Central European Institute of Technology /4NAÍ BRNO I CZECH REPUBLIC Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky £^2> 1. Základní pojmy 2. Historie a princip MALDI-TOF MS 3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 4. MALDI-TOF MS profilování v klinické diagnostice 5. Vývoj nové aplikace MALDI-TOF MS profilování 2 Základní pojmy Bílkoviny = Proteiny Přehled základních aminokyselin Aminokyselina: alanin (Ala) valin (Val) leucln (Leu) H3C\ lť-C\ CH OH NH, H3C ^CH OH CH CH OH CH3 NH, Isoleucin (lie) m 0 H3C ^CH CH2 ^CH OH prolin (Pro) H / ~^ch' ^OH Phenylalanin (Phe) ,CH .ch2 ,d H(T >%ír ^CH ^OH HC ^řCH NH2 CH tryptofan (Trp) jj --CH ^CH2 HC*^ -C ""CH ^OH HC^ ^C. ^CH NH2 ^CH NH methionin (Met) /S\ /CHl /C\ H3C Ofe CH OH NH2 glycin (Gly) 2Nvv~CH"2' ^OH serln (Ser) CH2 C HO^ VCH ^OH threonin (Thr) NH2 CH i O HO ^CH OH tyrosin (Tyr) Htr ^{7 ^CH OH C ^CH NH2 HO CH asparagin (Asn) glutamln (Gin) O NH2 NH2 O O-^ CH2 ^CH ^OH cystein (Cys) CH2 /C HS^ CH OH NH2 selenocystein (Sec) ch2 c HSlT ~~CH ^OH NH2 kyselina asparagová (Asp) jj HO CH2 A 1. Základní pojmy 2. Historie a princip MALDI-TOF MS 3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 4. MALDI-TOF MS profilování v klinické diagnostice 5. Vývoj nové aplikace MALDI-TOF MS profilování Princip MALDI-TOF MS - MALDI-TOF MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - - Time of Flight Mass Spectrometry Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací s průletovým analyzátorem Princip MALDI-TOF MS Analýza intaktních molekul Hmotnostní spektrum ^or 300 250 200 150 100 50 66431 V, 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 m/z 9 Princip MALDI-TOF MS Objevitelé Michael Karas, Franz Hillenkamp 0.^ ,OH MALDI matrice: OH 0^ OH CH—O OH O— CH, 0^ OH Koiči Tanaka nano-kobalt, glycerol OH Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F., int. J. Mass. Spectrom. Ěon Proc. 78 (1987) 53. Tanaka K., Waki H. Ido Y., Akita S. Yoshida Y. Yoshida T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 2. 10 Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky £^2> 1. Základní pojmy 2. Historie a princip MALDI-TOF MS 3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 11 4. MALDI-TOF MS profilování v klinické diagnostice 5. Vývoj nové aplikace MALDI-TOF MS profilování Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Stanovení počtu modifikací proteinu: albumin 12 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Stanovení počtu modifikací proteinu: EITEC Působení inhibitorů deacetyláz na histony Chronická lymfatická leukémie healthpic.tk spolupráce: IHOK, MU Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Stanovení počtu modifikací proteinu: Působení inhibitorů deacetyláz na histony c CD H—i - 1000 i 800 - 600 - 400 - 200 - 5794 A42 Ac 5836 5878 A42 <Ä?J 5920 N-teminalni cast histonu H4 nádorové buňky vs. nádorové buňky + Entinostat 5600 5700 5800 5900 6000 6100 6200 Činčárová L., Lochmanová G., Nováková K., Šultésová R, Konečná H., Fajkusová L., Fajkus J. Zdráhal Z., Mol BioSys 5(2012) 2937. 