Exprese rekombinantních
proteinů
Rekombinantní proteiny
Rekombinantní DNA je umělá DNA sekvence, která vznikla novou
kombinací dvou nebo více různých DNA sekvencí.
Rekombinantní proteiny jsou proteiny získané vnesením
rekombinantní DNA do heterologního hostitele (např.
mikroorganismus, kvasinky), ve kterém dojde k expresi genu.
Využití rekombinantních proteinů
1. V základním výzkumu:
• Biochemická funkční charakteristika proteinu (určení přesných
kinetických parametrů Km, kcat pro enzymy se substrátem, Ki pro enzymy s
inhibitorem, Kd pro protein - proteinové interakce či ligand -proteinové
interakce)
• Strukturní analýza (NMR, krystalografie, kryo-EM)
• Proteinové inženýrství (zlepšení vlastností proteinů – aktivita, stabilita)
2. V průmyslu:
• např. léky, vakcíny, proteiny pro diagnostiku, potravinové doplňky,……
Cíl: Vysoký výtěžek homogenního proteinu (mg – kg proteinu)
Zachování biologické aktivity
Proč vyrábět rekombinantní proteiny?
• Obtížně se získává (tkáně, orgány).
• Obtížně se kultivuje (bakterie, viry, tkáňové kultury).
• Limitovaná exprese
• Často obtížná purifikace proteinu (mnohakroková)
• Možná infekční rizika v průběhu izolace nebo ve výsledném produktu
Přirozený zdroj:
Technologie rekombinantních proteinů
Hostitelský organismus pro expresi
rekombinantních proteinů
• Prokaryotní expresní systémy (Escherichia coli, Bacillus subtillis,…)
• Kvasinky (Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,…..)
• Savčí buňky (linie ovariálních buněk křečka čínského- CHO buňky, linie lidských
embryonálních ledvinových buněk-HEK,…)
• Hmyzí buňky s bakuloviry
• Exprese proteinu in vitro (lyzáty z králičích retikulocytů, pšeničných klíčků, E.coli)
Kritéria pro výběr hostitelského organismu pro expresi
rekombinantních proteinů
- Lokalizace (intracelulární, sekretovaný, membránový protein)
- Velikost/hmotnost – zda je protein jedno nebo více doménový
- Přítomnost disulfidických můstků
- Post-translační modifikace
- Možnosti laboratoře (náklady na vybavení)
- Rychlost
- Požadované množství proteinu
Kritéria pro výběr hostitelského organismu pro
expresi rekombinantních proteinů
• Post-translační modifikace mají vliv na folding proteinu, rozpustnost,
stabilitu, transport, imunogenicitu a funkční aktivitu proteinu.
• Jeden z hlavních rozdílů mezi eukaryotickými expresními hostiteli je v
typu glykosylace (N- a O-glykosylace), kterou mohou poskytnout.
Expresní
systém
Náklady na
kultivaci
Rychlost
růstu
Úroveň
exprese
Konformace
proteinu
E. coli nízké vysoká vysoká často nutný
refolding
Kvasinky nízké vysoká nízká až
vysoká
někdy nutný
refolding
Hmyzí buňky vysoké nízká nízká a
vysoká
většinou
správná
Savčí buňky vysoké nízká většinou nízká většinou
správná
Kritéria pro výběr hostitelského organismu pro
expresi rekombinantních proteinů
PočetvstupůvPDB
Organismus použitý pro expresi
Statistika v PDB
Jedná se o přibližné hodnoty z roku 2014
https://www.rcsb.org/stats/distribution-expression-organism-gene
https://www.rcsb.org/stats/distribution-expression-organism-gene
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
VÝHODY :
• Jednoduchost
•Vysoká produkce rekombinantních proteinů
Dobře prostudovaný genom a proteom-usnadnění
genových manipulací
• Design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů
• Rychlý růst v poměrně levném médiu
• Minimální požadavky na vybavení
• Přizpůsobivost systému
NEVÝHODY:
• Potřeba cDNA zkoumaného proteinu
• Absence eukaryotických posttranslačních systémů (posttranslačních
modifikací)
• Tvorba inkluzních tělísek (nerozpustná forma proteinu)
• Omezená schopnost tvorby disulfidických vazeb
• Preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota
• Kontaminace proteinů lipopolysacharidem (endotoxin)
• Chybí sekreční mechanismus pro účinné uvolňování proteinu do kultivačního
média
• Často selhává při produkci proteinových komplexů, které obsahují
disulfidické vazby, při produkci eukaryotických membránových proteinů,
více-doménových proteinů či proteinů složených z více podjednotek
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
Expresní systém E.coli
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Expresní vektor
= klonovací vektor, který obsahuje nezbytné regulační sekvence k
tomu, aby podporoval expresi inzertů genů.
