Praktické příklady úloh pro „Tkáňové kultury savčích buněk“. - 0.1% gelatine, prasečí želatina (porcine skin gelatine) v destilované vodě, MQ kvality, autoklavováno (sterilita + rozpuštění želatiny) - EB, embryoidní tělíska (EB - embryoid bodies), plovoucí trojrozměrné sférické kolonie diferenciujících EC nebo ES buněk ES buňky, pluripotentní embryonální kmenové (ES - embryonic stem) buňky odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - DMSO, dimethylsulfoxide, organické rozpouštědlo - ITS médium, serum-free medium, DMEM : F12 media (1 : 1) + ITS supplement (insulin, transferin, selen) ) + 1x antibiotika (penicilin/streptomycin, 100x SS) - ES médium, DMEM + 16% séra (telecí fetální) + 1x antibiotika (penicilin/streptomycin, 100x SS) + 1x NEAA (100x SS) + 0.05 mM b-merkaptoethanol (7uL / L) - MTT (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan), MTT stock solution, 2.5 mg MTT na 1 ml PBS - MTT extrakční pufr, 10% Triton X-100 + 0.1 M HCl - PBS, fosfátový pufr pro tkáňové kultury, 8 g NaCl + 0.2 g KCl + 0.2 g KH[2]PO[4] + 2.16 g Na[2]HPO[4].7H[2]O, (2.88 g Na[2]HPO[4].12H[2]O) na 1L MQ vody, pH 7.4 - RA, kyselina retinová - all-trans retinoic acid, zásobní roztok 5-15 mM v EtOH, pracovní zásobní roztok 50-100 mM v PBS - SDS lyzační pufr, 1% SDS, 100mM Tris pH 6.8, 10% glycerol - TC plastik, plastik pro tkáňové kultury (TC – tissue culture) - Kit na stanoveni ATP a luciferázové aktivity - Vhodné plasmidy a PEI (transfekční roztok) Trypsinizace adherentních buněk = převod adherentních buněk do suspenze, PASÁŽOVÁNÍ 1) odsaj růstové médium a opláchni buňky PBS (stačí stejný objem jako byl růstového média) 2) přidej pracovní roztok trypsin (0.25 %) / EDTA tak, aby udělal tenkou vrstvu na dně kultivační misky (pro misku o průměru 60 mm 350 – 500 ml, pro misku o průměru 100 mm 700 – 1000 ml). 3) můžeš dát tuto misku do termostatu a nebo při R.T. přímo pozorovat uvolňování buněk od podkladu. Buňky by měly v trypsinu být tak 3 – 5 minut. 4) k uvolněným buňkám přidej kompletní růstové médium obsahující sérum (absolutní objem séra tak 1 : 1 k objemu roztoku trypsin / EDTA) nebo inhibitor trypsinu. 5) pipetou buňky jemně rozsuspenduj na homogení populaci, spočítej je a použij do experimentu nebo pasážuj v požadovaném množství. Tvorba sféroidů – model 3D kultivace - tvorba embryoidních tělíse -> model časné embryogeneze 1) připrav si suspenzi pluripotentních buněk o požadované koncentraci. Pro techniku vysících kapek optimálně 400 buněk na kapku = 13200 buněk /ml (30ul kapka) nebo 11400 buněk / ml (35ul kapka). Pro techniku využívající neadhezivní plastik 300-400 tis. buněk / ml. 2) V případě kapek nanášej kapky s buňkami na víčko kultivační misky pro TC, víčko pak překlop na spodní část misky naplněnou PBS (objem cirka jak pro kultivaci 60mm miska - ~5ml, 90mm miska ~ 10ml) 3) V případě neadhezivního povrchu (např. bakteriologická miska, může být i potažena vrstvou 0,5-1% agaru), nanes suspenzi buněk přímo 4) Suspenze buněk musí být co nejvíce homogenní a buňky v ní pokud možno jednotlivě. 