Purifikace rekombinantních proteinů Purifikace proteinu z komplexní směsi makromolekul přítomných v biologickém vzorku • Několik tisíc proteinů z různými vlastnostmi (~5000-8000) a v různých množstvích (aktin ~ 10%, unikátní trankripční faktor < 0,001% z celkového množství proteinů) • DNA, RNA, polysacharidy, lipidy Analýza buněčného extraktu 2D elektroforézou Dezintegrace biomasy Fyzikální metody: sonikace ultrazvukem, tlakem v přístroji French press, osmotický šok, střižné síly v různých typech mlýnků a homogenizátorů - při sonikaci či mechanických metodách nutno chladit! Chemické: detergenty, chelátory v lyzačních pufrech, organická rozpouštědla - látky mohou interferovat s následnou purifikační metodou Enzymatické: nutno volit podle expresního systému Lysozym pro bakterie, lytikázu nebo zymolázu (glukanázy) pro kvasinky. Při všech lyzačních postupech dochází k destrukci buněk a uvolnění jejich obsahu včetně proteolytických enzymů. Proto je vhodné do lyzačního pufru přidávat inhibitory proteáz, které v průběhu dezintegrace i dalších kroků zabrání degradaci produktu. Než začneme……………………… 1.Proč??? Pro jaký účel ? 2. Jak??? Jak protein detekovat? 3. Co??? Jaké vlastnosti má protein ? 1. Proč??? Pro jaký účel ? Aplikace Množství Čistota Poznámka Identifikace 0,002-0,2 mg vysoká (>95%) • Edmanovo odbourávání (5-10 pmol), přístupy hmotnostní spektroskopie (0,2-1 pmol) Produkce protilátek mg-mg střední-vysoká • Pro imunizaci: ~ 0,1 mg proteinu • Čím větší čistota tím větší a rychlejší šance pro zisk vysoce specifické imunitní odpovědi. Enzymologie 1-5 mg vysoká > 95 % • Množství proteinu závisí na citlivosti analýzy. • Čistota závisí na specificitě analýzy a ovlivnění výsledků analýzy kontaminacemi. Biofyzikální studie mg vysoká (>95%) • CD spektroskopie, rezonance povrchových plasmonů, fluorimetrie, analytická ultracentrifugace, UV spektroskopie 3D struktura (krystalizace, NMR) 10-20 mg vysoká (>95%) • Hledání krystalizačních podmínek ~ 1-2 mg proteinu, zisk krystalu o velikosti dostatečné pro rentgenovou difrakci 5-10 mg proteinu • Pro první 1-D NMR spektra se vyžaduje ~ 0,5 mmol proteinu, protein (velikost 5-20kDa) značený 15 N / 13C je nutný pro vyřešení struktury. Farmaceutické účely mg-kg vysoká (99,9%) • Pro klinické účely nesmí proteiny obsahovat pyrogeny a bakteriální toxiny a musí být velmi stabilní kvůli dlouhodobému skladování. 2. Jak??? Jak protein analyzovat? 1. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za denaturujících(SDS PAGE) nedenaturujících podmínek (NATIVE PAGE) se specifickou detekcí : Detekce proteinu zájmu během jeho purifikace • Pomocí protilátek Sledování biologické aktivity proteinu během purifikace • U enzymů např. barvení v gelu pomocí chromogenních substrátů SDS PAGE s následných westernovým přenosem nativní PAGE, zymogram 28% čistota 80% čistota 95% čistota 2. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za denaturujících podmínek (SDS PAGE) s nespecifickou detekcí • Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,... • Sledování čistoty purifikovaného proteinu 2. Jak??? Jak protein analyzovat? Nativní PAGE Dimer Monomer 3. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za nativních podmínek s nespecifickou detekcí • Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,... • Sledování homogenity purifikovaného proteinu 4. Stanovení koncentrace proteinu • Nejvíce využívané metody: dle Bradfordové, Lowryho metoda,…. 2. Jak??? Jak protein analyzovat? 