E2050 Laboratorní cvičení z molekulární biologie a mikrobiologie
<
QPC
O
Vyučující: Mgr. Pavla Holochvá, Ph.D.
Garance: doc. RNDr. Petra Bořilová Linhartová, Ph.D., MBA
Cvičení 9
i
Rozvrh cvičení
UVDD
BOZP Práce v laboratoři
IZOLACE
KobnkDvá metoda i bukůlnfho steru
PCR
Ampiifilcace mikrobiálni DNA 2 vydolovaného bukálniho steru
MIKROBIOLÓGIE
Gramovú barvení
qPCR
Eubakteriální qPCR 2 bukálniho steru
SEKVENACE
Teoretický úvod Základni analýzy
IZOLACE
Fenoľchloroformovoti metodou í krve
KONTROLA DNA
Kontrola kvality a kvantity vyizdované lidské DNA z krve
KONTROLA PCR
Kontrola PCR produktu pomoci gelové elektroforezy
MIKROBIOLOGIE
Personálni monitoring
qPCR
Stanovení polymorfizmu z bukálniho steru
DISKUZE
Zpětná vazba
z
• eubakteriální qPCR analýza DNA extrahované ze vzorku bukálního steru
PI
OP QPC
Princip PCR -exponenciální nárůst počtu
amplifikovaného úseku DNA (2n)
Q Denaturation Denaturace 94 - 98 "G
DNA template with sequence
of interest 51 3'
ti^^Wiui lllllmmll
3' 5'
Primers dNTPs .
f    * *
Polymerase
r"
"L mni
mi
1st cycle
^ Annealing Q Extension
Připojeni primerů     Syntéza nových řetězců
2nd cycle
30 - 65 °C
>
^ nm
65 -75'C
iifiwmiii
3'
ÉÉÉ
5'
m ...
hi
Detekce a kvantifikace fluorescence v reálném čase
DMA intercalating Hydrolysis probes Molecular beacons LNA probes
dyes
5 11111111111111M1111UU11111 ITT
I
±      i r * ■
iininiiiiiiii. ftttttti© ^niiniiniiiif^             „...
3' iiiilliili»lliriTi»»niífnii 3' mihi»......ml...........hi DNA
MSB Base
Forward      Reverse DNA primer       primer polymerase
p
CÍP QPCH
Princip PCR - exponenciální nárůst počtu amplifikovaného úseku DNA (2n)
-.- ,,.r.-..--.i
" l......
■■ iljrIYli - i • ■■
2nd cycto 3rd cycla nth cycle-
Syntéza novich fetfritö '.""1UÉÉÉI -| f|J
CS-7S-C - "
- u^^^Wurt
'»»  » .......... r 53
\ 1*    flflWJtnt ^     lilií "
rrTi.....ti ^
Detekce a kvantifikace fluorescence v reálném čase
DNA i rite real at in, dyes
g        Hydrolysis probes
Molecular beacons
LNA probes
, ^3     innAiiiiii_Oiin©1
/ 3' um..............mimimii
5 IIIIIIIIIIIIIIIMIIIJMI]IIIIIII 3'     i ÄliJ^jlllllM
■t 1 r
3''":*mimi
o I ©
\ £
' iinmiiiiiiir
3' imnli......i 11 i..............
Base
HO^ I HO
VS.
Base
HO
HO
DNA monomer     Locked nucleic acid monomer
rmn       rrrm * O T ©mm©
Forward     Reverse      DNA Intercalating dyes   Intercalating dyes   dNTPs      Fluorescent probe
primer      primer       polymerase    {excited state)       (ground state) (with reporter and quencher)
Fl«UOglI$Cl§*lC@*§l £@*§ÄCI
• interkalační barvivo - vazba na malý žlábek dsDNA - nespecificky SYBER® Green
Q Iniciace
DNA lemplale
. I
© Denaturaee (95 °C)
{£) Nasedání příměrů (60 °C)
0 Prodloužení řetězců (72 °C)
lllQülllllf1, lllllľ lil
Nedetekovatelná intenzita fluorescence
O
Zvyšující se teplota zapříčiní separaci dsDNA \
.ML
Buk
iimiin		
■» 1	í	
imiliOlIr.		Ml .1
J
hydrolyzační sondy - TaqMan™ - reportér + zhášeč, vazba do vnitřní amplifikované části
3 Luimiium,
Mftudánforírrieiuajiciiidy
1       DNA TO
f iiitiiimiiiiuni|||r]
=7"
.um
mii.M.iM,
(T) PTurJHi/uifjni fMřřtfl [72 'C)
POly menia lion     y-■ PH^MM*
; ''■■■im^fflUllllTTTT ^TTlTiii ií
Fl«UOglI$Cl§*lC@*§l £@*§ÄCI
interkalační barvivo - vazba na malý žlábek dsDNA - nespecificky SYBER®Green
© Denaťurace (95 °C|
iiiqiiiiiiiqiiiiiiiiqjii
Nedetekovatehá intenzita fluorescence
prírtierú (GO Cl
' llllllinilllllllli;||||
(    Forwirí piirrm j T
*n
(T) Prodlouženi řetězců (72 °C)
.O
Zvyšující se teplota za přičiní separaci tísDNA \
mní r liiimii
hydrolyzační sondy - TaqMan™ - reportér + zhášeč, vazba do vnitřní amplifikované části
'(T) Denaturace (95 °C)
( 2 | Nasedání primerů a sondy ^-^ (50-65 °C)
(T) Prodlužování řetězců (72 °C)
Polymerization    >-Polymerase
mu
		T'111M1TTO
LU	JJ	"""lír/
DNA melting
\ Forward * Primer
3> mu
Reverse 1 Primer
Fluorescent ^
Reporter ^—Quenaier
TIKA PC
1. fáze: množství DNA a tím i fluorescence je nízká a nepřesahuje úroveň pozadí.