5) Kultivuj potřebný čas. V případě kapek max 5dnů, v případě neadherentního povrchu dle potřeby s periodickou výměnou kultivačního média. ÚLOHA Vyset (Po) ES buňky v podobě kapek a na neadhezivním plastiku (zde výměna média po 2 dnech - St) Porovnání kvality/homogenity EBs (Pá). Detekce proliferační aktivity adherentích buněk Stanovené růstové aktivity buněčné populace je možno provést nejen sledováním počtu živých buněk v takové populaci, ale také analýzou aktivity některé z jejich metabolických drah, anebo jako celkového množství proteinů, které tato populace obsahuje. Postup (např): 1) na 12 (1 jamka = 3.6 cm^2) a 96 (1 jamka = 0.4 cm^2) jamkovou destičku vysej buňky v kompletním DMEM médiu o hustotě 5000 buněk na cm^2. Počítej s tím, že na 12 jamkové destičce budou duplikáty a na 96 jamkové triplikáty. V případě 96 jamkové destičky také buňky nevysévej do okrajových jamek, ale do středních a ty okolo naplň PBS. Finání objem pro 12 jamkovou desku je 2 ml, a pro 96 jamkovou 200 ml média v jedné jamce. 2) ovlivnění buněk na 96 jamkové desce proveď tak, že buňky vysej v objemu 100 ml a poté se k nim přidej dalších 100 ml média s naředěnými drugs o dvojnásobné koncentraci než je požadovaná finálně, v jamce tak bude celkem 200 ml média o požadované koncentraci drugs. 3) k buňkám na 12 jamkové desce přidej požadovaná látky o žádané koncentraci přímo ze zásobního roztoku, případně po jeho naředění, aby se přidávaný objem pohyboval v rozsahu do 20 ml, kdy ho na 1 ml celkového objemu média v jamce můžema považovat za zanedbatelný*. 4) po 2 dnech kultivace 2x PBS opláchni buňky na 12 jamkové desce a zlyzuj je v SDS lyzačním pufru (150-300 ml, podle buněčné denzity u nejvíce rostoucí jamky). 5) pro optimální homogenizaci vzorku je tento lyzát vhodné sonikovat. 6) pomocí DC Protein Assay kitu fy Bio-Rad změř koncentraci proteinů v lyzátech. 7) u 96 jamkové destičky po 2 dnech kultivace k buňkám přidej do každé jamky 20 ml MTT roztoku a desku vrat zpět do termostatu (teď bez víčka!!!!, na sterilitě již nezáleží). 8) po 2 hodinách kultivace v termostatu, zkontroluj vznik barevného formazanu v buňkách, pokud se ti zdá málo, nech kultivovat ještě 1 hodinu. 9) odstraň médium z jamek 96 jamkové desky (nejlépe vyklepnutím do umyvadla a pak na filtrační papír) 10) poté se do každé jamky napipetuje 50 – 100 ml (v závislosti na množství vytvořeného formazanu) MTT extrakčního pufru nebo DMSO a za mírného třepaní se barevný formazan nechá extrahovat. 11) po vyextrahování formazanu se jeho absorbance změří na ELISA readeru při vlnové délce 570 nm. - můžes také buňky stanovit krystalovou violetí, kdy buňky po opláchnutí PBS fixuješ a barvíš roztokem krystalové violeti (0,05% w/v krystal. violeti. 1% formaldehyde, 1% metanolu v PBS) minimálně 20 minut při R.T. Po odstranění barvícího roztoku (lze použít opakovaně), buňky opláchneš vodou, necháš usušit a můžes dokumentovat velikost kolonií nebo barvivo extrahovat do 10% kyseliny octové a kvantifikovat při 570nm na spektrofotometru. * V případě že rozpouštedlo testované látky je biologicky aktivní, je nezbytné i je samotné přidat do kontrolních jamek. Závěr: Populace pomaleji rostoucích buněk obsahuje méně proteinů (12 jamková deska) a pomaleji rostoucí buňky mají i menší metabolickou aktivitu a je jich samozřejmě také méně (96 jamková deska). Metabolická