6300 m/z 14 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování Proteolýza pomocí enzymů gly-arg-gly-glu-leu-val-ile-ser-ile-ser-ala-leu-ile-val-glu-tyr-gln-arg-pro-trp^ mm y y . ,>vAVn|6-6jB-n|6-siM-jas-9|i-jes-sA|-na|-a|i-dse-usB-B|B-dse-eL|d-N^> co T3 \* V M ¥ '-lys-cys-his-arg-ile-ser-his-gli^le-asp-his-glu-leu-pro-gli^asp-arg-trp^ala A A hi I Ami c, Sequencing Grade I Trypsin Gold, Sequencing Grade Modified Trypsin. Immobilized Trypsin O Glu-C. Sequencing Grade I Chymotrypsin, Sequencing Grade » Q Asp-N. Sequencing Grade H Endoproteinase Lys-C, Sequencing Grade/rlys-C, Mass Spec Grade 15 Převzato z www.promega.com Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování ^« Detekce peptidů pomocí MALDI-TOF MS 2 5 0 0 — 1 5 0 0 — 1 4 7 * 4JwMéNHMP*mJL 1 n h ^ p, f, -1- I 2 4 -j S 7 -1- -1- 14 7 9 7 5 1 5 d 7 7 t 16 5 9 9 U 2 0 4 5 0 6 16 6 7 7 & 1 -S 2 "5 "J O I 4 f> & 4 Ái.....L.....*L I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- iOO 1100 1600 2100 m/z 16 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování Databázové vyhledávání ^Qr I molekulová I hmotnost I peptidů 17 proteáza modifikace Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování Databázové vyhledávání ^Qr (science) Mascot Search Results User Email Search title Database Taxonomy Timestamp Top Score ondra sedogpost.cz HCBInr 20070326 (4761919 sequences; 1643090755 residues) Maomialia (mamnals) (572832 sequences) 6 Apr 2007 at 14:54:43 GMT 246 for gi|30794200, albumin [Bos taurus] Probability Based TYTowse Score Protein score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event. Protein scores greater than 70 are significant (p<0.05). 1 II. ■ ■ 40 80 120 160 200 240 Probability Based tlowse Score Concise Protein Summary Report Format As | | Concise Protein Summary Help Significance threshold p< |P.D5 J Max. number of hits |l 9 Re-Search All Serum albumin precursor (Allergen Eos d 6) (E5A) giI 229552 Mass: 6608B Score: 190 Expect: 5.7e-14 Queries matched: 16 albumin Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS = tandemová hmotnostní spektrometrie Výběr prekurzorového iontu ^or [Abs. Int. * 1 000] 3.0-2.8-2.6-2.4-2.2-2.0-1.8-1.6-1.4-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4-0.2. 0.0- 927.512 161-167 649.360 841.485 223-228 483-489 iL 1386.562 286-297p- 1362.621 89-100 1305.664 402-412 I 1283.664 361-371 I 1249.571 35-44 1 1 63.587 66-75 1439.763 360-371 1479.750 421-433 1567.707 34Í359 fcf|Mf »f Dutu 1667.784 469-482 I 639.901 437-451 1888.945 169-183 I 1850.870 529-544 I 1823.899 508-523 MMMR 2045.057 168-183 1~ ' 8(J0 iobo' 'i2bo 1 4 i6bo' f 'isbo' 2obo' 22 m/z 19 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS Izolace prekurzorového iontu Field free drift region Sample t=D^jm/2zV HV etector O V/VP o v TOF —> v O v Ví tp Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ^ Izolace prekurzorového iontu °"<}^ ^x104 CD C/3 £Z CD 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 H 0.0 1567.69 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z 21 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ^ Analýza MS/MS, hmotnostní spektrum fragmentů A-j A2 A3 A4 A5 A6 ^ x104- C/í OJ H—' ^ 5H 175.131 120.084 70.054 334.176 262.174 Ujjjji 200 ilJ lid 4 425.233 JtJIlJ i A, A2A3A4A5A6 A^ A3A4A5A6 A1A2A3 A4A5A6 A-j A2 A3 A4 A5 Ag A1A2A3A4A5 A6 591 297 478.214 " 720.335 uLtLfcuiAlill 830.374 977.399 1121.437 400 600 800 1452.530 1381.500 1567.710 1000 1200 i .i.......ilJ 1400 1600 m/z 22 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ^ Databázové vyhledávání ^or ^^^^^^^^^^^^^^^^M MS/MS Ions I ? II X I ■ a i jejich MS/MS frag imentů modifikace kDa ttC13: [Ö TJ Partials < TJ MS/MS Tol: I06 1 Da Charge state: 1 + Dat. Query Data: 31 (* Monoisotopic