Ubikvitóny a tvorba proteínových komplexov Peter Kolesár 16.3.2023 Post-translačné modifikácie proteínov • (len) u eukaryotických buniek • mnohonásobne zvyšujú repertoár proteínov a ich komplexov • rýchle a reverzibilné adaptácie na zmeny • pripojenie - malých molekúl - fosforylácia, acetylácia, metylácia,... - proteínových molekúl - ubikvitóny Ubikvitóny = ubikvitín a ubikvitínu podobné proteíny (ubiquitin-like proteins, UBLs) Mayer et al., 1998 Yu et al., 2020 Ubikvitóny Ubikvitóny Waughan et al., 2020 Ubikvitóny - β-grasp fold Ubikvitín SUMO-1 NEDD-8 T. Wilkinson Konjugačný cyklus ubikvitónov Schwartz & Hochstrasser, 2003 Dopad pripojenia ubikvitónu • Pripojenie na proteín cez flexibilný C-koniec → priame ovplyvnenie proteínu zriedkavé • Prináša povrch pre proteínové interakcie → stimulácia proteínproteínových interakcií a tvorby proteínových komplexov • Interakčný partner obsahuje nekovalentné väzobné miesto špecifické pre daný ubikvitón (ubiquiton binding domain, UBD) • interakcia medzi ubikvitónom a UBD je hlavným mechanizmom funkcie týchto modifikácií C-koniec UBD UB Ubikvitín Ubikvitín • malý proteín (8.5 kDa, 76 aminokyselín) • ubique = všade – je hojný vo všetkých eukaryotických bunkách • globulárna štruktúra • sekvencia je vysoko konzervovaná • kovalentné pripojenie k iným proteínom: karboxylový (C) koniec ubikvitínu (glycín) sa kovalentne pripojí k ε-amino skupine lyzínového zvyšku vnútri cieľového proteínu izopeptidovou väzbou / k amino-skupine N-konca proteínu peptidovou väzbou ε Ubikvitín - prekurzory • ubikvitín nevzniká samostatne, ale ako fúzny proteín • u ľudí je kódovaný štyrmi lokusmi – Dva lokusy kódujú polyubikvitín - expresia pri stresových podmienkach – Dva lokusy kódujú fúziu ubikvitínu s ribozomálnym proteínom – spoločná regulácia ubikvitínového systému s translačnou aktivitou bunky • fúzne translačné produkty sú rýchlo spracované aktivitou ubikvitínových Cterminálnych hydroláz → voľný ubikvitín Nei et al., 2000 Ubikvitín - konjugačný systém Verma et al., 2020 E1, E2 – Ub sa viaže na katalytický Cys / na substrát sa viaže cez Lys Ľudia: E1 – 2 ks; E2 – 35 ks; E3 › 600 ks - + + + + + + E1 (Uba1) + - + + + + + Ubc13 + + - + + + + Mms2 + + + - + + + biotin-Ub + + + + - + + ATP + + + + + - + Nse1/3/4 1 2 3 4 5 6 7 130 - kDa 25 - 35 - 40 - 55 - 70 - 100 Príklad analýzy ubivitinácie in vitro 2022 Úloha - nájdi problém ubikvitinácie NSE1/MAGEG1 Kolesár, unpublished E3 ubikvitín ligázy • udeľujú špecifickosť tým že rozoznávajú cieľové substráty • väzobné miesto pre cieľový proteín + pre špecifický E2 enzým • priblížia substrát a E2 - tým sprostredkovávajú prenos ubikvitínu 2 hlavné triedy: • RING (Really interesting new gene) E3 ligázy (95%) • HECT (homologous to E6-AP COOH terminus) E3 ligázy Deshaies & Joazeiro, 2009 Rozdiel mezi HECT a RING E3 ligázami Rozdiel v prenose ubikvitínu na substrát: • HECT – obsahujú konzervovaný katalytický cysteín, ktorý funguje ako akceptor ubikvitínu z E2. Ubikvitín je