Klonovací místo
Fúzní/purifikační
značky/kotvy
Gen pro rezistenci
k antibiotiku (ampicilin)
Ribozom-vazebné místo
Operátor vazebné
místo pro represor
Transkripční
terminátor
Struktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coli
promotor
Počátek
replikace
Operátor vazebné
místo pro represor
Struktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coli
promotor
Vlastnosti promotoru:
• Silný promotor (ptac, ptrp, lpL, pT7 )
- Protein zájmu by měl tvořit 10-30% a více z celkového bakteriálního
proteinu.
• Přenositelný do různých kmenů E.coli
• Jednoduše a levně inducibilní
- Teplotní indukce (lpL)
- Chemická indukce (ptac, ptrp, pT7): IPTG (isopropyl-b-D-
thiogalaktopyranosid)
• Vykazuje minimální hladinu bazální exprese
- Pokud jsou proteiny netoxické dosahuje se vysokých výtěžků proteinů
růstem buněk do vysokých hustot s následnou indukcí aktivity promotoru.
- U toxických proteinů je nutná minimalizace bazální transkripce před
přídavkem indukčního činidla pomocí vhodného represoru.
Ribozom-vazebné místo
Transkripční
terminátor
Struktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coli
Struktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coli
Ribozom-vazebné místo: zahrnuje Shine-Dalgarnova (SD) sekvenci a
translační iniciační kodon
Vzdálenost mezi SD sekvencí a iniciačním kodonem AUG je 4-13 nukleotidů,
tato vzdálenost ovlivňuje účinnost iniciace translace (optimální vzdálenost je
4-8 nukleotidů), oblast bohatá na AT páry.
Transkripční terminátor T7 term, rrnT1,T2
(zabraňuje okluzi promotoru, zvyšuje stabilitu mRNA)
Výběr hostitelského kmene E.coli
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Indukce exprese rekombinantního proteinu v hostitelském
kmeni E. coli (BL21(DE3))
Výběr hostitelského kmene E.coli s ohledem
na toxicitu proteinu pro hostitele
Komerčně dostupné bakteriální kmeny s různými úrovněmi regulace
exprese, zajišťujícími snížení bazální exprese.
• Nutná přísná regulace expresního systému
• Toxicita není omezena na pouhý fakt, že je protein je pro buňku cizí,
ale může být způsobena i tím, že je nadprodukován určitý nativní gen.
BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
BL21
Různé úrovně minimalizace bazální exprese
üBL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
BL21
Cca 10 % hladina bazální exprese (před indukcí exprese) klonovaného
genu.
BL21(DE3)
üBL21(DE3)pLysS/E
BL21
Cca 1-3% hladina bazální (před indukcí exprese) exprese klonovaného
genu.
Různé úrovně minimalizace bazální exprese
• Expresní kmen obsahující plazmidy pLysS nebo pLysE umožňující přísnou regulaci
expresního systému využívající T7 promotor. Tyto plazmidy kódují lysozym, který se
váže na T7 RNA polymerasu a inaktivuje ji a snižuje tak bazální expresi.
BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
üBL21
• Indukce exprese infekcí bakteriofágem CEG (gen pro T7 RNA
polymerasu)
Různé úrovně minimalizace bazální exprese
Nejvyšší úroveň represe!!
