L ANALÝZA PROTEOMU A) PŘÍPRAVA VZORKU PRO HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII Mgr. Gabriela Lochmanová, PhD. 1. Odstranění SDS ze vzorku proteinů metodou SP3 2. In-gel digest 3. Obohacení fosfopeptidů Proteomický vzorek: proteiny extrahované ze zmraženého prášku Arabidopsis thaliana (listy drcené v kryomlýně za přítomnosti kapalného dusíku), solubilizované v SDT pufru (4% SDS; 0,1 M dithiotreitol; 0,1M Tris-HCl, pH 7,6) za teploty 95 °C po dobu 30 min. Protokoly pro solubilizaci a denaturaci proteinů často používají velmi účinný surfaktant dodecylsulfát sodný (SDS). Přítomnost SDS v lyzačních roztocích však může vést k potlačení MS signálu a snížení aktivity proteáz při digesci. Proto je třeba v určité fázi přípravy SDS ze vzorku eliminovat. Mezi relativně nové techniky odstranění SDS z proteinového vzorku patří SP3. 1.SP3 Metoda Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) je založena na neselektivním navázání proteinů na modifikované (např. karboxylované) paramagnetické částice (kuličky). Proteiny imobilizované na těchto částicích jsou za přítomnosti magnetu promyty a kontaminanty (např. SDS) tak odstraněny. Působením proteázy jsou proteiny specificky štěpeny na sadu peptidů. Digesce se provádí přímo na kuličkách. Trypsin štěpí protein za lysinem nebo argininem směrem k C-konci peptidu. Po separaci kuliček pomocí magnetu se MS analýza peptidů uvolněných do roztoku provádí už bez dalšího přečištění. Zpracovávané proteomické vzorky vždy označujte číslem skupiny. Vzorek (původní koncentrace 4,26 ug/ul) byl naředěn lx SDT pufrem na 3 ug/ul; uložen v mrazáku 117, krabička Cvičení Proteomika 2024) Promyté mag. kuličky a SOLu-T jsou v lednici ve 117 v polystyrénovém stojánku Cvičení proteomika 2022. Dále je připraveno: - předchlazený Bioruptor na 4 °C - malá vodní lázeň, plovák na l,5ml zkumavky (z digestoře ve 116) - 6x stojánek s pipetami a špičkami - stojánky na 2ml a 0,5ml zkumavky - magnetické stojánky - 45 um PTFE filtry - MilliQ voda - kádinka „WASTE" na tuhý odpad, lahvička „WASTE" na tekutý odpad - 100 % EtOH v l,5ml zkumavce- v lednici pro každou skupinu připraven alikvot lOOmM DTT, lOOmM IAA, 50mM AB - v lednici připraven zásobní roztok premytých paramagnetických kuliček a 0,1 ug/ul SoLu-trypsinu 1 vzorek C (ug/ul) objem pro SP3 AT 3,00 30 Lil SP3 9:15-11:00 Sonikace AT lyzátu v Bioruptoru (3x 100 ul v l,5ml zkumavkách): 5 cyklů (30 s ON / 30 s OFF) při 4 °C Alkylace: Ke 30 ul vzorku v 2ml zkumavce (V shape) přidat 7,5 ul lOOmM jodoacetamidu (finální koncentrace 20mM IAA). Inkubace 25 min, RT, 600 rpm, tma. Ukončení alkylace: Přidat 2 ul lOOmM DTT (finální koncentrace 5 mM) Ručně protřepat předem promyté magnetické kuličky ve zkumavce (ne vortex!). Ke vzorku přidat 30 uL kuliček (600 Lig), propipetovat. Vazba proteinů na kuličky: přidat 70 liL 100% etanolu (finální koncentrace 50% EtOH). Krátce propipetovat, inkubace 24 °C, 10 min, 1 000 rpm. Odseparovat kuličky na magnetickém stojánku - 2 min, RT. Odstranit roztok. Promytí (odstranění kontaminant): Vyndat vzorek z magnetického stojánku, přidat 140 ul 80% etanolu. Propipetovat. Odseparovat kuličky na magnetickém stojánku - 2 min, RT. Odstranit roztok. Promytí zopakovat ještě 3x. Přidat 140 Lil 80% etanolu. Propipetovat, přendat do nové 2ml zkumavky. Odseparovat kuličky na magnetickém stojánku - 2 min, RT, odstranit veškerý roztok a pokračovat s digescí. Digesce: Vyndat vzorek z magnetického stojánku, přidat 20 ul 0,1 ug/ul SOLu-T v 50mM AB. Přidat 40 ul 50mM AB. Nepropipetovávat! Vzorky sonikovat 30 s ve vodní lázni. 11:00-15:00 Inkubace 4 h, 37 °C, 1000 rpm v termomixéru. 15:00-15:30 Odebrání peptidů: Odseparovat kuličky na magnetickém stojánku - 2 min, RT. Odebrat roztok s peptidy do 0,5ml zkumavky. Vyndat zkumavku z magnetického stojánku, promýt kuličky 60 ul 50mM AB, propipetovat. Odseparovat kuličky na magnetickém stojánku - 2 min, RT. Roztok s peptidy přidat do 0,5ml zkumavky. Odstranit zbylé kuličky pomocí PTFE filtru (45 Lim), centrifugace 600 g (minispin). Z celkového objemu vzorku (cca 120 ul) odebrat do 0.5 ml zkumavek alikvot 1/6 pro celoproteomovou analýzu - „ID", 5/6 dát vysušit ve vakuovém koncentrátoru pro následné obohacení na fosfopeptidy - „Ph". Následující den dokončit přípravu vzorku pro LC-MS/MS (kyselá extrakce). 2 2. In-gel digest Obarvené proužky vybraných proteinů jsou nejprve vyříznuty z gelů připravených 1-D elektroforézou. Vyříznuté kousky gelu s proteiny jsou odbarveny střídavým promýváním v acetonitrilu a roztoku hydrogenuhličitanu amonného. Ke vzorkům je přidána proteáza (obvykle trypsin). Působením proteázy jsou proteiny specificky štěpeny na sadu peptidů. Soubor takto vzniklých peptidů je specifický pro daný protein (tzv. peptidová mapa). Po ukončení inkubace jsou peptidy extrahovány oky seleným vodným roztokem acetonitrilu. Vstupní vzorek = ID gel předem připravený technikem. Předem připravené zásobní roztoky: MilliQ voda (MQ); 50mM hydrogenuhličitan amonný (AB); acetonitril (ACN); 50mM hydrogenuhličitan amonný/acetonitril v poměru 1:1 (AB/ACN); SoLu-T 5 ng/ul; Dále je připraveno: - obrázek gelu (12% SDS-PAGE) společně s molekulovým žebříčkem - skalpel - stojánky na 2ml a 0,5ml zkumavky - malá vodní lázeň, vymražovací destička na 0,5ml zkumavky (+ stojánek a víčko ze starého termomixéru) - 6x stojánek s pipetami a špičkami - MilliQ voda - kádinka „WASTE" na tuhý odpad, lahvička „WASTE" na tekutý odpad - 100 % ACN v 0,5ml zkumavce- v lednici pro každou skupinu připraven alikvot 50mM AB - v lednici připraven zásobní roztok 0,1 ug/ul SoLu-trypsinu Zkrácená in-gel digesce 11:00-11:30 Vyříznout proužek z gelu, přenést do 0,5ml zkumavky, promýt lOOul MQ - 2x lOmin v termomixéru, RT, 750 rpm. 11:30-12:30 OBED 13:30 Proužek promýt 100 ul AB/ACN - 15 min v termomixéru, RT, 750 rpm, odsát. Proužek promýt 50 ul ACN - 5 min v termomixéru, RT, 750 rpm, odsát. Promytí gelu: K proužku přidat 20 ul AB, do vymražovací destičky, sonikátor 5 min. Neodsávat! Přidat 20 ul ACN, sonikátor 5 min, odsát. Přidat 20 ul ACN, sonikátor 5 min, odsát. Vysušit ve vakuovém koncentrátoru - 5 min. 14:45 Digesce: Ke gelu přidat 25 ul 5 ng/ul SoLu-T v 50mM AB, inkubace 4 °C, 45 min. Inkubace v termomixéru 40 °C, 2 h. Následující den dokončit přípravu vzorku pro LC-MS/MS (kyselá extrakce). 