následne prenesený na špecifický lyzín substrátu • RING – ubikvitín je prenesený z E2 priamo na substrát Rotin & Kumar, 2009 RING E3 ligázy • RING doména: – 7 x Cys + 1 x His / 6 x Cys + 2 x His - koordinujú dva atómy Zn2+ – viaže sa s E2 • 2 velké podskupiny: – Jednoduché RING E3 – na jednom polypeptide sa nachádza RING doména aj doména pre väzbu substrátu – Zložené Cullin-RING E3 – tvorené modulárnymi podjednotkami – RBX (RING box protein), Cullin a ďalšie substrát-rozoznávajúce proteíny Nalepa et al., 2006 Deshaies & Joazeiro, 2009 Príklad jednoduchej RING E3 ligázy – MDM2 - p53 – transkripčný faktor, senzor poškodenia DNA - ‘strážca genómu’ - zabraňuje mutagenéze a následnej karcinogenéze zástavou bunkového cyklu alebo apoptózou - asi 50% ľudských nádorov obsahuje mutáciu v jeho géne – MDM2 - hlavná ubikvitín ligáza pre p53, onkogénny RING E3 enzým – expresia je indukovaná p53 (negatívna sľučka) – MDM2 inaktivuje p53 najmenej 3 mechanizmami: • fyzicky blokuje transaktivačnú doménu p53 • podporuje transport p53 z jadra, čo ho udržuje ďaleko od cieľových génov • stimuluje ubikvitín – závislú degradáciu – Cielená liečba nádorov – vyradenie MDM2 / inhibícia MDM2 interakcie s p53 malými molekulami (Nutlin, PRIMA-1 – klinické testy) → stimulácia tumor-supresorovej aktivity p53 Cullin-RING E3 ligázy Nalepa et al., 2006 Petorski et al., 2005 - multi-podjednotkové ligázy zostavené na Cullin-ovom lešení - u ľudí 7 Cullinov - každý súčasťou viacerých ligáz - RBX obsahuje RING – interakcia s E2 - Variabilné substrát-rozoznávajúce podjednotky SCF (SKP1-Cullin-F-box ) ligázy (F-box protein) • APC (Anaphase promoting complex) / cyklozóm – Komplex nevyhnutný pre správny priebeh bunkového cyklu - separáciu sesterských chromatíd – 1,5 MDa komplex (asi 13 podjednotiek – obsahuje Cullin (APC2) a RING (APC11) podjednotku – aktivita závisí na aktivátoroch – napr. CDC20, ktorý je aktívny od metafázy do telofázy – Spúšťa prechod z metafázy do anafázy – ubikvitináciou proteínov ako sekurín, S a M cyklíny, ... – ubkvitinácia sekurínu (inhibítor separázy) → aktivácia separázy - štiepi Scc1 podjednotku kohezínu (drží sesterské chromatídy pohromade), odstránenie kohezínu uvoľní väzbu sesterských chromatíd – presun k pólom bunky Peters et al., 2006 Príklad Cullin-RING E3 ligázy U-box E3 ligázy • U-box motív je štruktúrne podobný RING doméne a viaže E2 enzýmy • U-box neviaže ióny kovu, priestorovú konformáciu určujú intramolekulárne vodíkové väzby • STUB1 (CHIP) – U-box ligáza dôležitá pri odstraňovaní nesprávne poskladaných proteínov ako je CFTR pri cystickej fibróze a tau proteíny pri niektorých neurodegeneratívnych chorobách (Alzheimer) HECT E3 ligázy • U ľudí približne 30 HECT ligáz • HECT doména (homologous to E6-AP C - terminus) – 350 aminokyselín na C-konci N-terminálna katalytická doména (obsahuje aktívny cysteín - viaže Ub) ohybová doména Ubc väzobná HECT doména E2 (Ubc7) Rotin & Kumar, 2009 Príklad HECT E3 ligázy • E6-AP (UBE3A) ubikvitín