Arabidopsis thaliana [gbpln]: 80395 CDS's (31098475 codons)
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 21.8(678320) UCU 25.2(782818) UAU 14.6(455089) UGU 10.5(327640)
UUC 20.7(642407) UCC 11.2(348173) UAC 13.7(427132) UGC 7.2(222769)
UUA 12.7(394867) UCA 18.3(568570) UAA 0.9( 29405) UGA 1.2( 36260)
UUG 20.9(649150) UCG 9.3(290158) UAG 0.5( 16417) UGG 12.5(388049)
CUU 24.1(750114) CCU 18.7(580962) CAU 13.8(428694) CGU 9.0(280392)
CUC 16.1(500524) CCC 5.3(165252) CAC 8.7(271155) CGC 3.8(117543)
CUA 9.9(307000) CCA 16.1(502101) CAA 19.4(604800) CGA 6.3(195736)
CUG 9.8(305822) CCG 8.6(268115) CAG 15.2(473809) CGG 4.9(151572)
AUU 21.5(668227) ACU 17.5(544807) AAU 22.3(693344) AGU 14.0(435738)
AUC 18.5(576287) ACC 10.3(321640) AAC 20.9(650826) AGC 11.3(352568)
AUA 12.6(391867) ACA 15.7(487161) AAA 30.8(957374) AGA 19.0(589788)
AUG 24.5(762852) ACG 7.7(240652) AAG 32.7(1016176) AGG 11.0(340922)
GUU 27.2(847061) GCU 28.3(880808) GAU 36.6(1139637) GGU 22.2(689891)
GUC 12.8(397008) GCC 10.3(321500) GAC 17.2(535668) GGC 9.2(284681)
GUA 9.9(308605) GCA 17.5(543180) GAA 34.3(1068012) GGA 24.2(751489)
GUG 17.4(539873) GCG 9.0(280804) GAG 32.2(1002594) GGG 10.2(316620)
Coding GC 44.59% 1st letter GC 50.84% 2nd letter GC 40.54% 3rd letter GC 42.38%
Escherichia coli K12 [gbbct]: 14 CDS's (5122 codons)
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 19.7( 101) UCU 5.7( 29) UAU 16.8( 86) UGU 5.9( 30)
UUC 15.0( 77) UCC 5.5( 28) UAC 14.6( 75) UGC 8.0( 41)
UUA 15.2( 78) UCA 7.8( 40) UAA 1.8( 9) UGA 1.0( 5)
UUG 11.9( 61) UCG 8.0( 41) UAG 0.0( 0) UGG 10.7( 55)
CUU 11.9( 61) CCU 8.4( 43) CAU 15.8( 81) CGU 21.1( 108)
CUC 10.5( 54) CCC 6.4( 33) CAC 13.1( 67) CGC 26.0( 133)
CUA 5.3( 27) CCA 6.6( 34) CAA 12.1( 62) CGA 4.3( 22)
CUG 46.9( 240) CCG 26.7( 137) CAG 27.7( 142) CGG 4.1( 21)
AUU 30.5( 156) ACU 8.0( 41) AAU 21.9( 112) AGU 7.2( 37)
AUC 18.2( 93) ACC 22.8( 117) AAC 24.4( 125) AGC 16.6( 85)
AUA 3.7( 19) ACA 6.4( 33) AAA 33.2( 170) AGA 1.4( 7)
AUG 24.8( 127) ACG 11.5( 59) AAG 12.1( 62) AGG 1.6( 8)
GUU 16.8( 86) GCU 10.7( 55) GAU 37.9( 194) GGU 21.3( 109)
GUC 11.7( 60) GCC 31.6( 162) GAC 20.5( 105) GGC 33.4( 171)
GUA 11.5( 59) GCA 21.1( 108) GAA 43.7( 224) GGA 9.2( 47)
GUG 26.4( 135) GCG 38.5( 197) GAG 18.4( 94) GGG 8.6( 44)
Coding GC 52.35% 1st letter GC 60.82% 2nd letter GC 40.61% 3rd letter GC 55.62%
Využívání kodonů E.coli (codon usage)
• Geny u prokaryot a eukaryot se vyznačují nenáhodným využíváním synonymních
kodonů.