3 Ukončení přípravy vzorků pro LC-MS/MS Vstupní vzorek =1) digest z SP3 kuliček, 2) in-gel digest Předem připravené zásobní roztoky: MilliQ voda (MQ); acetonitril (ACN); 5% kys. mravenčí (FA) Dále je připraveno: - stojánky na 0,5ml a 2ml zkumavky - vymražovací destička na 0,5ml zkumavky (+ stojánek a víčko ze starého termomixéru)- malá centrifuga - 6x stojánek s pipetami a špičkami Ukončení přípravy vzorku pro LC-MS/MS 9:00 In-gel digest - odpipetovat volný roztok do 0,5ml zkumavky a ke gelu přidat extrakční roztok 25 ul 5% FA + 25 ul 100% ACN (gel musí být ponořený), 5min sonikace ve vodní lázni ve vymražené destičce. Roztok přidat do 0,5ml zkumavky. - Ke gelu přidat 100 ul 100% ACN, 10 s vortex, roztok přidat do 0,5ml zkumavky. - Zakoncentrovat ve vakuovém koncentrátoru na objem <= 30 ul. Vzorek připraven pro MALDFTOF MS. Digest z SP3 kuliček vzorek „ID" přenést do LC-zkumavky, provést kyselou extrakci: - Zkumavku od vzorku propláchnout 25 ul 5% FA + 25 ul 100% ACN, 10 s vortex, přidat do LC-zkumavky. - Zkumavku od vzorku propláchnout 100 ul 100% ACN, 10 s vortex, přidat do LC-zkumavky. - Zakoncentrovat ve vakuovém koncentrátoru na objem <= 15 ul. Vzorek připraven pro LC-MS/MS.. 9:15 Zakoncentrování vzorků. 10:30 Nanesení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy. 4 3. Obohacení fosfopeptidů Afinitní obohacení fosfopeptidů z proteinové směsi bude provedeno kitem High-Select ™ Ti02 Phosphopeptide Enrichment Kit (Termofisher Scientific). Obohacení je založeno na selektivní vazbě negativně nabitých fosfátových skupin peptidů na oxid kovu. Jedná se o tzv. Metal Oxide Affinity Chromatography (MOAC). Eluce z MOAC probíhá uvolněním negativně nabitého fosfátu alkalickým pufrem. Vstupní vzorek = přečištěná a vysušená peptidová směs získaná po SP3. Dále je připraveno: - stojánky na 2ml zkumavky - malá centrifuga - 6x stojánek s pipetami a špičkami Obohacení fosfopeptidů 9:15 Peptidy rozpustit ve 150 ul Binding/Equilibration buffer. Příprava sorbentu: Vložit adaptér do 2ml zkumavky, do něj TÍO2 Spin Tip. Přidat 20 ul Wash buffer, centrifugace 3000 g, 2 min. Přidat 20 ul Binding/Equilibration buffer, centrifugace 3000 g, 2 min. Odstranit "flowthrough". Zachovat zkumavku pro pozdější promývání. Vazba fosfopeptidů: TÍO2 Spin Tip s adaptérem přenést do nové 2ml zkumavky. Nanést 150 ul vzorku na sorbent. Centrifugace 1000 g, 5 min. Zopakovat nanesení vzorku na sorbent. Centrifugace 1000 g, 5 min. Promytí: TÍO2 Spin Tip s adaptérem přenést do "promývací" 2ml zkumavky. Promýt sorbent 20 ul Wash buffer. Centrifugace 3000 g, 2 min. Zopakovat promytí ještě 2x. Promýt sorbent 20 ul H2O. Centrifugace 3000 g, 2 min. 10:30 Eluce fosfopeptidů: Odstranit zbytkovou tekutinu z TÍO2 Spin Tip poklepáním na ubrousek a přenést i s adaptérem do nové 2ml zkumavky. Přidat 50 ul Phosphopeptide Elution buffer. Centrifugace 1000 g, 5 min. Zopakovat lx. Ihned vysušit eluát ve vakuovém koncentrátoru do finálního objemu 1-3 ul. Provést kyselou extrakci do LC-zkumavky (25 ul 5% FA + 25 ul 100% ACN, 10 s vortex), redukce objemu ve vakuovém koncentrátoru na 10 ul. Vzorek připraven pro LC-MS/MS. 5 B) HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE PROTEINŮ Mgr. Ondrej Šedo, PhD. Po separaci 1-D elektroforézou bude pro identifikaci vybraných proteinů použita MALDI-TOF MS a MS/MS, pro identifikaci složek proteinových směsí bude využito separace peptidů kapalinovou chromatografií v on-line spojení s MS (LC-ESI-QTOF-MS/MS). Studenti se seznámí s metodou analýzy proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a budou samostatně identifikovat vybrané proteiny na základě srovnání získaných dat s proteinovými databázemi. Teoretický úvod MALDI-TOF MS Hmotnostní spektrometrie s desorpcí a ionizací za přítomnosti matrice a separací iontů v průletovém analyzátoru (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-of-flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) je v současné době jednou z nej rozšířenějších metod identifikace proteinů, resp. určení jejich primární struktury. V našem případě budou použity metody založené na srovnání molekulových hmotností peptidů vzniklých proteolýzou analyzovaného proteinu (peptide mapping, peptide mass fingerprinting) a molekulových hmotností fragmentů vzniklých rozpadem získaných peptidů přímo v hmotnostním analyzátoru (MS/MS - tandem mass spectrometry, MS/MS-ion search) s proteinovými databázemi. Extrakt peptidů získaný in-gel digescí je smíchán s MALDI matricí, nanesen na vzorkovací desku a po krystalizaci je analyzován pomocí MALDI-TOF MS. Pro analýzu bude použit přístroj Ultraflextreme (Bruker, Brémy, Německo). Výsledkem hmotnostně spektrometrické analýzy jsou přesné molekulové relativní hmotnosti peptidů. Jejich soubor je pak srovnáván pomocí prohledávacích programů (např. MASCOT, MS Fit) s proteinovými databázemi, resp. s peptidovými mapami vytvořenými in silico počítačovým programem pro jednotlivé proteiny uložené ve zvolené databázi. Pro spolehlivou identifikaci je pak zapotřebí peptidy identifikovat poté, co je provedena jejich fragmentace v hmotnostním analyzátoru a detekovány jsou produkty jejich rozpadu (tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS). Získané signály jsou následně opět přiřazeny ke známým sekvencím teoretických proteolytických peptidů odvozených z dostupných proteinových databází. LC- MSMS Výhodou hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem je možnost on-line spojení s vhodnou separační technikou (HPLC, CE). V tomto případě bude identifikace proteinů založená na srovnání molekulové hmotností MS/MS fragmentů jednotlivých peptidů, které vznikly proteolýzou proteinů v analyzované směsi, s proteinovými databázemi. Směs peptidů získaných po SP3 a směs fosfopeptidů po afinitním obohacení bude separována na kapilární koloně kapalinového chromatografií Ultimate 3000 (Thermo). MS/MS analýza separovaných peptidů bude provedena na přístroji Impact II (Bruker, Brémy, Německo). Pro identifikaci jsou pak srovnávány soubory naměřených hmotností fragmentů jednotlivých peptidů pomocí prohledávacích programů (např. Mascot, Protein Prospector) s proteinovými databázemi. MALDI-TOF MS analýza 1. Příprava peptidového extraktu k analýze • matrice - nasycený roztok kyseliny alfa-kyano-4-hydroxyskoncové ve směsi acetonitrilu a 5% trifluoroctové kyseliny (1:1, v/v) Peptidový extrakt smícháme 1:4 s matricí a výsledný roztok (0,6 |il) naneseme na vzorkovací desku. Po zaschnutí je vzorek připraven k analýze. 2. Vlastní analýza Peptidy zanalyzujeme v reflektronovém pozitivním módu a za použití externí kalibrace na směs standardních peptidů. Vybrané ionty pak podrobíme izolaci iontovou branou a MS/MS analýzou stanovíme molekulové hmotnosti jejich fragmentů vzniklých rozpadem během průletu analyzátorem. LC-MSMS analýza 1. LC analýza - kapilární kolona s reversní fází C18 - mobilní fáze acetonitril/voda s přídavkem kyseliny mravenčí (0,1%), gradientova eluce 2. Vlastní analýza Ionty generované elektrosprejem jsou v opakovaných cyklech podrobovány MS analýze a vybrané ionty poté izolovány kvadrupólem, štěpeny v kolizní cele, a jejich fragmenty zanalyzovány v průletovém analyzátoru (MS/MS analýza). Identifikace proteinů Základy práce s databázemi Seznámíme se s nej důležitějšími zdroji dat a nástroji pro studium proteinů přístupných na Internetu. Použití si vyzkoušíme na několika praktických příkladech v počítačové učebně a studenti vypracují několik praktických úkolů. Typy zdrojů informací a nástrojů 1. Základní data - sekvence NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/') Entrez (http://www.nebi.nlm.nih. gov/Entrez/) Expasy (http://www.expasv.ch/) SwissProt (http://www.expasv.ch/sprot/) - struktura PDB (http://www.rcsb.org) 2. Nástroje - zobrazení struktury PDB Java Viewer Cn3D (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml) 7 Swiss Pdb Viewer (http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm) Chime (http://www.mdli.com/support/chime) - předpovídání struktury Swiss Model (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html) I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) - komplexní SwissProt Tools (http://www.expasy.ch/tools/) 3. Odvozená a speciální data - podobnosti mezi druhy COG (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) - domény PROSÍTE (http://www.expasy.ch/prosite/) - typy skládání SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/) - fosforylační místa PhosphoBase (http://phospho.elm.eu.org/) - hmotnostní spektra pro MALDI-TOF, 2-D gely, identifikace z gelu SwissProt 2-D PAGE (http://www.expasy.ch/ch2d/) ProteinProspector (http://prospector.ucsf.edu/) - nomenklatura enzymů SwissProt ENYZME (http://www.expasy.ch/enzyme/) Vyhodnocení MS a MS/MS dat (samostatná práce) Po seznámení s nej důležitějšími zdroji dat a nástroji pro studium proteinů přístupných na Internetu data získaná MALDI-MS, MALDI-MS/MS a LC-MS/MS analýzou (molekulové hmotnosti peptidů a jejich fragmentů) zadáme do prohledávacího programu Mascot (Matrix Science) s příslušnými parametry a identifikujeme dominantní proteiny z bandu a směsí připravených SP3 a po izolaci fosfopeptidů. Poznámka: LC-MS/MS analýza bude provedena z části demonstrační formou z časových a kapacitních důvodů. Studenti obdrží seznam molekulových hmotností peptidů a jejich fragmentů pro každý analyzovaný vzorek a vlastní identifikaci proteinů si každý student provede sám. 8 C8302 Základy proteomiky - cvičení PROTOKOL I. Jméno UCO Obor, ročník C. skupiny E-mail Datum Název úlohy ANALÝZA PROTEOMU A) PŘÍPRAVA VZORKU PRO HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII • Výstup z přípravy vzorku metodou SP3: 1) Vypočtěte potřebný objem roztoku 0,1 ug/ul trypsinu pro štěpení 30 ul proteinové směsi o koncentraci proteinů 3,0 mg/ml, bude-li poměr enzym : substrát = 1:45. trypsinu 2) Specifikujte použitou metodu MS analýzy: • Výstup z in-gel digesce: 1) přiložte obrázek naskenováného gelu popište žebříček proteinového standardu vyznačte na skenu protein, který byl vyřezán, enzymaticky naštěpen a analyzován MS odhadněte molekulovou hmotnost analyzovaného proteinu: .....................kDa 2) Specifikujte použitou metodu MS analýzy: ............................................. • Výstup z přípravy vzorku pro fosfoanalýzu: 1) Specifikujte použitou metodu MS analýzy: 9 b) hmotnostní spektrometrie proteinu • Analýza in-gel digestu 1) Identifikace dominantního proteinu peptidovým mapováním Název proteinu MASCOT skóre Molekulová hmotnost (kDa) Pokrytí sekvence (%) Odpovídá teoretická molekulová hmotnost pozici na gelu? 2) Sekvenace dominantního tryptického peptidu MS/MS Sekvence peptidu MASCOT skóre Název proteinu Odpovídá výsledek MS/MS analýzy výstupu peptidového mapování? • Analýza vzorku připraveného SP3 1) Identifikace proteinů - dominantní proteiny Název proteinu MASCOT skóre Molekulová hmotnost (kDa) Pokrytí sekvence (%) Kolik bylo identifikováno fosfopeptidů? 10 2) Prohledání s tolerancí chyb - projeden vybraný peptid z dominantního proteinu Sekvence peptidu Lokalizace a typ modifikace Pravděpodobná příčina modifikace • Analýza vzorku fosfopeptidů 1) Identifikace proteinů - dominantní proteiny Název proteinu MASCOT skóre Molekulová hmotnost (kDa) Počet fosforylací 2) Spolehlivost lokalizace fosforylace - pro jeden vybraný peptid Sekvence peptidu Pozice fosforylované aminokyseliny Pravděpodobnost lokalizace (%) 11 Hledání v databázi proteinů. Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. Jak najít námi hledaný protein v databázi? • European Bioinformatics Institute • Swiss Institute of Bioinformatics • Georgetown University 1. Bud" známe prvotní přístupové číslo: UniProtKB/Swiss-Prot entry P492351 Potom jdeme přímo do databáze http://www.expasy.ch/expasv ref.html a zadáme tam číslo. 