3. Co??? Jaké vlastnosti má protein ? Informace o proteinu zájmu a příbuzných proteinech z databází nebo z pilotních experimentů: • Velikost proteinu (SDS PAGE) • Izoelektrický bod (izoelektrická fokusace) • Stabilita (pH, teplota, přítomnost solí, inhibitorů proteas, additiv zajišťujících rozpustnost proteinu) 2D a nativní PAGE • Komplexita vzorku, vlastnosti proteinu zájmu a i ostatních kontaminujících proteinů Informace o proteinu zájmu a o příbuzných proteinech z literatury: • Strategie purifikace (metody, pufry, stabilita proteinu, …..) Vlastnosti/purifikační metody Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vysoké pH Stabilita teplotní precipitace Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie) pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie Specifická vazba afinitní chromatografie Afinitní chromatografie - specifická vazba mezi molekulami - protein zájmu je translačně fúzovaný s tzv. afinitním tagem/kotvou (např. polyhistidin, glutathion-S-transferáza, atd.). - nejčastěji se jedná o specifickou interakci afinitních fúzních tagů s ligandy (např. kov, redukovaný glutathion, atd.) v chromatografických matricích Iontově výměnná chromatografie - separace na základě celkového náboje Stacionární fáze: média s kationtovými a aniontovými skupinami Mobilní fáze: opačný iont přidaný do pufrů. Gradient se zvyšující se koncentraci soli (NaCl) Cl- kompetuje s proteinem o vazbu na matrici Iontově výměnná chromatografie Funkční skupiny používané na iontoměničových matricích Anex (anion exchanger) Quaternary ammonium (Q) strong -CH2-N+-(CH3)3 Diethylaminoethyl (DEAE)* weak -CH2-CH2-N+-(CH2-CH3)2 Diethylaminopropyl (ANX)* weak -CH2-CHOH-CH2-N+-(CH2-CH3)2 Katexy (cation exchanger) Sulfopropyl (SP) strong -CH2-CH2-CH2-SO3Methyl sulfonate (S) strong -CH2-SO3Carboxymethyl (CM) weak - CH2-COO- Hydrofóbní chromatografie Používané ligandy - vzorek aplikován v pufru s vysokou koncentrací solí - sůl snižuje solvataci a exponují se hydrofobní oblasti - separuje molekuly na základě rozdílů v jejich hydrofobicitě Gelová permeační chromatografie (gelová filtrace) • Gelová permeační chromatografie rozděluje proteiny na základě velikosti a trojrozměrného tvaru. • Matrice složená z kulatých porózních částic, na které se molekuly proteinu neváží. • Molekuly se pohybují skrz porézní kuličky. Menší molekuly difundují do pórů kuliček a proto se pohybují pomaleji, zatímco větší molekuly vstupují do pórů kuliček méně nebo vůbec proto se pohybují rychleji. Kolik purifikačních kroků je potřeba? Obohacení vzorku cílovým proteinem, zakoncentrování a stabilizace cílového proteinu Odstranění většiny nečistot – jiné proteiny, nukleové kyseliny……, další zakoncentrování cílového proteinu Dosažení vysoké čistoty cílového proteinu-odstranění drobných nečistot, proteinů podobných vlastností purifikační kroky Čistotaproteinu ZISK CÍLOVÉHO PROTEINU DALŠÍ PURIFIKACE DOČIŠTĚNÍ PŘÍPRAVA VZORKU PRO CHROMATOGRAFII Odstranění nesolubilních podílu hrubého extraktu, lipidů Rychlost Rozlišení Kapacita Výtěžek Logická kombinace purifikačních kroků Rozlišení je rozsah separace mezi dvěma chromatografickými píky (bez dostatečného rozlišení nedochází k separaci proteinů). Kapacita (max.) je maximální množství vzorku, které může být navázáno na chromatografickou kolonu. Rychlost kroku je důležitá zejména v kvůli možné degradaci cílového proteinu působením proteas v komplexním vzorku. Výtěžek-minimalizace ztráty proteinu během purifikace. Každá separační technika je vyznačuje rovnováhou mezi čtyřmi parametry. Rozlišení Rychlost Kapacita Výtěžek Zisk cílového proteinu z proteinového extraktu Cíl: rychlá izolace, stabilizace a zakoncentrování. Purifikační techniky: afinitní chromatografie iontoměničová chromatografie hydrofóbní chromatografie Rozlišení Rychlost Kapacita Výtěžek Další purifikace proteinu Cíl: Dále separovat a zakoncentrovat cílový protein. Purifikační techniky: iontoměničová chromatografie hydrofóbní chromatografie V tomto kroku se využívá eluce kontinuálními gradienty. Tento krok není vždy potřebný. Rozlišení Rychlost Kapacita Výtěžek Dočištění proteinu a úprava podmínek pro jeho skladování (pH, soli, additiva) Cíl: Zisk produktu o požadované vysoké čistotě. Odstranění stopových kontaminací, odstranění velmi podobných proteinů, fragmentů