P Average DAMS data\200S\05 maiA080519\B S A_dT VPMF_LIFT.wrnl \~ Search unmatched peaks only Instrument: MALDI-TOF-TOF 3 W D ecoy ■ Results- V Overview Report top 120 w| nj(s I- On Import check matching MSMS only -Fragmentation— f CID (~ ETD C CID ETD combined (needs Mascot 2.2] ETD parameters.. Copy Peaklist Copy Masslist Save as default Start Exit 23 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ^ Databázové vyhledávání ^or Muscat Score Histogram Ions score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores > 53 indicate peptides with significant homology. Individual ions scores > 58 indicate identity or extensive homology (p<0.05). Protein scores are derived from ions scores as a non-probabilistic basis for ranking protein hits. " 5 1^^^^^^ Protein Score Peptide Summary Report Format As | | Peptide Summary ^ Significance threshold p< |o.05 Help Select All Max. number of hits |auto Standard scoring n MudPIT scoring r i01ls score 0r expect cut-off |o Show sub-sets F Show pop-ups «• Suppress pop-ups r Sort unassigned | Decreasing Sa Require bold red f Preferred taxonomy |aii entries Select None Search Selected PElTOl' tolei'Slllt ~3 1. cfi 1229552 Mass 66088 Sc<>ie 120 Matches 1(1) Sequences 1(1) albumin r Check to include this hit in error tolerant search Proteins matching the same set of peptides: cfi I 1351907 Mass: 69248 Score: 120 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) RecName: Full-Serum albumin; AltName: Full-BSA; AltName: Allergen-Bos d 6; Flags: Precursor cfi | 30794280 Mass: 69278 Score: 120 serum albumin precursor [Bos taurus] cfi 174267962 Mass: 6919 0 Score: 12 0 ALB protein [Bos taurus] qiI 76445989 Mass: 53890 Score: 120 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) serum albumin [Bos indicus] cfi I 154425704 Mass: 69248 Score: 120 ALB protein [Bos taurus] cfi I 367460260 Mass: 6 6420 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) Matches: 1(1) Sequences: 1(1) Matches: 1(1) Sequences: 1(1) Matches: 1(1) Sequences: 1(1) Score: 12 0 Chain Ar Crystal Structure Of Bovine Serum Albumin cfi I 440909714 Mass: 69292 Score: 120 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) Serum albumin TBos arunniens mutusl Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ^ Databázové vyhledávání ^or peptid DAFLGSFLYEYSR 25 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Aplikace 26 spolupráce: Ústav biochemie, PřF MU Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Spojení se separačními technikami 2D G E - dvoudimenzionální gelová elektroforéza 1) IEF- izoelektrická fokuzace 2) SDS-PAGE- denaturující elektroforéza v polyakrylamidovém gelu IEF proužek na SDS gel vzorek 1 první rozmer IEF o CO rostoucí pl Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Spojení se separačními technikami Kvantifikace na základě změny denzity spotů ^or Bouchal R, Struhárová I., Budinská E., Vyhlídalová T., Zdráhal Z., van Spanning R., Kučera I. Biochim Biophys. Acta 6 (2010) 1350. 28 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Aplikace Bodlín bezocasý - Tenrec ecaudatus 29 spolupráce: Katedra Zoologie, PřF UK Dvoudimenzionální gelová elektroforéza 30 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Sekvenace de novo Sekvenace de novo 31 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Protein BLAST EITEC Basic Local Alignment Search Tool homolog: tear lipocalin Susscrofa nalezené sekvence MMRALLLAIGLGLVAALQAQEFPAVGQPLQDLLGRWYLKAMTsDPeIPGKKPesVTPLIL QEDLSGTWYLK kaleggdleaqitflidgqcqdvtlvlkktnqpftftaydgkrvvyilpskvkdhyilyc KTDLPGQFTAYEGKR VKDHYILYC EGELDGQEVRMAKLVGRDPENNPEALEEFKEVARAKGLNPDIVRPQQSeTCSPGGN EGELEGQQVRMAGLVD DTGSHPEALEDFK 32 Stopková R., Zdráhal Z., Ryba T., Šedo O., Šandera M., Stopka P. BMC Genomics 11 (2010) 45. Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky £^2> 1. Základní pojmy 2. Historie a princip MALDI-TOF MS 3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 4. MALDI-TOF MS profilování v klinické diagnostice 33 5. Vývoj nové aplikace MALDI-TOF MS profilování MALDI-TOF MS v klinické diagnostice EITEC Proteomické markery onemocnění 34 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice - preanalytická fáze (vliv věku, rasy, pohlaví, stravy, režimu, léků...) - stabilizace vzorků po odběru (inhibice proteáz, rozpad krvinek) - vhodnost metody analýzy a interpretace výsledků - nižší produkce markerů u asymptomatických malých nádorů - stejné proteiny produkují i zdravé tkáně (detekce modifikací) - ovlivnění hladiny markeru jinými onemocněními - ekonomická/diagnostická výhodnost oproti současným postupům 35 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice převrstvení bakteriálních buněk na vzorkovací desce MALDI matricí MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: Detekce části bakteriálního proteomu 37 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: Rozlišení rodů J<104 C/3 I 2 0- 4364 5381 2833 h J i' ■ 4183 6255 Escherichia coli 5096 A 7158 9553 7869 8368 8993 A 10299 T I I I I I I I I I I I I I I I I I T I H 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m I z <$00 - á)00 0 2524 5050 Kingella kingae 2212 2746 I 3154 3592 4426 4120 4704 5968 5320 "T-1-1- 4000 7184 T-1-1-1-1- 5000 6000 ~>—i—i— 7000 -i—i—i—I- 8000 -i-1-r- 10000 -1—I—I—I—I- 11000 2000 3000 9000 fooo "500 0 4435 2213 3020 3613 Pseudomonas aeruginosa 6048 5211 6678 7236 7923 8357 9091 9700 i i ■ i I ■ i i i g i i i i g i i ■ i g ■ i i ■ g ■ i i ■ g i ■ i i g i i i i g ■ i i i g i ■ i i 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z 3 x1 OS- Á LO- i/i 0.8- c 0.6- 0.4- 0.2- 0.0- 5176 4976 2795 3405 38g7 4265 4790 TJ Acinetobacter johnsonii 6105 6797 7395 UßZ 8305 8g72 9499 10268 11676 i-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-r- 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] —^ ro co . o co co co CT> co OD ro co CD co OD co ro o OD CD CD CT> O O -J CT> n 3 ft) CS" n f? 3 ft) 3 o o o o P o ro o ho Ö"> OD Ö Ol o o o co o o' o o o' o ül o o' o CT> o o' o o o' o OD o o ■ o CD o o' o o o ■ o o o - o o OD CD ro CD . CD CD o ro CT> OD CT> CT> n 3 ft) CS" Qj n f? o 3" 3 o 3 o o o o o i\> ö ro lt>. ct> od o ül Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] Intens, [a.u.] 0 -■. -■■ -± 01 Ö bi jL o o" o o o ■ o ül o o" o CT> o o ■ o o o" o co o o ■ o CD o o" o 4^ ül O O ül o o - o o o - o o Q. 3 ft) cs" n ? o 3" 3 in o 3 "0 Z M M (0 co o o' o o o' o ül o o' o CT> o o ■ o o o' o co o o ■ o CD o o' o o ö 0 01 Ö Ol o o o ■ o o o ■ o o co 0 01 o co 0 01 - L. Ol p o 5— co CD Ol co ro ro CD ro ro ro 0 ro CD 01 n 3 ft) cs" Qj n f? o 3" 3 tfl 0 3 "0 Z M M ro o o o' o co 0 01 o o o' o Ol 0 01 o CT> o o' o o o ■ o co o o' o CD o o ■ o o o ■ o o o ■ o o co 0 01 o co 0 01 ■ Ol -J ro CD CT> 0 01 CT> CT> co 5~ . co CD CT> CD co co ro o co CD -J co CD Ol o ro CT> CD n 3 ft) ct Qj n o 3" 3 o 3 "0 z M M ro o o' o co o o' o o o' o Ol o o' o CT> o o' o o o' o co o o' o CD o o ■ o o o o ■ o o o ■ o o ■o z M h» M M MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií I. MALDI-TOF hmotnostní spektrometr II. Databáze referenčních spekter -Witp !