aktivita je zde měřena jako schopnost oxidačně-redukčních systémů buňky měnit rozpustnou a žlutou tetrazoliovou sůl (zde MTT) na nerozpustný a fialově zbarvený formazan, akumulovaný uvnitř buněk. Je dobré si uvědomit, že stanovení celkového proteinu jako růstového parametru není vhodné u buněk tvořících nadměrné množství extracelulární matrix, např. chondrocyty. MTT test zase není vhodný v případě, kdy testovaná drugs jsou sama o sobě silnými oxidačně-redukčními činidly. Analýza proliferace stanovením ATP - celkové množství ATP velice přesně a citlivě vypovídá o kondici buněk a jejich počtu. - vysetí buněk na 12-, 24-, nebo 96 wells plate, počet buněk dle jejich schopnosti proliferovat a potřebné délky testu/kultivace - buňky se ovlivní příslušnou látkou (zde RA) a ve vybraném čase se opláchnou PBS a zlyzují pufrem pro stanovení ATP (viz. výše). ÚLOHA Vyset buňky na 24 jamkovou desku, 2000 buněk na cm2 (Po). Ovlivnění buněk testovanými drugs (Ut). Vyhodnocení krystalovou violetí (A), MTT testem (B) (Pa). Drugs M a A, SS – 10mM, testované koncentrace 1, 3, 10 uM a jejich kombinace. Reportérový test A) test účinnosti transfekce pomocí vektoru/plasmidu kodujícího konstitutivně exprimovaný zelený (GFP) případně červený (RFP) fluorescenční protein - ověření účinnosti transfekce - příslušné buňky vyset na poželatinovanou 6-wells plate, 3xE4 buněk na cm2 v 1,5 ml media - druhý den připravit transfekční směs = pro jednu jamku 3ug DNA(příslušný plasmid/vector) plus 200 uL serum/AB-free media s 6uL PEI (2x, pH 7.0), po 15-20 minutách nakapat na buňky v jamce - po cca 4h vyměnit buňkám médium za čerstvé - následující den pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu poměr buněk pozitivních k GFP/RFP proti negativním. Lépe lze použít analýzu pomocí flow-cytometru (FACS) - samozřejmě dle potřeby je možné použít i kultivační plastik jiných rozměrů B) reportérový test na aktivitu transkripce citlivé na působení kyseliny retinové (RA) - analýza transkripční aktivity RA, transfekce buněk reportérem kódujícím gen pro luciferázu pod kontrolou promotoru citlivého k RA (RARE-luc; RARE-retinoic acid responsive element) - příslušné buňky vyset na poželatinovanou 12-wells plate, 3xE4 buněk na cm2 v 0,7 ml media - druhý den připravit transfekční směs = pro jednu jamku 0,7 ug DNA(příslušný plasmid/vector) plus 100 uL serum/AB-free media s 1,7 uL PEI (2x, pH 7.0), po 15-20 minutách inkubace pči R.T. nakapat na buňky v jamce. - Po cca 4h vyměnit médium za čerstvé a 8h po transfekci provést experimentální zásah (zde např přídavek 0.1uM RA v kombinaci s nějakou testovanou látkou) - Druhý den opláchnout buňky PBS a zlyzovat v příslušném pufru (1 : 1; lyzační pufr pro luciferázu a lyzační pufr pro stanovení ATP) - Změřit na luminometru luciferázovou aktivitu (vzorek + substrát – 50 + 50uL) a následně ATP (vzorek + substrát – 30 + 30 uL). Výsledná hodnota je poměr signálu luciferázy ku signálu ATP (RA aktivita na buňku) ÚLOHA Luciferázový reportérový test (A) a fluorescenční reportérový test (B). Vyset buňky na 24 jamkovou desku na 5ml misku (Po). Transfekovat buňky příslušnými plasmidy + indukce reportéru (Po/Ut). Vyhodnocení luciferázové aktivity