či agregátů cílového proteinu Purifikační techniky: gelová permeační chromatografie K odstranění molekul stejné velikosti je třeba využít jiných možností purifikace jako iontoměnič nebo hydrofóbní chromatografii. His-tagged protein purification 1 krok 2 kroky 3 kroky IMAC Immobilized-metal affinity chromatography IEX Ion exchange chromatography SEC Size Exlusion chromatography Základní zásady pro pořadí purifikačních kroků Základní zásady pro pořadí purifikačních kroků • Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením ® velké množství levného vstupního materiálu. • Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná ® ve vzorku již investovaná práce, množství proteinu je menší. • Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků, jako je výměna pufru mezi jednotlivými separačními technikami příklad: po precipitaci síranem amonným nebo iontoměničové chromatografii (protein je eluován z kolony za vysokých koncentracích soli) zařadit hydrofóbní chromatografii (vzorek dávkován na kolonu ve vysoké koncentraci soli) • Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat. • Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu a rychlost purifikace. Fúzní proteiny (tagované proteiny) Translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a a) krátký peptid [př. (His)n, (Asp)n, (Arg)n ... ] b) přirozený oligopeptid [př. MBP, GST, thioredoxin …] - expresní plazmidy obvykle obsahují různé tagy/kotvy - umístění na N- i C- konci proteinu Ø Zvýšení výtěžku rekombinantního proteinu Ø Možnost detekce proteinu Ø Lokalizace – signální sekvence pro transport proteinu Ø Usnadnění purifikace rekombinantního proteinu Proč využívat tagy? Fúzní partner Velikost Umístění Využití His-tag 6, 8, or 10 aa N- or C- terminus Purification, detection Thioredoxin 109 aa (11.7 kDa) N- or C- terminus Purification, solubility enhancement Calmodulin-binding domain (CBD) 26 aa N- or C- terminus Purification Avidin/streptavidin Strep-tag 8 aa N- or C- terminus Purification, secretion Glutathione S-transferase (GST) 26 kDa N-terminus Purification, solubility enhancement Maltose binding protein (MBP) 396 aa (40 kDa) N- or C- terminus Purification, solubility enhancement Green fluorescent protein (GFP) 220 aa (27 kDa) N- or C- terminus Localization, detection, purification Poly-Arg 5-16 aa N- or C- terminus Purification, solubility enhancement N-utilization substance A (NusA) 495 aa (54.8 kDa) N-terminus Solubility enhancement Ø Zvýšení účinnosti iniciace translace (př. GST, MBP, NusA…) - Výhoda N-terminálních tagů - Poskytují spolehlivou sekvenci pro účinnou iniciaci translace Ø Ochrany před proteolytickou degradací Ø Pomáhají při skládání (foldingu) proteinu a zvyšují tak rozpustnost cílového proteinu Zvýšení výtěžku rekombinantního proteinu Tagy zvyšující výtěžek jsou proteiny nebo peptidy zapojené do: Kotvy/tagy zvyšující rozpustnost Ø N –terminální tagy Ø Spíše proteinové (vysoce solubilní proteiny) než peptidy Ø Fúze se solubilním partnerem často pomáhá fúznímu partnerovi se správně poskládat, což vede ke zlepšení rozpustnosti cílového proteinu Ø Nemají univerzální efekt Ø Mechanismus, jakým působí není plně objasněn Schéma exprese a purifikace za použití solubilitu zvyšujících kotev. (Esposito and Chatterjee, 2006). Zlepšení rozpustnosti rekombinantních proteinů Esposito and Chatterjee, 2006 Tagy zvyšující rozpustnost – mechanismus působení Maltose binding protein (MBP) se pravděpodobně váže reverzibilně na exponované hydrofóbní oblasti nově vznikajících polypeptidů a pomáhá tak polypeptidu získat nativní konformaci mechasnismem podobným chaperonům. Příklady možných mechanismů NusA zpomaluje translaci tím, že zprostředkovává transkripční pauzy, což může pomoci správnému poskládání cílového proteinu. Negativně nabité tagy (peptidy) - dochází k elektrostatickému odpuzování mezi nově vznikajícími polypeptidovými řetězci, čímž