2. Nebo známe název enzymu - to bývá nejčastější a potom musíme najít číslo proteinu: rostlinná beta-glukosidáza z kukuřice, glycosyl hydrolyse family 1, EC 3.2.1.21, P49235, BGLC_MAIZE. Potom doporučuji jít na webové stránky Prosit - http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/ * P-glucosidases (EC 3.2.1.21) from various bacteria such as Agrobacterium strain ATCC 21400, Bacillus polymyxa, and Caldocellum saccharolyticum. * Two plants (clover) P-glucosidases (EC 3.2.1.21). * Two different P-galactosidases (EC 3.2.1.23) from the archaebacteria Sulfolobus solfataricus (genes bgaS and lacS). * 6-phospho-P-galactosidases (EC 3.2.1.85) from various bacteria such as Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, and Staphylococcus aureus. * 6-phospho-P-glucosidases (EC 3.2.1.86) from Escherichia coli (genes bglB and ascB) and from Erwinia chrysanthemi (gene arbB). * Plants myrosinases (EC 3.2.1.147) (sinigrinase) (thioglucosidase). * Mammalian lactase-phlorizin hydrolase (LPH) (EC 3.2.1.108 / EC 3.2.1.62). LPH, an integral membrane glycoprotein, is the enzyme that splits lactose in the small intestine. LPH is a large protein of about 1900 residues which contains four tandem repeats of a domain of about 450 residues which is evolutionary related to the above glycosyl hydrolases. 3. Můžeme znát však pouze DNA sekvenci - potom doporučuji převést sekvenci do proteinové sekvence pomocí Translace a pak použít sekvenci bez stop kodonů. Tato sekvence se pak zadá do BLASTu hledání podobných sekvencí a to s velkou pravděpodobností Vám ukáže hned první odkaz, který by měl být Váš protein. Co vše můžeme zjistit z databází? Dalo by se říct, že vše. Hmotnost proteinu, isoelektrický bod, zda je monomer nebo vícemer, synonyma proteinu, genový název, odkazy na literaturu, funkci, katalytickou aktivitu, jak je protein regulován, biofyzikální vlastnosti, lokalizaci, tkáňovou specifiku, podobnost s jinými proteiny, 3D strukturu. • The ExPASy (Expert Protein Analysis System) proteomics server of the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)je vytvořen pro analýzu proteinové sekvence a struktury www.expasy.ch 12 • Struktura proteinu, pokud byl protein krystalizován a nebo byla zjištěna sekvence pomocí NMR, tak lze nalézt na webových stránkách: https://www.rcsb.org/ Potom musíte znát pdb (protein databank) označení a pakliže ho neznáte, musíte ho znovu najít. Označení pdb můžete najít ze základní stránky prošitu a nebo si můžete zadat do site search (beta-glucosidase maize) a zobrazí se vám seznam beta-glukosidáz z kukuřice spolu s mutanty. Strukturu můžeme bud stáhnout a prohlížet v staženém prohlížeči jako je RASMOL, nebo PYMOL a nebo PDBviewer. • Proteiny můžeme také podrobit doménové analýze SMART http://smart.embl-heidelberg.de/ nebo PFAM http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ CATH Protein Structure Classification CATH je strukturovaná klasifikace proteinových domén na čtyřech úrovních Class(C)-třída, Architecture(A)-architektura, Topology(T)-umístění and Homologous superfamily (H)-stejná rodina SCOP: Structural Classification of Proteins. 13 C) URČENI KONFORMACE 3-D PODOBNÝCH PROTEINU Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D. Úkol: s pomoci databáze makromolekulárních struktur určete terciární strukturu(y) proteinu(ů) podobnou(é) proteinu se zadanou sekvenci aminokyselin, vytvořte obrázek molekulární struktury a stručně popište výsledek Nástroje: 1) databáze proteinových struktur PDB, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 2) hledání struktur proteinů s podobnou 3D strukturou, např. nástroj PDBeFold http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/ 3) Vizualizace výsledků, vytvoření ilustrativního obrázku, pomocí např. UCSFR Chiméra (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) Příklad: hledání struktur podobných k haloalkan dehalogenáze LinB ze Sphingomonas paucimobilis UT26. sekvence (ve formátu FASTA) >1D07:A|PDBIDICHAIN|SEQUENCE MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYIDEGTGDPILFQHGNPTSSYLWRNIMPHCAGLGRLIACDLIGMGDSDKLDPSGPERY AYAEHRDYLDALWEALDLGDRWLWHDWGSALGFDWARRHRERVQGIAYMEAIAMPIEWADFPEQDRDLFQAFRSQAGE ELVLQDNVFVEQVLPGLILRPLSEAEMAAYREPFLAAGEARRPTLSWPRQIPIAGTPADWAIARDYAGWLSESPIPKLF INAEPGALTTGRMRDFCRTWPNQTEITVAGAHFIQEDSPDEIGAAIAAFVRRLRPA Postup: 1) vyhledání struktur s danou primární sekvencí v databázi PDB: O www.rcsb.org/pdb/home/home.do RCSB PDB Deposit" Search- Visualize' Analyze- Download- Learn- More' ] m há PROTEI N DATA BANK An Information Portal to 117651 Biological Macromolecular Structures msLgakpfgekkfieikgrrmayidegtgdpilfqhgnptsí H i KS" Stiuclur.ilB dew KnowbdgabiM H Welcome V Deposit Q Search B Visualize ^ Download B Learn A Structural View of Bioioc close X Sequence . Very significant (E Cut OftO.OOl) to MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYID^fc • Significant (E Cut Off:0.01) to MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYIDEG... • Includes Insignificant (E Cut 0(1:1} to MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYItJEC . Extended Search (E Cut Off:10) to MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYIDEI This resource is powered by the Protein Date archive information about the 3D shapes of p nucleic acids, and complex assemblies that f students and researchers understand all aspku ui biomedicine and agriculture, from protein synthesis to health and disease. The RCSB PDB builds upon the data by creating tools and resources for research and education in molecular biology, structural biology, computational biology, and beyond. Zika Virus Structure Lead Poisoning Latest Entries as or its New Features 14 C ô D www.rcsb.org/pdb/results/results.do?qrid=54EA8338&tabtoshow=Current <> 0 RCSB PDB Deposit *■ Search--- Visualize