selekce s využitím markerů
̶ Místo sledování fenotypu
sledujeme při šlechtění přímo
požadované geny nebo obecně
sekvence spojené s daným
znakem (markery)
̶ Vhodné pro fenotypové znaky
kódované malým počtem genů
(rezistence k patogenům)
http://www.knowledgebank.irri.org/
11
Využití rostlinných kultur pro genetickou
modifikaci rostlin
̶ Genetické transformace
buněk, tkání a orgánů
̶ Produkce cisgenních a
transgenních rostlin s
rekombinantní DNA
12
Genetické modifikace rostlin
̶ Bakteriální geny kódující
proteiny rezistence (insekticidní
proteiny, enzymy degradující
herbicidy) vložené do DNA
plodin
̶ Využití RNA interference expresí
fragmentů viru hostitelskou
rostlinou
13
Technologické přístupy
̶ Tzv. gene gun (DNA navázaná na
částice kovu)
̶ Transformace pomocí
agrobakterií (přirozeně schopné
přenášet genetický materiál)
̶ CRISPR/Cas (využití
bakteriálního antivirového
systému)
0
50
100
150
200
250
300
2004
2006
2008
2010
2012
2014
2016
2018
2020
2022
Početpublikací
Agrobacterium
Crispr
Gene Gun
14
Gene gun
̶ Izolace požadovaného genu ze
zdrojového organismu, sestavení
funkčního konstruktu (promotor, gen,
markerové geny atp.)
̶ Inkorporace konstruktu do vhodného
plazmidu
̶ Pokrytí kovových (zlato, wolfram) částic
plazmidem
15
Gene gun
̶ Částice urychlené stlačeným
vzduchem pronikají buněčnou
stěnou i plasmatickou membránou
buněk (obvykle kalus)
̶ Selekce transformovaných buněk,
regenerace rostlin
https://istudy.pk
16
Transformace pomocí agrobakterií
̶ Agrobacterium tumefaciens je fytopatogenní
bakterie (nádorová onemocnění)
̶ Ti plazmid obsahuje T-DNA, schopnou začlenit se
do genomu rostlin
17
DOI: 10.1016/JCOPBIO.2006.01.009
18
Transformace pomocí agrobakterií
̶ Umělé Ti plazmidy s
požadovaným genem a
markerovými geny jsou
namnoženy v E. coli a vloženy
do A. tumefaciens
̶ Infekce rostlinných buněk,
selekce, regenerace
19
Editace genomu
̶ Využívá nukleasy specifické pro
určité sekvence (např. CRISPR/Cas9)
̶ Změna konkrétního lokusu DNA –
knockout konkrétního genu nebo
začlenění transgenu
̶ První plodiny s editovaným genomem
se objevují na trhu v USA a v Kanadě
(řepka, sója) https://www.nap.edu
20
CRISPR/Cas
̶ CRISPR/Cas nejméně
komplikovaná (stejná nukleasa pro
editaci různých sekvencí)
̶ Výběr genu a návrh gRNA
̶ Klonování gRNA do vhodného
vektoru (obsahuje i sekvenci pro
Cas9)
̶ Vložení do cílové rostliny a selekce
https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00985
21
CRISPR/Cas
https://www.nap.edu
Tomáš Moravec
| 2. 10. 2017 | Vesmír 96, 576, 2017/10
22
̶ Přirozený regulační
mechanismus
eukaryotických buněk
̶ 2 dráhy RNAi: miRNA
(regulace exprese
vlastních rostlinných genů)
a siRNA (antivirová
obrana)
̶ dsRNA je meziproduktem
v replikaci většiny
rostlinných virů
RNA interference
23
RNA interference
̶ Rostlinné buňky mohou být
modifikovány k produkci části
dsRNA už před napadením
̶ dsRNA může být také vnesena
rekombinantním virem/bakterií,
vstříknuta do stonku/kmene
nebo absorbována kořenovým
systémem
̶ RNAi může být částečně funkční
i proti eukaryotickým patogenům
24
Genetické modifikace rostlin
25
Přínosy rostlinných biotechnologií
̶ Zvýšení produkce plodin
̶ Omezení použití pesticidů a
umělých hnojiv
̶ Zvýšení výživové hodnoty
potravin (vitaminy, minerály)
̶ Podpora ekonomiky chudých
zemí
26
Rizika rostlinných biotechnologií
̶ Ztráta biodiverzity (preference
monokulturního pěstování
vysoce výnosných odrůd,
migrace genů opylením
příbuzných druhů)
̶ Rozšíření geneticky
zvýhodněných invazivních druhů
̶ Zdravotní riziko (alergeny)
Další možnosti rostlinných biotechnologií...
̶ https://www.ted.com/talks/joanne_chory_how_supercharged_plants_could_slow_climate_change?utm_campa
ign=tedspread&utm_medium=referral&utm_source=tedcomshare