se zabraňuje jejich agregace (Zhang et. 2004) . Thioredoxin – oxidoreduktáza Rychlá redukce intra- i inter- molekulárních disulfidických vazeb. Thioredoxin slouží jako kovalentně navázaný chaperon nezávisle na redoxní aktivitě. Kotva (tag) Typ chromatografie Princip separační techniky Poly [His] afinitní vazba na kov IgG vazná doména afinitní vazba na protilátku Poly [Asp] iontoměničová vazba na anion vázající matrici Poly [Phe] hydrofóbní vazba na hydrofóbní matrici Strep-tag afinitní vazba na streptavidin Poly [Arg] iontoměničová vazba na kation vázající matrici Fúzní kotvy (tagy) využívající se k purifikaci Metalochelatační afinitní chromatografie • R.1975- uveřejnil Porath a kol. metodu frakcionace sérových proteinů. • Konstrukce umělých oligohistidinových domén (poly [His]) fúzovaných k Nnebo C- konci proteinu metodami molekulární biologie. • Nyní jeden ze základních purifikačních postupů rekombinantních proteinů. •Interakce proteinu s matricí je zprostředkovaná neobsazenými d-orbitaly iontů přechodných kovů, které vážou volné elektronové páry převážně z dusíkového atomu imidazolových skupin histidinových zbytků v proteinu. Podpůrná matrice (agarosa) „oddělovací raménko“ Funkční/reaktivní skupina Ligand (Ni2+) Protein s histidinovou kotvou Matrice pro metalochelatační afinitní chromatografii Podpůrná matrice (porózní polysacharidové částice- agarosa) „oddělovací raménko“ Funkční/reaktivní skupina Ligand (Ni2+) Protein s histidinovou kotvou „oddělovací raménko“ ØSnížení stérických zábran a umožnění optimálního navázání rekombinantního proteinu na imobilizovaný ligand Efekt kovového iontu navázaného na matrici Síla vazby: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~ Co2+ Zn2+ Ni2+ Co2+ Cu2+ ØPufry o pH 7-8 pro optimální navázání rek. proteinu na kovovým iontem v matrici Ø Pufry s vysokou koncentrací solí (0.5–1 M NaCl) – redukce nespecifických elektrostatických interakcí. ØNeiontové detergenty a glycerol redukují nespecifické hydrofóbní interakce. Ø Eluce kontaminujících proteinů se dosahuje snížením pH nebo nízkou koncentrací imidazolu. Ø Eluce cílového His-tagového proteinu je dosažena při vysoké koncentraci imidazolu (0-0.5 M), větším snížením pH nebo přídavkem EDTA. Metalochelatační afinitní chromatografie Purifikace za nativních podmínek Metalochelatační afinitní chromatografie Purifikace za denaturačních podmínek Denaturační IMAC – purifikace proteinů v inkluzních tělíscích Purifikace za vysokých koncentrací močoviny nebo guanidinium chloridu čistý protein, ale porušení kvartérní struktury (postačí však např. na imunizace) Zisk nativního konformeru: - Nutné pro měření enzymové kinetiky, rtg analýza,… - Eluce proteinu z kolony a jeho renaturace dialýzou nebo výrazným zředěním v renaturačních pufrech (pufr podporující správné složení proteinu) - Renaturace enzymu vázaného na matrici: Gradient z denaturačních do renaturačních pufrů Pulzní renaturace Jakýkoliv tag může ovlivnit biologickou aktivitu proteinu, může bránit proteinu krystalizovat, zvyšuje proteinovou velikost (protein je pak např. příliš velký pro NMR), proteiny se mohou stát imunogenní díky tagu (problém u terapeutických proteinů). Odstranění fúzních kotev Možnosti odstranění fúzních kotev Ø Chemické štěpení Ø Samoštěpení Ø Enzymatické štěpení Ø málo se využívá Bromkyanid Met/X Hydroxylamin Asn-Gly Odstranění fúzních tagů-chemické štěpení Amino – acid sequence of the P. falciparum C-terminal segment of CSP (PfCSP C-ter) fused to a purification tag (Rais-Beghdadi et al., 1998). M28V M105V M12 M15 Ø Nešetrná, ale velmi účinná metoda Ø Spíše nespecifická Ø Může vést k denaturaci a modifikaci cílového proteinu Odstranění fúzních tagů - samoštěpení Ø Použití tzv. samo- štěpícího se tagu Inteiny (inteins, intervening proteins) jsou proteinové segmenty, které mají schopnost se samy vyštěpit z proteinových prekurzorů. Inteiny Perler, (2005) Ø