ligáza – rakovina krčku maternice = děložního čípku - HPV (human papillomavirus) nesie gén pre proteín E6 - E6 sa po infekcie exprimuje v bunke a viaže na E6-AP ligázu - E6-AP potom ubikvitinuje p53, čo vedie k jeho degradácii a napomáha vzniku rakoviny – Angelmanov syndróm - spôsobený mutáciou pri aktívnom mieste E6-AP – mentálna retardácia, záchvaty smiechu Giovanni Francesco Caroto – Dieťa s kresbou (1520) Monoubikvitinácia / polyubikvitinácia • Polyubikvitinácia – samotný ubikvitín je substrátom ubikvitinácie • Ubikvitín má 7 lyzínov ktoré môžu byť modifikované + N-koniec Komander, 2009 Druhy ubikvitinácií Komander, 2009 Rôzne ub reťazce majú odlišnú topológiu Husnjak & Dikic, 2012 Dopad pripojenia ubikvitínu • stimulácia proteín-proteínových interakcií, tvorba komplexov • Interakčný partner (ubikvitínový receptor) obsahuje nekovalentné väzobné miesto špecifické pre ubikvitín (ubiquitin binding domain, UBD) • Asi 20 rôznych typov UBD s rôznymi štruktúrami a veľkosťou • Väčšina UBD sa viaže s hydrofóbnou oblasťou ubikvitínu okolo Ile44 (Leu8, Ile44, Val70) (zvyšok ubikvitínu je polárny) UBD UB UBD – väzba s ubikvitínom Husnjak & Dikic, 2012 UBD - odlíšenie rôznych typov ub reťazcov Komander, 2009 Viacnásobné slabé interakcie významne zvyšujú afinitu Bishop et al., 2010 Funkcie ubikvitinácie Woelk et al., 2009 Cytozolická degradácia proteínov v proteazómoch • veľký (2.5 MDa) multipodjednotkový (60) proteázový komplex na degradáciu proteínov 26S proteazóm • Konjugácia ubikvitínu - hlavná nelyzozomálna proteolytická dráha • Po selektívnom označení proteínu konjugáciou ubikvitínového reťazca K48 (na rozoznanie treba 4 a viac ubikvitínov v reťazci) dochádza k jeho degradácii v proteazóme • odstránenie abnormálnych proteínov, riadi dĺžku života dôležitých regulačných proteínov (transkripčné faktory (p53), cyklíny, securin,...) Štruktúra 26S proteazómu Skladá sa z 2 subkomplexov: • 20S centrálna časť (core particle) – vykazuje katalytickú aktivitu • 19S regulačná časť (regulatory particle) 20S centrálna časť - tvar súdku → zložený zo 4 spojených kruhov → 2 identické vonkajšie α kruhy a 2 vnútorné β kruhy - každý kruh je zložený zo 7 rôznych podjednotiek - α1-7β1-7 β1-7 α1-7 - proteolyticky aktívne miesto je na β podjednotkách (β1, 2, 5) - α podjednotky obklopujú vstup pre substrát a výstup pre produkt 19S regulačná časť - zložená najmenej z 18 rôznych podjednotiek, ktoré tvoria subkomplexy bázu (base) a veko (lid) - veko obsahuje podjednotky, ktoré viažu ubikvitinované reťazce a 2 deubikvitinačné enzýmy (izopeptidázy) odstraňujúce ubikvitíny (recyklácia) - báza obsahuje 6 ATPáz priliehajúcich k vonkajšiemu kruhu 20S - ATPázy viažu proteíny, ktoré majú byť degradované a za hydrolýzy ATP ich rozbaľujú a posúvajú do 20S Kloetzel, 2001 Štruktúra 26S proteazómu http://pdb101.rcsb.org/motm/166 veko báza α kruh β kruh20S 19S 19S α kruh báza veko Architektúra 26S proteazómu Ubikvitínové receptory proteazómu Finley, 2009 Priebeh