\ja^k fhyaaa Etap ftpim Sm? Dmi H faítNUkl Vi* tewlbriHubU VJ* . Software pro vyhodnocení dat I ■ ktatti^UTOCĽKÍEL ■■ i ■ ■■■ :'rii.iuiľ[!3:;^ají!snjM3ji:;i KU :. — i ■ ■ ISH :: WciJlĽiiĽiyi.^ľc^i lí ?! J * M"řjiÍ3n^n?Mljai6 L i ■ ŕ:igauii:iírii!fui^Li ISUJ L ■■ 1 Wi — 1 ■ tad«l~EĹ-»q«is;3™ii:,J3H m 9S! y, hiitauinpfeAl-XilBIBL hitiKuiicjfBiKKilíUriBul 41 Detected Species Log( Score) T O Lactobacillus plantarum DSM 1055_DSM 2.449 O Lactobacillus plantarum DSM 2601_D5M 2.440 O Lactobacillus plantarum DSM 20246_D5M 2.381 O Lactobacillus plantarum DSM 2648_D5M 2.285 O Lactobacillus plantarum DSM 13273_D5M 2.279 ^Lactobacillus plantarum DSM 12028_DSM 2.215 O Lactobacillus plantarum ssp argentoratensis DSM 16365JD5M 2.206 O Lactobacillus plantarum ssp plantarum DSM 20174T_D5M 2.025 O Lactobacillus paraplantarum DSM 10641_D5M 1.992 O Lactobacillus pentosus DSM 16366_D5M 1.950 - srovnání získaných dat s databází referenčních MALDI TOF hmotnostních spekter známých mikroorganismů CO CO cz CD ■x-1 ä 6 co CZ CD H—' £ 4 o 2594 4747 5407 5737 Lactobacillus plantarum DSM 1055 6127 7859 68737291 __l .k .k_ 9493 5188 4561 2593 3308 3770 5737 Lactobacillus plantarum CCM 7039T 8955 9491 T-1 1-1-1-1-1-1-1-f-1-1-1-1-j- 2000 3000 4000 5000 -1-1-1-1- 6000 7000 —I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-g- 8000 9000 10000 l l-1-1- 11000 oo^C^ m/z MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií EITEC MALDI Biotyper References OO MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Česká republika- celkem 49 MBT systémů (Červen 2016) 37x clinical, 2x public health, 3x veterinary, lx university (+6x on big MALDI) ■ Noto-* Coptef 11 t»,O0O h «0011 ow oo,»o o«i ».0« tW 10,000 otti«f mam ctf Chybí Liberec, Klatovy, Kolín a okresní nemocnice r f MBT systems big MALDI systems MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Výhody: - doba analýzy ~ minuty - identifikace na úrovni druhu (90 % klinických vzorků), pripadne i detailnejší - minimální náklady na analýzu - identifikace vzorků s abnormálním fenotypem - identifikace kvasinek, plísní a dalších mikroorganismů Nevýhody: - vysoká pořizovací cena - problémy s rozlišením blízce příbuzných druhů - identifikace ze směsných vzorků 45 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií bez kultivace EITEC pokud ve vzorku převažuje jeden kmen, i přímá analýza (bez kultivace) může vést k úspěšné identifikaci hemokultury - diferenciální centrifugace - krevní buňky jsou odstraněny při 500 rpm, bakterie získány při 14000 rpm a poté přímo analyzovány bioterorismus - přímá MALDI-TOF MS analýza „podezřelého prášku" 46 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Antibiotická rezistence The Rise of Resistance Overuse of antibiotics in people and animals is leading to drug-resistant infections that help cause an estimated 2 million illnesses and 23.000 deaths a year in the U.S. alone, public health officials say. penicillin |— penicillin R pneumococcus tetracycline ^^^^»1—tetracycline R Shigella erythromycin ^^^^^B |- erythromycin-R Streptococcus methicillin |— methtcillin-R Staphylococcus