Analyze ▼ Download *■ Learn »- More ^ Search Parameter: / Reline Search Save Search lo MyPDB slgakpfgekkfíeikgrrmayidegtgúpil f q rignptssylwrniir phcaglgrliacdligingrJsdklrJpsgpery yaehrdyldalwealdlgdrvvlvvhjdwgsalgf dwarrhrervqgiaymeaianipiewadf peqdrdlf qaf rsqage lvlqdnvfveqvlpglilrplseaeTiaayrepflaagearrptlswprqipiagtpadvvaiardyagwlsespipklf naepgalttg Refinements ORGANISM Sphingomonas paucimobilis ... (1) UNIPROT MOLECULE NAME Haloalkane dehalogenase (1) Refine Query TAXONOMY Bacteria only (1) EXPERIMENTAL METHOD X-ray (1) X-RAY RESOLUTION 0.9 and more (1) Refine Query RELEASE DATE Ajg 2003 (1) Refine Query Currently showing 1 - lof 1 Page: Reports: of 1 Displaying 25 View: Detailed Select □ Sort by... © Download Files I View File l^l e 3D View 1MJ5 LINB (haloalkane dehalogenase) from sphingomonas paucimobilis UT26 at atomic resolution Oakley. A.J.. Damborsky. J.. Wilce. M.C. Crystal structure of haloalkane dehalogenase LinB from Sphingomonas paucimobilis UT26 at 0.95 A 2) hledání strukturně podobných proteinů, pomocí např. PDBeFold 15 3) vizualizace a strukturni srovnani, napf. pomoci UCSF Chimera ^ C D www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/cgi-bin/ssmservGr is □ O © EMBL-EBI are agreeing lo the use of our site cookies. To f nc 011 man see our Terms of Use Services Research Training About q3 Protein Data Bank in Europe Bringing Structure to Biology PDBeFold J J Shaie H( FE-rCl::-a| Structure Alignment Results. Query: pdb entry lmj5:A , 297 residues LINE- (HALOALKANE DEHALOGENASE] FROM SPHINGOMQNA5 PAUCIMOBILIS UT26 AT ATOMIC RESOLUTION Examined 115368 entries, (312268 chains). Displaying Matches 1-20 of 169. Bäck m query re*: laol pa^e S.;;!"i...Q-5core jf] airange by SCOP family □ match |l || jump ÜH Scoring RMSD Naii5n ng Hb, Query Target (PDB entry) Q P Z Match Vt^. Nle5 M Title 1 i.ee 88.1 28.3 e.ee 297 e ioo lee inj5:A igg 297 □ linb (haloalkane dehalogenasej from sphingomonas paucimobilis ut26 at atomic resolution 2 6.99 56.5 22.6 6.69 295 6 100 166 lk6e:A 100 295 complex of hydro lytic haloalkane dehalogenase linb from sphingomonas paucimobilis ut26 with 1,2 propanediol (product of dehalogenation of 1.2-dibromopropane] at 1.85a 3 B.99 57.3 22. e 6.16 295 6 1GG 166 "kf.l:£ 100 295 i_i complex of hydro lytic haloalkane dehalogenase linb from sphingomonas paucimobilis with lit26 2-bromo 2 propene-l ol AT 1.8a resolution 4 6.9B 51.8 21.6 6.27 294 6 100 166 ljjSf :A 100 294 Q structure of linb complexed with 1,2-Dichloroethane 5 6.98 55.2 22.3 6.28 294 6 100 166 lg_42:A 100 294 i_i structure of 1.34.6-tetrachloro-1.4 cyclohexadiene hydrolase [line) from sphingomonas paucimobilis complexed with 1,2 dig hloro pro pane 6 6.98 51.8 21.6 6.29 294 6 100 166 lg4ti:A 100 294 l_l linb complexed with butan-1-ol 7 B.98 61.7 23.6 6.29 294 6 100 166 2bfri:A 100 294 i_i the crystal structure of the complex of the haloalkane dehalogenase linb with THE product of dehalogenation reaction 1.2-dichloropropane. 8 8.98 49.4 21.8 8.29 294 8 19& 95 liz7:A 95 294 i_i re-refinement of the structure of hydrolytic haloalkane dehalogenase linb from 16 0®ŕ UCSF Chimera 17 II. TECHNOLOGIE REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ Nedostupnost dostatečných množství homogenních preparátů biologicky významných eukaryotních proteinů byla jedním ze základních omezení jejich studia. Tento limitující faktor byl odstraněn rozvojem molekulárně biologických technik, umožňujících produkci studovaných eukaryotních proteinů v dostatečném množství. Důležitým předpokladem bylo vypracování technik jejich produkce v heterologních, převážně bakteriálních expresních systémech. Protože prokaryotní transkripční aparát nedokáže odstranit nekódující oblasti eukaryotních genů, je nezbytné získat nejprve DNA komplementární k mRNA genu pro daný protein (cDNA) metodami založenými na reverzní transkripci mRNA. Pro účely nadprodukce rekombinantních proteinů lze využít řadu expresních plazmidů se silnými promotory pro kmeny Escherichia coli. Inzerce cDNA do vektoru je usnadněna přítomností mnohočetného klonovacího místa za promotorem, který má být použit k řízení exprese cDNA. A) EXPRESE A PURIFIKACE REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ Ing. Blanka Pekařova, Ph.D., Mgr. Lucia Baďurová, Častým průvodním jevem nadprodukce eukaryotních proteinů je vytváření nerozpustných útvarů v bakteriální cytoplazmě, složených obvykle z nekorektních konformerů rekombinantního proteinu, označovaných jako inkluzní tělíska. Důvodem jejich tvorby může být absence eukaryotních chaperonů nebo post-translačně modifikačních systémů a někdy i toxicita rekombinantních eukaryotních proteinů pro bakteriální buňky. Rozsah akumulace rozpustného rekombinantního proteinu může být pak silně negativně ovlivněn. Radu obtíží se podařilo vyřešit translačními fúzemi rekombinantního proteinu a přirozených (obvykle bakteriálních) proteinů (např. thioredoxin, maltózu vázající protein, glutathion-S-transferasa atd.), které své pozitivní fyzikálně-chemické vlastnosti (zejména vysokou rozpustnost při zvýšených intracelulárních koncentracích) rozšiřují na celý fúzní protein. Další možností, kterou lze ovlivnit správné skládání proteinu, je změna podmínek exprese proteinu. Optimalizuje se teplota růstu buněk, teplota indukce exprese požadovaného genu, koncentrace IPTG při indukci, prodloužení doby indukce nebo růstu buněk. Lze i specificky obohacovat růstové médium. Podmínkou pro většinu analýz rekombinantních proteinů je získání rekombinantních proteinů v homogenní formě účinnou purifikací z komplexních bakteriálních lyzátů. Purifikaci lze usnadnit řízeným směrováním syntetizovaného proteinu např. do periplazmatického nebo vnějšího prostoru Escherichia coli užitím specifických signálních sekvencí, ale tato technologie může být spojena s nižším výtěžkem. Proto byly vyvinuty metody purifikace, jež používají nově získané afinity fúzované domény, která může mít podobu přirozených polypeptidů nebo