degradácie 1. substrát určený k degradácii sa pomocou ubikvitínového K48 reťazca naviaže na 19S, kde sa polyubikvitínový reťazec odštiepi a recykluje 2. ATPázy linearizujú zbalený proteín (esenciálne pre vstup do 20S, globulárne proteíny sú príliš veľké) a zároveň regulujú otváranie vstupného kanáliku do 20S 3. po vstupe substrátu do centrálnej časti je polypeptid štiepený 6 proteolytickými miestami na krátké peptidy (štiepia za hydrofóbnymi, bázickými, kyslými aminokyselinami) 4. peptidy (7 – 9 a.k.) sú uvoľnené z proteazómu a sú degradované cytozolickými endopeptidázami a aminopeptidázami na jednotlivé aminokyseliny a využité pre syntézu nových proteínov či metabolizmus Bhattacharyya et al., 2014 Imunoproteazóm - 20S • špeciálny typ proteazómu • exprimuje sa v bunkách pri zápalovej odpovedi (expresia spustená interferónom) a v antigénprezentujúcich bunkách imunitného systému • Je hybridom pozostávajúcim zo štandardných proteazómových podjednotiek a 3 katalytických β-podjednotiek špecifických pre imunoproteazóm • Štiepi odlišne od 26S - tvorí dlhšie peptidy schopné slúžiť ako antigénne peptidy • Peptidy sú na povrchu bunky naviazané na MHC I (major histocompatibility complex) molekuly a prezentované pre cytotoxické T (CD8+) lymfocyty Miller et al., 2016 Využitie ubikvitín - proteazómového systému na cielenú degradáciu proteínov Verma et al., 2020 - AID = auxínom indukovateľný degrón - za gén cieľového proteínu sa pridá AID transláciou vznikne fúzia cieľový proteín-AID - pridanie auxínu stimuluje interakciu medzi AID a TIR1-SCF ubikvitín ligázou - ubikvitinácia a proteazomálna degradácia cieľového proteínu Využitie ubikvitín - proteazómového systému na cielenú degradáciu proteínov Verma et al., 2020 - PROTAC = PROteolysis Targeting Chimeric molecule - chimerická molekula zároveň interaguje s cieľovým proteínom a s ubikvitín ligázou - blízkosť ligázy vedie k ubikvitinácii a degradácii cieľového proteínu SUMO SUMO proteíny • Small Ubiquitin-like Modifiers • Malé proteíny - 11 kDa, 100 aminokyselín • 18-20% sekvenčná identita s ubikvitínom • Kvasinky, bezstavovce – iba jeden SUMO proteín • Cicavce – 3 izoformy: SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 • Sumoylácia – kovalentné pripojenie SUMO proteínu k lyzínu cieľového proteínu - esenciálna vo väčšine eukaryotov – väčšinou vo forme monomérov a nie reťazcov - nevedie k proteozomálnej degradácii Bayeretal1998 SUMO-1 Sumoylácia Aos1/Uba2 u kvasiniek Sae1/Sae2 u ľudí Ubc9 SIZ/PIAS rodina RanBP2 Pc2 Mms21 Príklad analýzy sumoylácie in vitro Sumoylácia • Reverzibilný proces – SUMO dekonjugované pomocou ULP proteáz u kvasiniek / SENP proteáz u cicavcov • Typické SUMO-akceptorové miesto: • Dopad sumoylácie: SUMO stimuluje interakcie s proteínmi obsahujúcimi SUMO-interakčný motív (SIM) – 3-4 hydrofóbne a.k. + priľahlé negatívne nabité zvyšky (napr. IVIIEDD) hydrofóbna ak (Ile, Val) cieľový lyzín glutamová/asparágová kyselina ψKxE(D) K SIM K K SIM SIM K SIM K SIM K