• Kodony málo využívané u E. Coli se mohou hojně vyskytovat u heterologních genů
pocházejících z eukaryot, archebakterií aj.
• Frekvence využití synonymních kodonů obvykle odráží zastoupení jejich tRNA v
cytoplazmě.
http://www.kazusa.or.ip/codon/
Málo preferované kodony u E.coli
Exprese heterologní genů obsahujících málo preferované kodony vede k translačním
chybách !
• Předčasné ukončení translace (zkrácený produkt)
• Posunutí čtecího rámce (posun až o 2 AK v místě kodonu AGA)
• Záměna aminokyseliny - často arginin (kodon AGA) za lyzin
Makrides, 1996
Výběr hostitelského kmene E.coli
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RIL
•AGG/AGA (arginine,R), AUA
(isoleucine, I) and CUA (leucine, L)
fi
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RP
•AGG/AGA (arginine, R) and CCC
(proline, P)
firma Stratagene
•Rosetta or
Rosetta (DE3)
•AGG/AGA (arginine, R), CGG
(arginine, R), AUA (isoleucine, I)
CUA (leucine, L)CCC (proline), and
GGA (glycine, G)
firma Novagen
• Pro produkci genů obsahující velké množství kodonů, které jsou málo využívané
E.coli, je možné použít komerčně dodávané kmeny, které produkují tRNA málo
užívaných kodonů.
NEBO: Místně řízená mutageneze - záměna málo využívaného kodonu nebo syntéza
optimalizovaného genu (optimalizace pro produkci v jednom nebo více organismů s
ohledem na stabilitu RNA a vznik sekundárních struktur)
Plasmidy komplementující tRNA.
Degradace proteinu
Bakteriální proteolytický systém:
- E. coli obsahuje velké množství proteas, nejvíce v cytoplazmě
- Selektivně odstraňuje „abnormální“ proteiny:
• Nekompletní polypeptidy
• Proteiny se zaměněnými AK
• Nadměrně syntetizované podjednotky multimerních proteinů
• Proteiny poškozené oxidací nebo volnými radikály
• Cizí, rekombinantní proteiny (problémem jsou proteiny < 8 kDa)
Aminokyseliny redukující stabilitu heterologního proteinu
1. N-koncové pravidlo
• Stabilita proteinu je ovlivněna aminokyselinou, která následuje první
aminokyselinu polypeptidového řetězce (methionin).
• Aminokyseliny na této pozici redukují stabilitu proteinu:
Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr a Trp
• Poločas rozpadu proteinu pouze 2 min
2. Lysin ve vnitřní sekvenci poblíž N-konce proteinu
• Degradace ubiqutin-dependentními proteasami
3. PEST hypotéza
• Oblasti bohaté na Pro (P), Glu (E), Ser (S), Thr (T)
• Po fosforylaci PEST degradace proteinu Ca-dependentními proteasami
Výběr hostitelského kmene E.coli
Kmeny deficientní na proteasy
• Mutace, eliminující produkci proteas a tím proteolytickou
degradaci rekombinantních proteinů.
Expresní kmeny BL21 jsou deficientní na:
cytoplazmatickou proteasu lon
periplazmatickou proteasu ompT
Cílená exprese proteinu
Cytoplazmatická exprese
Periplazmatická exprese
Extracelulární exprese
(do kultivačního média)
Cytoplazmatická exprese
Výhody
• Vysoký výtěžek proteinu
• Jednodušší plazmidové konstrukty
• Inkluzní tělíska
Nevýhody
• Inkluzní tělíska
• Redukční prostředí
• Proteolýza
• Více komplexní purifikace
• Preferovaný způsob
Inkluzní tělíska
Nerozpustné shluky (cca 2mm3) složené z nativních proteinů s nízkou rozpustností, z
nesložených nebo z částečně poskládaných proteinů
Co způsobuje jejich tvorbu?