Vnesením mutací na N- nebo C- konce inteinu vznikly tzv. samoštěpící tagy odvozené od inteinů (štěpí se pouze na jenom místě). Odstranění fúzních tagů – proteolytické štěpení Specifické proteolytické štěpení: Ø Exopeptidázy Ø Endopeptidázy Exopeptidázy (aminopeptidázy and karboxypeptidázy): ØAPM, CPA a CPB štěpí postupně po jedné aminokyselině z N- nebo C-konce proteinu až ke specifickému místu, které je signálem pro ukončení štěpení (stop site). Arnau et al., 2006 TAGZyme system (Qiagen): Ø DAPáza (dipeptidyl aminopeptidáza I) TAGZyme stop sites Odstranění fúzního partnera - proteolytické štěpení Endopeptidázy Ø Štěpící místo pro endopeptidázy mezi fúzním tagem a cílovým proteinem. Ø Nespecifické štěpení - produkt štěpení je doporučeno vždy ověřit pomocí MS analýzy. Ø Optimalizace proteolytického štěpení fúzního proteinu (poměr enzym substrát, teplota, pH, koncentrace solí, délka štěpení, modifikované proteolytické enzymy) Ø Po odstranění tagu může docházet k precipitaci cílového proteinu. Ø Účinnost štěpení (může být snížena kvůli stérickým efektům nebo agregaci - vložení krátkých linkerů mezi proteázové místo a fúzní tag) Ø Re-purifikační krok nutný pro oddělení cílového proteinu od fúzního tagu Ø Modifikace cílového proteinu (po štěpení některými proteázami, např. thrombinem, TEV, Precision zůstává jedna nebo dvě aminokyseliny připojené k cílovému proteinu. Odstranění fúzních tagů – proteolytické štěpení Enterokináza Asp-Asp-Asp-Asp-Lys/X One-step purification of maize b-glucosidase Ø Perfusion matrix: POROS MC/M Ø Functional group: iminodiacetate, metal ion Zn2+ Ø Removing contaminated proteins: linear gradient of imidazole (0–50 mM) and pH (pH 7- 6.1) Ø Protein elution: 0.1 M EDTA Ø 80% recovery, 95 fold purification Ø Common production and isolation of wild type protein and soluble mutant form for enzymatic measurements and crystallization. His-tagged protein and IMAC under native conditions (Zouhar et al., 1999) Metalochelatační afinitní chromatografie Gelová permeační chromatografie Anion výměnná chromatografie 15% SDS PAGE 15 % SDS PAGE10% NATIVE PAGE 10% NATIVE PAGE 66 kDa 45 kDa 36 kDa 29 kDa 24 kDa 20 kDa 14 kDa Pufr: 20 mM Tris pH 7.9, 250 mM NaCl Isokratická eluce Pufr: 20 mM Tris pH 7.9 Gradientová eluce: 0 - 1M NaCl Pufr: 50 mM Tris pH 7.9, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, 20 mM imidazol, 3.9 mM merkaptoethanol Gradientová eluce: 20 -500 mM imidazol Purifikace proteinu AHP2 (Arabidopsis histidin phosphotransfer protein 2) 3. Affinity purification after TEV cleavege CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradient18 08 2011:10_UV CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradient18 08 2011:10_Conc CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradient18 08 2011:10_Fractions CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradient18 08 2011:10_Inject 0 20 40 60 80 100 %B 0 20 40 60 80 100 %B 0 20 40 60 80 100 ml 1A11A31A51A71A9 1A12 1B31B51B71B9 1B12 1C31C51C71C9 1C12 1D31D51D71D9 1D12 1E31E51E71E9 1E12 Waste CKI1RD pETM-60::CKI1RD pETM-60 200 mM imidazole 20 mM imidaz. S uperdex75 1660Valve7 14 09 2011:10_UV Superdex75 1660Valve7 14 09 2011:10_Fractions Superdex75 1660Valve7 14 09 2011:10_Inject 0 50 100 150 200 mA U 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 ml A 1 A2 A3 A4 A 5 A6 A7 A8 A 9A 10 A12 A 14 B 1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B 8 B9B 10 B12 B14 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9C10 C12 C14 Waste 10 CV pETM-60 CKI1RD pETM-60::CKI1RD after cleavege 4. Size-exclusion chromatography 1 L→ ~10-20 mg for TB and M9 His-tagged protein and IMAC under native conditions Four-step purification of Arabidopsis CKI1RD 1. Affinity purification (IMAC) 2. Tag removal (TEV protease) 3. Affinity purification (IMAC) 4. Size exclusion chromatography Pekárová B. Ub-SGSG-HisTag-SA-TEV-AME-CKI1