krátkých arteficiálních oligopeptidů, které neovlivňují profil exprese - mají pouze funkci afinitní značky (Hisn, Aspn, Phen atd.). Exprese rekombinantních derivátů B-glukosidasy Zm-p60.r Pro expresi budou použity dva druhy konstruktu pRSET A::Zm.p60.r, z nichž jeden je divoký typ (WT) a druhý nese záměnu jedné aminokyseliny. Studenti nebudou předem obeznámeni, zda jim byl přidělen WT nebo mutant. Během cvičení však mohou postupně přijít na to, se kterou formou pracují. Tyto konstrukty náhodně označíme jako X a Y. Liché skupiny budou pracovat s proteinem X a sudé skupiny s proteinem Y. Experiment: 18 • Do 1 1 LB média s ampicilinem (100 mg/l) a 1% glukózou zaočkujeme 800 ul bakteriální kultury (BL21(DE3)pLysS buňky obsahující již zmíněný konstrukt pRSETA::Zm.p60.r.) zamraženou na - 80 °C v 10% glycerolu. Necháme růst při 37 °C, 200 rpm do ODďoo 0,5-0,6. • Poté zahájíme tříhodinovou indukci exprese rekombinantního proteinu přídavkem 0, lmM isopropyl (3-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a současně sníženíme teplotu na 22 °C. • Kultury sklízíme centrifugací (4000 rpm/20 min nebo 6000 rpm/10 min). Pelety zamrazíme na -20 °C. Purifíkace proteinu Čistota proteinových preparátů je jedním z kriterií pro přesnost výsledků při následné analýze purifikovaných proteinů, proto je nutné provést purifikaci proteinu z bakteriálních lyzátů. Použité různí proteiny obsahují na N-konci sekvenci šesti histidinů, které umožňují využít metalochelatační afinitní chromatografii. Metoda byla poprvé využita v roce 1975 (Porath a kol.) pro frakcionaci sérových proteinů na polymerní matrici s funkční skupinou chelatující ionty přechodných iontů (Cu, Ni, Zn, Co). Funkční skupinou na matrici je obvykle iminodioctová (IDA) nebo nitrilotrioctová (NTA) kyselina. Interakce proteinu s matricí je zprostředkovaná neobsazenými d-orbitaly iontů přechodných kovů, které vážou volné elektronové páry převážně z dusíkového atomu imidazolových skupin histidinových zbytků v proteinu. Tohoto principu bylo využito ke konstrukci umělých oligohistidinových domén (afinitních značek) na C- nebo N-konci rekombinantního proteinu. Značky vykazují ve srovnání s izolovanými zbytky histidinů v polypeptidech vysokou afinitu k vázaným přechodným kovům. Metalochelatační afinitní chromatografie se tak stala jedním ze základních purifikačních postupů pro rekombinantní proteiny. Optimalizovaný purifikační protokol není vždy zcela přenosný na jiné proteiny z důvodů různé fyzikálně-chemické charakteristiky proteinu a také vazebné dostupnosti oligohistidinové domény. Obecně lze navrhnout pro vazbu rekombinantního proteinu pufry s pH = 7-8, zajišťující optimální interakci domény s kovovým iontem. V pufrech je vhodné použít vysoké koncentrace solí (0,5 - 1 M NaCl) a tím snížit nežádoucí elektrostatické interakce proteinů s matricí. Eluce proteinů může být provedena změnou pH do kyselé oblasti, kdy dochází kprotonaci imidazolových skupin, případně použitím kompetitivních činidel (imidazol, některé aminokyseliny) nebo silných chelatorů (EDTA, EGTA). Použitím nižších koncentrací uvedených látek lze dosáhnout eluce balastních proteinů, které rovněž interagují s iontem přechodného kovu. Experiment: Příprava bakteriálního lyzátu pro purifikaci • Rozmrazíme exprimované kultury, pracujeme na ledu • Pelety resuspendujeme v sonikačním pufru (10 ml sonikačního pufru/pelet z 0,5 1 kultury) • Lyzáty sonikujeme v plastové kádince 2x1 min (Amp 30, ls ON, 2s OFF) • VYVÁŽÍME ZKUMAVKY S PŘESNOSTÍ NA 0,1 g a centrifugujeme 30 minut (20000 rpm/4 °C) • Pro odstranění nerozpustných zbytků se lyzát protlačí přes filtr o průměru 0,22 um • Přefiltrovaný supernatant použijeme na purifikaci proteinu na kolonkách. • Zhruba 200 ul lyzátu uschováme na ledu pro následné měření koncentrace proteinů a strukturní a funkční analýzu. 19 Roztoky: Sonikační pufr: 20 mM Tris pH 7,9 0,5 M NaCl 0,1 % Triton X-100 Puriflkace fúzních derivátů Zm-p60.1 na matrici Sepharose Ni -NTA Pro zisk čistého proteinu je nutné optimalizovat podmínky vymývaní balastních proteinů. Změna složení promývacích pufrů ovlivní eluci balastních proteinů interagujících s iontem kovu. Jako matrice bude použita Ni - NTA 6 Superflow a jako promývací pufry PI a P2 lišící se koncentrací kompetičního činidla imidazolu. Pozn.: Sbíráme frakce po každém promytí pro následnou SDS PAGE analýzu. promýt kolonku 4x3 ml vody (objem matrice jel ml) . promýt kolonku 1x2 ml 100 mM NiS04 (obsazení vazebných míst nosiče kolonky Ni2+ ionty) • promýt kolonku 4x3 ml vody • promýt kolonku 4x3 ml ekvilibračního pufru (poté uzavřít spodní část kolonky) • po nanesení lyzátu exprimovaných kultur kolonku uzavřeme, zvortexujeme a inkubujeme 30 minut při 4 °C za třepání na ledu • promýt 3x3 ml pufru Pl • eluce balastních proteinů 3x3 ml pufru P2 • eluce vlastního proteinu 4 ml pufru E obsahujícího EDTA • frakce uschovat při 4 °C pro následnou analýzu čistoty proteinu • kolonku promýt 2 ml vody • promýt 4 ml 20 % ethanolu (ne do sucha!) Roztoky: Ekvilibrační pufr: 20 mM Tris pH 7,9 1 M NaCl První promývací pufr (Pl): 50 mM Tris pH 7,9 1 M NaCl 20 mM imidazol Druhý promývací pufr (P2): 50 mM Tris pH 7,9 1 M NaCl 50 mM imidazol Eluční pufr (E): 20 mM Tris pH 7,9 1 M NaCl 100 mM EDTA Demonstračně bude předvedena stejná purifikace pomocí FPLC. 20 Stanovení koncentrace proteinu Koncentraci proteinů stanovíme metodou dle Bradforda při 595 nm; činidlo firmy Bio-Rad. Stanovíme koncentraci jen v nativních lyzátech! • 10 ul lyzátu naředíme 10 x sterilní vodou a z takto ředěného lyzátu přřipravíme tři paralerní vzorky: - 10 ul ředěného lyzátu doplníme sterilní vodou do celkového objemu 800 ul - přidáme 200 ul činidla a inkubujeme 10 minut při pokojové teplotě • změříme absorbanci při 595 nm • z kalibrační křivky odečteme množství proteinu B) ANALÝZA REKOMBINANTNICH PROTEINU Analýza kvartérní struktury rekombinantních proteinů a stupně purifikace bude provedena elektroforeticky v polyakrylamidových