1. Prostředí v E.coli se liší od přirozeného prostředí ve smyslu redoxního potenciálu
(redukující prostředí v cytoplazmě E.coli), pH, osmolarity, absence chaperonů,
kofaktorů, absence post-translačních modifikací
2. Vysoká hladina exprimovaných proteinů
- exponované hydrofóbní domény nesbalených polypeptidových řetězců navzájem
(intramolekulárně) asociují
Inkluzní tělíska – nerozpustný proteinRozpustný protein
Výhody
• Snadná izolace ve vysoké čistotě a koncentraci
• Ochrana před proteasami
• Pro produkci proteinů, jejichž aktivita je pro buňku letální
Nevýhody
• Proteinová nerozpustnost
• Refolding pro opětné získání biologické aktivity
•Refolding nemusí vést k zaktivování proteinu
• Redukce výtěžku proteinu
Inkluzní tělíska
Možnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísek
Možnosti modifikace expresních podmínek:
• Snížení teploty kultivace bakteriální kultury
• Koprodukce chaperonů
• Použití fúzního partnera zlepšujícího rozpustnost (thioredoxin,
GST, MBP, NusA,…..)
• Výběr bakteriálního hostitele, např. kmene deficientního na
thioredoxin reduktasu
• a další….
Inkluzní tělíska
Rozpustný proteinExprese
rekombinantního
proteinu v E. coli
Izolace a následný
refolding
Modifikace expresních podmínek
Rozpustný protein
• Pokud protein obsahuje jeden nebo více disulfidických vazeb, správné poskládání
proteinu je stimulováno v hostiteli s více oxidujícím prostředí cytoplazmy.
•AD494 • Mutace v genu pro thioredoxinreduktasu (trxB)
•Origami • Mutace v genech pro thioredoxin
reduktasu (trxB) and glutathionreduktasu (gor)
Výběr hostitelského kmene E.coli
Možnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísek
Periplazmatická exprese
Výhody
• Jednodušší purifikace
• Není zde tak rozsáhlá proteolýza
• Oxidační prostředí v periplazmě umožňuje tvorbu disulfidických můstků/foldingu
Nevýhody
• Signální peptid nezajistí vždy transport do periplazmy (nižší výtěžek)
• Mohou se také tvořit inkluzní tělíska
• Periplazma obsahuje jen 4% všech buněčných proteinů (cca 100 proteinů)
• Transmembránový transport je zprostředkován signálním peptidem na N-konci
proteinu
•Prokaryotické signální peptidy úspěšně použité v E.coli (ompA, ompT z E.coli,
protein A z S. Aureus, endoglukanasa z B.subtilis)
• Signální peptid je po translokaci odštěpen
Extracelulární exprese
• Sekrece proteinů do kultivačního média
• Chybí účinná cesta pro transport skrz vnější membránu (E.coli sekretuje velmi
málo proteinů).
• Některé proteiny sekretované do periplazmy pasivně difundují do média.
• Zatím spíše neúspěšná manipulace s různými transportními cestami, které by
usnadňovaly sekreci cizího proteinu.