gentamicin ^^^^^^m |— gentamicin-R Enterococcus vancomycin ^^^^^^^^b j Timeline of key antibiotic resistance events Antibiotic Antibiotic |— resistance Introduced Identified vancomycin-R Enterococcus vancomycin-R Staphylococcus ceftazidime |— ceftazidime-R Enterobacteriaceae imipenem imipenem R Enterobacteriaceae levofloxacin |— levofloxacin-R pneumococcus linezolid |— linezolid-R Staphylococcus daptomycin ^^^^^^m ceftaroline 1940 1900 1960 1970 1980 1990 2000 |— ceftaroline-R Staphylococcus 2010 Notes: Data is as of 2013; penicillin was in limited use prior to widespread population usage in 1943. Source: Centers for Disease Control and Prevention TUK WAI.I.STKKKT Jot HWI. 47 By Dr Graham Beards at en.wikipedia, CC BY-SA4.0, https://commons.wi kimedia.org/w/index.php?curid=25206097 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Antibiotická rezistence - rezistence proti některým antibiotikům je spojena s přítomností specifických signálů v MALDI MS profilech (přímou detekcí příslušných enzymů, proteinů exprimovaných z příslušných genů, nebo nepřímo na základě vyhodnocení celého spektra) - detekce MRSA na základě signálu peptidu PSM-mec (Josten et al., Int J Med Microbiol 304 (2014) 1018-1023) 48 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Antibiotická rezistence "H OH C..H NO.S «10» 6- 1 l. L.....L _ 240 I 254 m/z í 300 m/z MALDI-MS detekce metabolitu imipenemu rezistenci spojenou se změnou MW antibiotika lze rovněž sledovat pomocí MALDI MS inkubaci s antibiotikem lze provádět i přímo v kapce na vzorkovací desce spektrometru detekce v oblasti odpovídajících m/z, jiné MALDI matrice (Hrabák et al., J Clin Microbiol 49 (2011) 3222-3227) 49 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií Antibiotická rezistence normal Lys heavy Lys an|ib«»ic • « heavy Lys • # # Control 1 SuscepJibJe ResisSaot Control 2 Detekce růstu v médiu obsahujícím izotopově značený lysin inhibici růstu je možné detekovat v proteinových profilech po kultivaci na izotopově obohacených médiích (Sparbier et al., J Clin Microbiol 51 (2013) 3741-3748. 50 Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky 1. Základní pojmy 2. Historie a princip MALDI-TOF MS 3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 4. MALDI-TOF MS profilování v klinické diagnostice 51 5. Vývoj nové aplikace MALDI-TOF MS profilování Výběr modelového vzorku - materiál podobný/shodný s analyzovaným systémem - materiál levný a stabilní - materiál dostupný kdykoli a v neomezujícím množství 54 Volba podmínek analýzy volba extrakčního postupu volba MALDI matrice, včetně rozpouštědla a nanášecí metody na vzorkovací desku volba režimu detekce: pozitivní/negativní mód; lineární/reflektronový mód Optimalizace metody metoda umožňující detekci většího počtu relevantních signálů metoda poskytující opakovatelné/reprodukovatelné výsledky metoda rychlá, levná, jednoduchá, snadno dostupná Cesta hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF z vědeckých laboratoří do klinické diagnostiky - kombinace separačních technik s MS analýzou peptidů (po proteolýze proteinů) umožňuje identifikovat a kvantifikovat v biologických materiálech tisíce proteinů - na základě přímé MALDI-TOF MS analýzy proteinů jsou v klinické diagnostice rutinně identifikovány bakterie a další typy patogenů - během vývoje analytické metody je nutné od začátku zvažovat praktické aspekty jejího využití 66