gelech. Obecně lze říci, že elektroforéza proteinů využívá jejich přirozeného nebo upraveného povrchového náboje v polymerních materiálech. Nej používanějším separačním materiálem se stal síťovaný polyakrylamid umožňující vysokou reprodukovatelnost metody. Jistou nevýhodou polyakrylamidových gelů (PAGE) je vysoká neurotoxicita monomerů akrylamidu a metylenbisakrylamidu (slouží jako síťovací prvek). Při přípravě je tedy nutné pracovat v dobře větraných digestořích a v rukavicích. K iniciaci polymerace (přípravě radikálů) lze použít riboflavin ozářený UV nebo častěji persíran amonný (APS), jako stabilizátor radikálů se používá tetramethylendiamin (TEMED). Dvě skupiny si připraví jeden 10 % SDS-PAGE gel s 10 jamkami DELICI GEL (10 %) NA 1 GEL Acrylamid G30 1,7 ml 4x dělicí pufr 1,25 ml dd voda 2 ml 10 % SDS 50 ul 10 % APS 50 ul TEMED 3ul KONCENTRAČNÍ GEL (5 %) Acrylamid G30 250 ul 4x separační pufr 400 ul dd voda 800 ul 10 % SDS 16 ul 10 % APS 25 ul TEMED 1 ul 4x dělicí pufr: 1,5 M Tris-Cl pH 8,8 4x koncentrační pufr: 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 21 Polymerace dělicího gelu musí probíhat bez přístupu vzdušného kyslíku, proto je nutno polymerační směs po nalití mezi skla přelít deionizovanou vodou. Po odstranění deionizované vody nalijeme směs pro koncentrační gel, vsuneme hřebínek a necháme polymerovat. Kontrola čistoty puriflkovaného proteinu SDS-PAGE Nej významnější aplikací polyakrylamidové elektroforézy (PAGE) je diskontinuální separace v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS) jako silného detergentu. SDS se váže na proteiny v konstantním poměru k jejich hmotnosti (1,4 g SDS na 1 g proteinu) a umožňuje tak určit Mr proteinů s využitím hmotnostních standardů. Úplné maskování původního náboje však není zcela zachováno u silně bazických nebo kyselých proteinů, kde je k přesnému určení Mr nezbytné použít dalších technik. Diskontinuální uspořádání zahrnuje krátký koncentrační gel a dlouhý separační gel. Koncentrační gel má nižší pH (6,8), dochází zde k zakoncentrování proteinů do úzkých zón mechanismy izotachoforézy (glycin zde není zcela ionizován a slouží jako terminátorový ion). V separačním gelu o pH 8,8 dochází k ionizaci glycinu, zóny proteinů se tak oddělují a proteiny se rozdělí podle molekulových hmotností. Metoda tak umožňuje detekovat v proteinovém preparátu kontaminující proteiny a slouží k testování úspěšné optimalizace purifikace proteinu z komplexních směsí. Separované proteiny lze vizualizovat některou z nespecifických technik barvení proteinů (Coomassie Brilliant Blue, barvení stříbrem), nebo lze použít specifické techniky (detekce enzymů pomocí chromogenních substrátů, Western bloting s následnou detekcí proteinu pomocí protilátek). Experiment: Našim cílem bude ověřit čistotu izolovaného proteinu. Na připravený denaturační gel naneseme postupně frakce eluované z kolonky během purifikace: Skupina pracující s proteinem X Společné pro obě skupiny Skupina pracující s proteinem Y Každá skupina pracuje s přiděleným rekombinantním proteinem X nebo Y. Jednotlivé purifikační frakce naneseme na gel pouze orientačně, tzn., nebudeme měřit proteinovou koncentraci. 1. Příprava jednotlivých vzorkuje znázorněna v tabulce. označení vzorku objem vzorku (ul) 4 x koncentrovaný SDS nanášecí pufr (liI) lyzát 5ul+10ul H20 5 Lil Pl 30 ul 10 Lil P2 30 Lil 10 Lil Eluce 30 li! 10 Lil Pozn: Vzorek proteinu puriflkovaného na FPLC dostanete připravený stejně tak i hmotnostní standard. 22 2. Připravené vzorky povaříme (95 °C/5 min) a krátce stočíme na stolní centrifuze. 3. Do jamky naneseme 3 ul připraveného lyzátu, 15 ul Pl a 30 ul P2, E a FPLC vzorek. 4. Elektroforézu necháme běžet při 25 mA/gel po dobu 1 -2 hod. Gel obarvíme roztokem Coomassie Brilliant Blue G-250 (nespecifické barvení proteinů ). Elektroforetický pufr: 25 mM Tris-Cl, pH 8,3 192 mM glycin 0,1 % SDS 4x koncentrovaný nanášecí pufr: 0,125 M Tris-Cl pH 6,8 40 % SDS 20 % v/v glycerol 0,2 M DTT Bromfenolová modř Analýza obrazu - stanovení čistoty puriflkovaného proteinu Provedením samotného experimentu práce zdaleka nekončí. Získaná data je potřeba ještě správně vyhodnotit a interpretovat. V našem případě bude vyhodnocení spočívat v určení čistoty proteinu (eluční frakce). 1. Skenování gelu 2. Vyhodnocení gelu: Sledujete zastoupení daného proteinu ve směsi ostatních proteinů bakteriálního lyzátu. Tento poměr se vyjadřuje jako čistota vzorku. Čistotu budeme analyzovat v programu Gel analyzer. Popsané obrázky naskenovaného gelu budou součástí protokolu. Strukturní a funkční analýza proteinů Místně řízená mutageneze spolu s určením kinetických parametrů enzymů se stala klíčovou metodou pro studium vztahů mezi strukturou a funkcí proteinů. Pomocí tohoto přístupu lze v molekule proteinu detekovat aminokyselinové zbytky podílející se na katalýze přeměny substrátu, na rozpoznání a vazbě substrátu a také ty aminokyseliny, které hrají důležitou roli pro poskládání proteinu do správné kvartérní konformace, která je často podmínkou pro funkci proteinu. Může se však stát, že záměna jediné aminokyseliny má katastrofické důsledky, které vedou ke zborcení nativní struktury a ztrátě funkce proteinu. Často také mutace ovlivní pouze funkci enzymu (a nemusí se vždy jednat o negativní změnu), v některých případech je vliv nulový. Analýzu struktury a funkce enzymu je možno provést již v nativních bakteriálních lyzátech, čímž se ušetří spousta experimentální práce spojené s izolací proteinu. Jedinou podmínkou je mít po ruce dostatečně specifický detekční systém pro daný protein. V této části si ukážeme, jak lze analyzovat strukturu a funkci Zm: p60.1 v bakteriálních lyzátech pomocí nativní elektroforézy a jaký dopad má záměna jedné aminokyseliny na kvartérní strukturu a následně pak i funkci proteinu. 