Výhody
• Minimální kontaminace ostatními proteiny (jednodušší
purifikace)
• Nejmenší hladina proteolýzy
• Zlepšení foldingu
Nevýhody
• Často velmi nízká sekrece
• Hodně zředěný protein
Modifikace růstových podmínek
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Podmínky kultivace
Možnosti modifikace podmínek kultivace bakteriální kultury E.coli za účelem
zvýšení produkce rozpustného proteinu:
Experimentálně se testuje:
• hodnota hustoty (OD) buněčné kultury
• Složení kultivačního média (pH, přídavek specifických substrátů,
kofaktorů, složení živin-bohaté či minimální média)
• teplota růstu bakterií, zejména teplota při indukci exprese
• koncentrace indukčního činidla
• délka indukce exprese
A. Smitkowska et al, 2020
Experimentální postup pro testování exprese
E. coli ER2566, TB medium pH 6.0, 3 h induction at 37°C, lysis buffer: MES pH 6.0 (28) or
Tris–HCl pH 7.5 (29)
A. Smitkowska et al, 2020
Příklad výsledku testování exprese
Strain 1: Rosetta 2; Strain 2: ER2566
73 %81 %30 %100%78 %71 %22°C/22°C
51 %81 %0100%73 %82 %37°C/22°C
076 %0100%85 %8 %
37°C/28°C
AHP6AHP5AHP4AHP3AHP2AHP1
t(°C)
Růst/indukce
Procenta produkce AHP proteinů v rozpustné formě
Testování exprese AHP proteinů v E. coli -optimalizace teploty
kultivace
Médium: LB médium, bakteriální kmen BL21(DE3)pLysS
Růst (OD600~0.5-0.6) Indukce 0,4 mM IPTG/3hodiny Celková produkce
Rozpustná forma
Produkce heterologních proteinů v kvasinkách
VÝHODY :
• snadné genové manipulace
• rychlý růst do vysokých hustot (fermentor), nízká cena
• schopnost posttranslačně modifikovat produkovaný protein
(glykosylace, tvorba disulfidických můstků)
• schopnost tvořit správnou konformaci proteinu
• schopnost extracelulárně sekretovat produkovaný protein
• konečný produkt bez kontaminace endotoxiny (lipopolysacharidy)
NEVÝHODY:
• používají strukturně odlišný typ N-oligosacharidů než savci
• hyperglykozylace
Kvasinkový expresní systém
- Sacharomyces cerevisiae (první kvasinkový systém použitý pro produkci
rekombinantních proteinů), Pichia pastoris (nejvyužívanější), Yarrowia
lipolytica, Kluyveromyces lactis
- P. pastoris - schopnost kultivace do vysokých hustot (S. cerevisiae produkuje
velké množství sekundárních metabolitů, které limitují dosáhnutí vysoké buněčné
hustoty)
- Od S. cerevisiae se liší typem N- glykosylace:
glykany u P. pastoris obsahují 8-17 molekul
manózy (spojené vazbou a 1,2), zatímco
glykany S. cerevisiae obsahují 50-150 molekul
manózy (terminální manózy spojené vazbou a
1,3 ) – tzv. hyperglykozylace (hypermanozylace)
• vysoký obsah manózy je
imunogenní pro člověka
• Savci využívají komplexnější
glykanové struktury k modifikaci (Nacetylglukosamin,
galaktóza, fukóza,
kyselina sialová)
• pro produkce terapeutických
proteinů byly vytvořeny P. pastoris
(např. kmen SuperMan5 a další) s
uniformním lidským způsobem N-
glykozylace
• dodatečné enzymy: manosidáza I a
II, transferáza galaktózy, Nacetylglukosaminů
a kyseliny sialové
• rozšíření použití P. pastoris např. pro
expresi protilátek
Odlišnost glykosylace v Pichia pastoris
Promotory:
• Inducibilní
Promotor genu pro alkohol oxidázu 1 (AOX1) –
silný a striktně regulovaný
-je plně potlačen při růstu na glukóze či glycerolu
a silně indukován při růstu na zdroji uhlíku- metanolu
• Konstitutivní
Promotor genu pro glyceraldehyd-3 – fosfát
dehydrogenasu (GAP)
- konstitutivně aktivní, aktivita při růstu na glukose
- 20-30 % celkového intracelulárního protein
(u obou typ; promotorů)
Selekční markery:
Auxotrofní HIS4
Komplementace auxotrofní mutace His
- selekce v kvasinkách
Rezistence vůči antibiotikům
Ampicillin – pro selekci v bakteriích
Sekreční signály
PHO1 (acid phosphatase) z P. pastoris
a-mating faktor (a-MF) z S. cerevisiae
SUC2 (invertase) z S. cerevisiae
Struktura vektoru pro účinnou expresi v P. pastoris
- transformace se provádí pomocí
integrujících se vektorů (vektory
replikující se po integraci do
chromozomu)
Klonování genu do vektoru, selekce
konstruktu v E.coli, izolace DNA
konstruktu
Linearizace konstruktu
Transformace kompetentních buněk
P. pastoris
Selekce transformantů
Exprese rekombinantního proteinu
Exprese rekombinantních proteinů v Pichia pastoris
Sekrece proteinů u kvasinek
Sekreční dráha je velmi podobná dráze vyšších
eukaryot.