indukovateľnosťšpecifickosť SUMO a PML telieska (bodies) • PML proteín (promyelocytic leukemia) je tumor supresor, ktorý spolu s ďalšími interakčnými partnermi v jadre vytvára PML jadrové telieska • PML telieska sú dôležité pri regulácii transkripcie, bunkového cyklu, posttranslačných modifikácií, proti-vírovej odpovedi, oprave DNA, apoptóze,... • SUMO má centrálnu úlohu pri tvorbe PML teliesok – sumoylácia a následné nekovalentné SUMO – SIM interakcie medzi PML podjednotkami navzájom a s ďalšími proteínmi sú nevyhnutné pre tvorbu PML teliesok Bernardi, 2007 SUMO funguje ako lepidlo, ktoré drží komplex pohromade SUMO - funkcie • SUMO má významnú úlohu vo viacerých bunkových procesoch: – Jadrový transport – Regulácia transkripcie – Prenos signálu – Metabolizmus DNA – Stabilita genómu SUMO vs Ubikvitín • proteíny môžu byť modifikované SUMOm alebo ubikvitínom, často s odlišnými následkami • v niektorých prípadoch SUMO súťaží s ubikvitínom o daný lyzínový zvyšok, ale často v regulačných dráhach spolupracujú Iné ubikvitóny NEDD8 • NEDD8 – 9 kDa, 60% sekvenčná identita s ubikvitínom • Neddylačný cyklus: - štiepenie neaktívneho prekurzoru - E1 = NAE (APPBP1/UBA3) - E2 = Ubc12 / Ube2F - E3 ligázy - proteázy • substrátom sú Cullinové podjednotky SCF Cullin-RING ligáz • kovaletné pripojenie NEDD8 ku Cullinu je nevyhnutné pre interakciu ligázy s E2, teda pre ubikvitináciu substrátu ISG15 • ISG15 = interferon stimulated gene • Dve spojené domény s 30% sekvenčnou homológiou k ubikvitínu • 165 aminokyselín, 17 kDa • Expresia stimulovaná interferónmi – ISG15 len u vyšších eukaryotov, ktoré používajú interferónovú signalizáciu • E1 (Ube1L), E2 (UbcH6, UbcH8), E3 (Herc5) a deISGyláza (UBP43) sú tiež indukované interferónmi • Úloha v obrane proti vírusom a baktériám – ISG15 modifikuje proteíny vírusu aj hostiteľa Prokaryotické ubikvitóny • SAMPs (small archaeal modifier proteins) u archaea / TtuB u rodu Thermus - odlišná sekvencia od ubikvitínu, ale spoločný β-grasp fold • PUP (prokaryotic ubiquitin-like protein) – u aktinobaktérií - bežné pôdne baktérie a tiež mnoho patogénov (Mycobacterium leprae, M. tuberculosis) – 7 kDa, nezdieľa sekvenčný ani štruktúrny motív s ubikvitínom Striebel et al., 2014 PUPylácia - pupylácia = pripojene PUP proteínu na lyzín cieľového proteínu - pupylovaný proteín je následne degradovaný prokaryotickým proteazómom - iba 1 pupylačný enzým PufA a 1 depupylačný Dop Take home message - Ubikvitóny sa kovalentne viažu na lyzíny cieľových proteínov - Na konjugácii sa podieľajú E1 (aktivačné), E2 (konjugačné) enzýmy a E3 ligázy - E3 ligázy udeľujú dráhe špecifickosť tým že rozoznávajú cieľové substráty - Modifikácia je reverzibilná a ubikvitóny sú odstraňované proteázami - Ubikvitóny môžu, ale nemusia tvoriť reťazce - Ubikvitóny môžu, ale nemusia viesť k proteazomálnej degradácii - Ubikvitón substrátu prináša nový interakčný povrch a väčšinou vedie k stimulácii proteín-proteínových interakcií a tvorbe proteínových komplexov