2. fáze: průběh reakce je v této fázi exponenciální, intenzita fluorescence nad úroveň pozadí - Cp (crossing point) neboli Ct (threshold cycle) = kvantifikace.
3. fáze: jedná se o lineární fázi - dochází k strmému nárůstu fluorescence.
4. fáze: tzv „plateau" fáze, dochází k únavě reakce (např. některé komponenty reakce byly již spotřebovány), není vhodná pro kvantifikaci DNA.
Plateau" fáze
Pozadí fluorescence
Cp = Ct Počet cyklů
' ABSOLUTNÍ KVANTXFXKAC
• Absolutní kvantifikace - pozitivní standard - známá koncentrace
- odečet proti kalibrační křivce
- vyjádření koncentrace v počet kopií DNA/jliI
Standard o koncentraci 1 x 105 počet kopií DNA/|al
LATZVNI KVANTIFIKACI
• Relativní kvantifikace - množství fluorescence testovaného vzorku se porovnává s množstvím fluorescence referenčního vzorku
• Výběr referenčních genů („housekeeping") - výběr podle typu tkáně a typu fyziologického stavu - exprese referenčního genu musí být v dané „zdravé" tkáni přítomna a stabilní
• Jednotky použité k vyjádření relativních veličin jsou irelevantní
GAPDH
Albumin
Aktin
Tubulin
Cyklofilin
18S rRNA
28S rRNA
Relativní kvantifikace
relativní počet kopií = etf ^ -
C T*si C Rtěnce
Cycle Number [C)
VYUŽITI QPC
Multiplex qPCR
• detekce více cílů v jedné reakci
• úspora materiálu a vzorku
• odečet jednotlivých barev pro každý target
							
Filters		1 2	3	4_	5		
Wavelength fnm)							
Spectra	/YY\						
Dyes	■Si/tm FÄM~	-551 nm víc*	\ ~53C niv ABY*	\ ••617 nm JUN"	\ -654 nm MP"		
One-Slep
RT-qPCH
Two-Step
RT-qPCR
VYUŽITI QPCR V Dl
s
• Amplifikace části genu pro 16S rRNA - konzervativní gen pro prokaryotické mikroorganismy
• SYBER® Green fluorescenční barvivo - součást polymerázového mastermixu - zbytečně nevvstavotat světlu
• Absolutní kvantifikace
• Pozitivní kontrola = standard o koncentraci 1 x 105
1. Detekce mikrobiální DNA v klinickém vzorku
2. Kvantifikace bakteriální nálože v klinickém vzorku (ve vzorku je mikrobiální i lidská DNA)
D EM EŠEM í PHÁCl
REAGENCIE	MNOŽSTVÍ 1 reakce	MNOŽSTVÍ 7 reakce
LightCycIer 480 SYBER Green 1 Master	5 JLXl	
PCR-voda	2,4 nl	V
TotBac_16S Forward primer (10 nM)	0,3 jlxI	\
TotBac_16S Reverse primer (10 nM)	0,3 jlxI	
DNA	2 JLXl	
Celkový objem	10	
DNA DNA	Poz.	Poz.	Neg   Neg -
vzorku vzorku	kont	kont	kont kont
Provedete 6 reakcí v duplikátu: 1.+2. DNA vzorku
3.+4. DNA pozitivní kontroly - zamezí falešně negativním výsledkům 5.+6. Negativní kontrola - místo DNA přidat PCR H20
- zamezí falešně pozitivním výsledkům 7.    Nadbytek kvůli pipetovací chybě (~ 10 %)
OHfHACI O
DUŠEVNÍM VLASTN2CTV
•Tato prezentace je autorským dílem vytvořeným zaměstnanci Masarykovy univerzity.
•Studenti kurzu/předmětu mají právo pořídit si kopii prezentace pro potřeby vlastního studia.
•Jakékoliv další šíření prezentace nebo její části bez svolení Masarykovy univerzity je v rozporu se zákonem.
•Toto cvičení bylo provedeno za podpory Výzkumné infrastruktury RECETOX (ID LM2023069)
-
ENVIRONMENTAl       g^f>* U f O/g