Rybí laboratorní modely ve vědě Nikodém Zezula Rybí modelové organismy Rybí modelové organismy Medaka japonská Danio pruhované Živorodka duhová Tetra mexická Losos obecný Pstruh duhový Koljuška tříostná Halančík tyrkysový 2004 2004 2016 2016 2018 2001 Čtverzubec rudoploutvý Rok vydání sestaveného genomu 2017 20152006 Rybí modelové organismy ve vývojové biologi Medaka japonská Danio pruhované Medaka japonská ̶ 1-3 cm ̶ Žije v rýžovištích, mělkých rybnících, pomalých a stojatých vodách ̶ Původně z ostrovů Honšu, Kjušu a Šikoku. Dnes rozžířena i v jihovýchodní Číně a Koreji ̶ Velký teplotní rozsah (6-40°C ̶ Poloviční genom oproti Daniu ̶ Geneticky určené pohlavý Medaka japonská Říše Animalia (živočichové) Kmen Chordata (strunatci) Podkmen Vertebrata (obratlovci) Nadtřida Osteichthyes (ryby) Třída Actinopterygii (paprskoploutví) Nadřád Teleostei (kostnaté ryby) Řád Beloniformes (jehlotvární) Čeleď Adrianichthyidae (medakovití) Rod medaka Halančík tyrkysový ̶ Nothobranchius furzeri ̶ Extrémně krátký životní cyklus ̶ Pohlavní dospělost ve 2 týdnech ̶ Umírá cca ve 3-4 měsících ̶ Jikry prochází dlouhým dormantním období při vyschnutí ̶ Ideální pro studium stárnutí ̶ Využití i na xenografty (žive ve 37°C) Halančík tyrkysový Říše Animalia (živočichové) Kmen Chordata (strunatci) Podkmen Vertebrata (obratlovci) Nadtřida Osteichthyes (ryby) Třída Actinopterygii (paprskoploutví) Nadřád Teleostei (kostnaté ryby) Řád Cyprinodontiformes (halančíkovci) Čeleď Nothobranchiidae (halančíkovití) Rod Nothobranchius Danio pruhované ̶ Danio rerio (lidově zebřička) je sladkovodní tropická ryba ̶ Nejpoužívanější laboratorní ryba v biologii ̶ Pochází z jihovýchodní Asie (od úpatí Himaláje přes Indii, Pakistán, Bhutan, Bangladéš a Nepál) ̶ Přebívá zejména v pomalu tekoucích a stojatých vodách. ̶ Invazivně se šíří v Kolumbii a na jihu USA ̶ Všežravec, živící se převážně zooplanktonem Danio pruhované Říše Animalia (živočichové) Kmen Chordata (strunatci) Podkmen Vertebrata (obratlovci) Nadtřida Osteichthyes (ryby) Třída Actinopterygii (paprskoploutví) Nadřád Teleostei (kostnaté ryby) Řád Cypriniformes (maloostní) Čeleď Cypriniformes (kaprovití) Rod Danio Danio pruhované ̶ Ve vědě se začalo používat 70. letech ̶ S využitím začal prof. George Streisinger na univerzitě Oregonu ̶ Masivní rozšíření v 90. letech po té co nobelistka Christiane Nusslein Volhard použila danio pro studium HOX genů ̶ V roce 1976 byli dania na palubě Salyutu 5 (orbitální stanice SSSR) Danio pruhované ̶ Jednoduchý chov a manipulace ̶ Až 300 jiker na rybu ̶ Relativně velké jikry ̶ Jednoduchá genová manipulace ̶ Ve 3 měsících pohlavní dospělost ̶ 3 dny do vylíhnutí ̶ Průhledné tělo ̶ Až 10 jedinců na litr ̶ Neznámá determinace pohlaví Danio pruhované - vývoj Danio pruhované - vývoj Anatomie Danio pruhované - GMO Danio pruhované ̶ 70% lidských genů má homolog v daniu ̶ 84% genů asociovaných s lidskými onemocněními přítomny v genomu dania ̶ 70 597 článků na Web of Science ̶ 43 370 dostupných linii v bance ZIRC ̶ 771 protilátek na stránkách ThermoFischer ̶ ZebraFish book - online databáze protokolů Danio pruhované – obory studia Danio pruhované – příklady využití ̶ Studium hojení srdeční svaloviny po infarktu ̶ Dania jsou na rozdíl od savců schopny spustit obnovu srdeční tkáně po infarktu ̶ Rozsáhlá oblast studia – snaha zmapovat které dráhy jsou aktvní při hojení a jestli stejný proces není možné spustit u člověka Danio pruhované – příklady využití Danio pruhované – příklady využití kontrola kondice kontrolakondice Danio pruhované – příklady využití Danio pruhované – příklady využití Danio pruhované – příklady využití Studium funkce genů 28 Jak studovat funkci genů? 29 Různé přístupy ke „ztrátě funkce“ 30 31 STUDIUM ÚLOHY GENŮ - „LOSS-OFFUNCTION“ PŘÍSTUPY ̶ CRISPR-Cas9 ̶ siRNA, sgRNA, ̶ Morpholino,dCAS9 ̶ farmakologická inhibice, ̶ blokační protilátky Bi1130 – Studium úlohy genů32 Různé přístupy ke „ztrátě funkce“ „Knockout“ (KO) • CRISPR/Cas9 „Knockdown“ (KD) • RNA interference • siRNA, sgRNA, Morpholino • CAS9 interfernce Inhibice/cílená degradace • Farmakologická • Protilátkami Studium funkce genů ve vývoji: Loss of function přístupy ̶ Morpholino (Knock down) – založeno na interferenci s mRNA – zablokování translace ̶ CrisprCas9 – využití „imunitního systému“ bakterií pro vnášení dvouřeťezcových zlomů do konkrétního místa v genomu à časté chyby při opravách způsobují změnu čtecího rámce a tím „vypnutí“ daného genu (Knock out) ̶ Farmakologická inhibice – využití malých molekul k inhibici konkrétních proteinů a zastavení jejich funkce Bi1130 – Studium úlohy genů34 STUDIUM ÚLOHY GENŮ - „GAIN-OFFUNCTION“ PŘÍSTUPY ̶ Rekombinantní proteiny, kondiciované média ̶ implantace kuliček ̶ mRNA injection ̶ Transfekce, elektroporace, Transdukce ̶ CRISPR-Cas9 knock in ̶ Tol2 Transgeneze ̶ Rescue experimenty