N-terminální peptid pro kotranslační translokaci
sekretovaného proteinu do ER je odštěpen
signální peptidázou.
Příklady signálních sekvencí: Pho5, Suc2 a αmating
factor
Sekrece pomocí α- mating faktoru
Protein je společně se signálním peptidem – αMF
(α-mating factor) doménou exprimován v
jádře.
1. Signální peptid v α-MF doméně navede
protein do ER, kde je odštěpen signální
peptidázou.
2. Fúzní protein je transportován do Golgiho
aparátu, kde Kex proteáza štěpí zbytek α-MF
domény a protein je sekretován do média.
• Buď intracelulární exprese nebo sekrece do média
Produkce heterologních proteinů v hmyzích buňkách
(Hmyzí buňky s bakulovirovými vektory)
VÝHODY :
• Zajištění nativní konformace proteinu
• Posttranslační modifikace
• Není kontaminace endotoxiny (lipopolysacharidy)
• Protein může být produkován intracelulárně nebo sekretován do média
NEVÝHODY:
• Negativní efekt infekce bakulovirem na životnost buněk
• Heterologní geny nejsou produkovány kontinuálně (každá exprese vyžaduje
novou infekci buněk bakulovirem)
• Způsob glykozylace odlišný od savčích buněk (není tak komplexní)
• Nižší výtěžnost, časově náročné, drahé média, těžší na manipulaci (možnost
kontaminace)
Co je bakulovirus?
• obalený, ds DNA virus s
kapsidou tyčinkovitého tvaru
• během životního cyklu existuje
ve dvou rozdílných formách
“pučící virus“ a opouzdřený
virus
• vysoce druhově specifické infikují
jen bezobratlý hmyz
• mezi nejčastější hostitele patří
nedospělé larvální formy hmyzu
• k nejvíce prostudovaným a
využívaným bakulovirům patří
virus AcMNPV (Autographa
californica multiple nuclear
polyhedrosis virus)
Bakulovirový expresní systém
• - hostitelské hmyzí buňky
- ovariální buňky motýlů
druhu Spodoptera frugiperda (Sf9,
Sf-21)
• bakulovirový vektor (tzv. bakmid)
- velký, kyvadlový vektor
(AcMNPV)
- obsahuje všechny geny
nezbytné k produkci virových
částic
• velmi silný promotor
polyhedrinového genu (polyh)
- založený na infekci kultivovaných hmyzích buněk rekombinantním virem AcMNPV
(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) nesoucím gen pro tvorbu
cílového proteinu.
Produkce heterologních proteinů v hmyzích buňkách
(Hmyzí buňky s bakulovirovými vektory)
• Hlavní technologie pro přípravu membránových proteinů,
proteinových komplexů, složených z více podjednotek.
• Bakulovirus je nepřekonatelný, pokud jde o velikost „nákladu
DNA“, který může nést a přenášet do hmyzích buněk (až 17
podjednotek multiproteinového komplexu bylo úspěšně
koexprimováno v hmyzích buňkách).
• Nové technologie molekulárního klonování – Zlatá Gate
(GoldenBac), Gibsonovo sestavení PCR fragmentů (biGBac),
Cre-lox rekombinace (MultiBac)– umožňují efektivní
multigenové sestavení v genomu bakuloviru.
transformace
místně specifická
transpozice
Izolace
rekombinantního
bakmidu
Transfekce hmyzích
buněk
Bac-to-Bac expresní systém : „from Bacterium to Baculovirus“
Selekce pomocí antibiotik
Modrobílý test
• Po úspěšné transfekci, rekombinantní virové částice jsou získány z média (virový zásobní stock) a mohou
být amplifikovány do vyšších množství, aby mohly být použity pro infekci velkého množství buněk.
Po dvou generacích je dosaženo titru 106 - 108 pfu/ml
Bac-to-Bac expresní systém: „from Bacterium to Baculovirus“