23 Nativní PAGE Tato elektroforéza se provádí v nepřítomnosti SDS a za důsledného chlazení aparatury, abychom udrželi protein v nativním a tedy aktivním stavu. K separaci proteinu nativní PAGE dochází na základě velikosti, náboje a také na tvaru proteinu. Elektrický náboj proteinu závisí na aminokyselinovém složení proteinu a jeho posttranslačních modifikacích. Celkový povrchový náboj proteinu se může měnit podle pH použitého elektroforetickém pufru. Pokud se provede nativní elektroforéza za neutrálního pH, je pak tato metoda použitelná pro studium procesů, při kterých se mění náboj (např. při chemické degradaci proteinu - deamidace) nebo pro studium konformace proteinu (oligomerizace, tvorba agregátů, rozvolnění struktur, protein-protein nebo protein-ligand interakce). Využívá se opět diskontinuálního průběhu separace (viz SDS PAGE). Vizualizace proteinu můžeme provést specificky např. barvením na základě aktivity enzymu pomocí chromogenních substrátů (v případě naší p-glukosidasy: 6-bromo-2-naftyl-P-D-glukopyranosid - BNGP, 4-methylumbelliferyl- P-D-glucopyranoside - MUG) nebo po přenesení na membránu s následnou detekcí pomocí série protilátek. Lze požít také nespecifického barvení Coomassie Brilliant Blue. Experiment: K ověření katalytické schopnosti (His)6Zm.p60.rm (rekombinantní derivát p - glukozidázy a jeho mutantní formy) proteinů X a Y použijeme aktivitní barvení na nativní PAGE s využitím substrátu 4-methylumbelliferyl-P-D-glucopyranoside (MUG). V místě proužku odpovídajícímu p-glukozidáze dojde ke štěpení glukosidické vazby v molekule substrátu za tvorby fluorescenčního produktu viditelného působením UV záření. Kvartérní strukturu budeme analyzovat pomocí imunodetekce. Na nativní gely naneseme nativní lyzáty proteinu X a Y. Podle stanovené koncentrace proteinů v těchto lyzátech si každá skupina připraví dva vzorky. Vzorek, který bude nanesen na gel a následně použit na aktivitní barvení bude obsahovat 100 fxg na jamku (viz obrázek níže gel č. 1) proteinu a vzorek použitý pro přenos na membránu s následnou detekcí pomocí protilátek 20 ug na jamku (viz obrázek níže gel č. 2). Vzorek pro aktivitní barvení připravte z koncentrovaného lyzátu, vzorek pro imunodetekci z lOx ředěného lyzátu. Vzorky označte X nebo Y, podle proteinu, se kterým pracujete a číslem skupiny. Gel č. 1: Aktivitní barvení pomocí MUGu - substrátu P-glukosidasy FUNKČNÍ ANALÝZA (100 ug/iamku) skup. Y X Y !■ X Y !■ skup. skup. skup. skup. skup. č.2 č.3 č.4 č.5 č.6 ■ 24 Gel č. 2: Specifická detekce (3-glukosidasy pomocí série dvou protilátek po přenesení na membránu (více viz. Imunodetekce) - STRUKTURNÍ ANALÝZA (20 ug/iamku) Elektroforézu necháme běžet v chladové místnosti při 25 mA/gel po dobu 1 -2 hod. Elektroforetický pufr: 25 mM Tris-Cl, pH 8,3 192 mM glycin Gel č.l: aktivitní barvení: • Po dokončení elektroforézy ekvilibrujeme gel 2x30 min ve vychlazeném 50 mM citrát/fosfátovém pufru (pH 5,5) při 4°C. • Gel vložíme na cca 10 min do barvícího roztoku při RT, zakryjeme alobalem • Detekce proužků na transluminátoru, focení. Barvící roztok: 50 mM citrát/fosfátový pufr 0,8 mM polyvinylpyrrolidon 3 mM MUG Gel č.2: Imunodetekce na membráně Imunodetekce Jednou z hojně používaných specifických technik detekce proteinů je imunodetekce. Pro některé účely (hmotnostní spektrometrie, imunoanalýza apod.) je výhodné převést separované proteiny z gelu na membránu. Mezi nejčastěji používané materiály membrán patří nitrocelulóza (má však špatné mechanické vlastnosti) a poly viny lidendifluorid (PVDF). PVDF membrány jsou mechanicky velmi odolné a vykazují vysokou vazebnou kapacitu. Používané techniky přenosu zahrnují kapilární a elektrický přenos, pro svou časovou nenáročnost je zvláště rozšířen polosuchý (semi-dry) přenos. Imunochemická detekce proteinu na membráně se provádí pomocí série dvou protilátek. První protilátka reaguje imunochemicky s detekovaným proteinem za tvorby komplexu. Takto vytvořený komplex je rozpoznán druhou protilátkou značenou detekovatelnou sondou (např. vázaná alkalická fosfatáza, atom izotopu atd.). • připravit membránu PVDF, 4 papíry Whatman 3MM podle rozměru gelu • ekvilibrace ponořením PVDF do MetOH (snížení hydrofobicity membrány) • ekvilibrace papírů, gelu i membrány v přenosovém pufru (10 minut) 25 polosuchý přenos 30 min. (proudová hustota = 5 mA na 1 cm2) inkubace 45 min s blokačním pufrem 45 min inkubovat s primárni protilátkou promývat 3x 5 min TBST inkubace se sekundárni protilátkou (45 min) promývat 3x 5 min TBST inkubace s detekčním pufrem (10 min) detekce inkubací s roztokem chromogenního substrátu (max. 5 min.) opláchnout vodou a usušit Roztoky: přenosový pufr 25 mM Tris-Cl, pH 8,3 150 mM glycin 10 % methanol TBST 20 mM Tris-Cl, pH 7,č 100 mM NaCl 0,1 % Tween-20 detekční pufr 100 mM Tris-Cl, pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2 blokační pufr 5 % sušené mléko/ 3 % BSA v TBST barvící roztok: 100 mM Tris-Cl, pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2 100 ug.mľ1 NBT SOug.mľ1 BCIP Primárni protilátka: Polyklonální králičí Anti-Zm.p60.1 (LMFR-VÚVEL); 10 000 x ředěno v 3% BSA v TBST Monoklonální myší Anti-Poly His (Sigma); 10 000 x ředěno v 5 % mléku v TBST Sekundárni protilátka: Kozí IgG proti králičímu séru značená alkalickou fosfatázou; 30000 x ředěno v 5 % mléku v TBST Kozí IgG proti myším IgG značená alkalickou fosfatázou; 20 000 x ředěno v 5 % mléku v TBST Chromogenní substrát: NBT (nitrobenzentetrazolium), BCIP (5-bromo-4-chloro-3- indolylfosfát). 26 Schéma praktické části Technologie rekombinantních proteinů Zaočkování 800 ul zamraženého bakteriálního inokula do LB média obsahujícího ampicilin (100 mg/l) a růst do OD6oo= 0,5-0,6 (ZHRUBA 3 hod) 1 Indukce exprese rekombinantních proteinů pomocí IPTG (0,1 mM) při 22 °C po dobu 3 hodin Sklízení buněk centrifugací 15 minut (4000 rpm při 4 °C) - každá skupina stočí 500 ml kultury a rozsuspenduje v 10 ml sonikačního pufru I Sonikace Odstranění buněčných zbytků centrifugací při 20000 rpm po dobu 30 min. při 4 °C I Purifikace IMAC Ni-NTA Strukturní a funkční analýza i i SDS-PAGE Nativní PAGE 1 Vyhodnocení čistoty Aktivitní barvení Imunodetekce na PVDF membráně