Izolace nukleových kyselin
Materiál pro izolaci nukleových kyselin
• ^r^cedura extrakce z
Buněk
Virových částic Prostředí
Přečištění nukleových kyseliny po separaci nebo enzymatických reakcích
Při izolaci z buněk modifikujeme postup podle potřeby izolovat
Celkovou genomovou DNA Plazmidovou DNA bakterií
nazmiuovou DaKiem ■/ /■
DNA z organel (mitochondrií, chloroplastů)
Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovaný
Požadavky na izolaci nukleových kyselin
V nativním stavu z přirozeného materiálu
- v dostatečném/potřebném množství
- požadované čistotě
Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyži buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a špecifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám
Metodické principy využívané při izolaci
nukleových kyselin
■ • 1. Rozrušení buněčných stěn - obecně označovaný proces „lyže buněk" pomocí
- Enzymů (lysozym a celulázy)
- Detergentů (dodecylsulfát sodný)
- Mechanicky (lyzační matrice, FastPrep)
- Ultrazvukem
- Ultrazvukem
2. Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant (předčišťovací enzymy)
- Proteináza K nebo pronáza E
- RNáza nebo DNáza
3. Purifikace NA
FastPrep Kity
• Homogenizátory - izolace z těžce zpracovatelných vzorků
i 1    r v
- tkáně
- rostlinný materiál
- Gram-pozitivní bakterie
- kosti
- půda/prostředí
Balotina vhodné velikosti
Typy metod pro izolaci nukleových kyselin
1. Metody využívající rozdílné rozpustnosti
• ^Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo
izopropanolové precipitace (srážení)
• Obecně rozšířené, široké aplikace
• Vhodné pro vysokomolekulárni genomové NK
2. Metody adsorpční
/    •    DNA se váže na křemičité povrchy v přítomnosti chaotropní látky
• Vhodné zejména pro rychlou purifíkaci malých množství
3. Centrifugace v hustotním gradientu
• Izopyknické centrifugace v gradientu CsCl
• Vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu
• Možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech
-^/NaCl - iontová síla
Tris hydrochlorid - pufrovací činidlo
• EDTA - chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz)
O"—Mg2+-0-
\_/
Na+ Na+ H,0 H,0 HoO HoO
'.Hti-Hiw.t
DNase 1
DNase 1 with Inhibitor
MM;*:
* • * EDTA (DNase Inhibitor)
Typická fenolová extrakce
Promíchání Jyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od nukleových kyselin. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. ^
Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny.        ■     g n
Vysrážení nukleových kyselin etanolem, ■ II. |S
případně izopropanolem. w^^i, jjjM IH
Účinnému vysrážení nukleových kyselin j Im
přítomných v nízkých koncentracích se % ľ * IBP
napomáhá snížením teploty a přídavkem solí. ^fc*^(^^-g^B Ih|
Shromáždění precipitátu nukleových kyselin   ^HEm^SSÍ^I IH
centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku.
Izolace plazmidové DNA
• Plazmidy jsou využívány pro tvorbu konstruktů v genovém inženýrství
• Výskyt u bakterií
• Topologie molekuly
- Dvouřetězcová DNA
/     - Kružnicový tvar a nadšroubovicová hustota
- Malá velikost ^
- Více kopií v buňce
• Metody založené na denaturaci a renaturaci
- Alkalická lyže
- Lyže varem
Alkalická lyže pro izolaci plazmidové DNA
•   '7""7--', -      .---\'YN-     ' ■
1. Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika
2. Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym)
Přídavek roztoku s NaOH
Denaturace bakteriálního chromozomu ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU
4.   Přídavek neutralizačního roztoku
• Vysrážení chromozomální DNA s proteiny
• RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA
5. Odstranění bakteriální DNA centrifugací
6. Purifikace plazmidové DNA
Izolace RNA
Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly:
- Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H20, rukavice!
- Extrakce v guanidinových solích
- Fenolové extrakce při pH 5-6
- Extrakce trizolem
- Odstranění DNA DNázami bez RNáz
Selektivní srážení RNA pomocí LiCl
Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA
Izolace mRNA
• mRNA ty oři pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná""
• Pro izolaci se využívají
- Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, r RNA a tRNA
/
- Metody využívající afinitu poly (A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy
Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA
Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA j sou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem
Streptavidinem pokryte ^ Streptavidinem pokryte mikrozkumavky   s " maeneticke castice
Mix sample with fvsis buffer
Mix sample buffer solution with Biotin-labeled oltgrj (dTlg, pnotie, and incubate
Add 50 ul of mix to Streptavid in-coated PCAtube (immobilization occurs)
Wash 3 times with buffer
t Dlir\"£.li:d aii^o |dl:
Capturing an slrcplavidin-ataied i   : •;• i. partise
Magnet scparaiion
6
tMlOrl or fllKNA
o
a.
TTT
15-
10-
RNA separovaná na bioanalyzátoru
RNA integrity number (RIN)
- "Většinu materiálu představuje ribozomální RNA
• 16S(18S)rRNA y 23S(28S)rRNA
marker
16SrRN
23 S rRNA
25
200
TT1-
4000
16SrRNA
Vzorek RNA izolovaný TRIzolem po ošetření DNázou, RIN = 8,8
mRNA
Adsorpční metody
Využívají schopnostsQukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979)
- guánidin thiokyanát
- guánidin hydrochlorid
- jodid sodný (Nal)
Síla vazby závisí na
- Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA)
- Iontové síle ^>
- pH roztoku
Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant
Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H20
Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota
Mechanismus interakce DNA s oxidem
křemičitým
Fig. 1
A possible mechanism for silica binding of DNA in high concentrations of chaotropic salt.
-OTltf^ Chactropii
Salt
CaMon "fi" DNA
/ rJ
i *
-ONg+0-P-0' 1
-O'N^O-P-0-
Base
B^ase Sugar
0
1
arte
N
- OH V
-0"No'0"-P-0'
Q Base o:Sugar
-0"No*0-P-0-i
O"
RNA Isolation Plasmid PCR Template Viral NA
Blood, Cells.    Isolation   Preparation    PCR      Isntaliun for
J Tissue. Bacteria. Bacterial   Blood Cells, Purification CRTQ-PCR
Yeast cells        Tissue   PCR Reaction Blood Seium.
Formy silika-matric
Kolony   / / >
20,000 a
Analýza a kvantifikace
SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA
- Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm
- Koncentraci stanovujeme na základě empirie:
tu   IV   Jtt   ä   111   ill   JU   JU   U   111   »1   iÁ>   M   J .-L-
Wrab-tfliniťi
- Vhodná metoda pro měření vzorků, které j sou
• V dostatečné koncentraci
• Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant