Dělící techniky nukleových kyselin - Elektromigrační - Centrifugační Vlastnosti využívané pro dělení biomakromolekul - Molekulová hmotnost - Konformace a tvar - Náboj - Hustota Rozdělení centrifugačních technik A. Diferenciální centrifugace - separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku B. Zonální centrifugace - separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku a) Izokinetická centrifugace - separace podle rychlosti sedimentace částic • Stanovení sedimentačního koeficientu S b) Izopyknická centrifugace - separace podle • Stanovení vznášivé hustoty p Typy centrifugace podle účelu - Preparativní centrifugace - Analytická centrifugace Centrifugačirf metody Centrifugace patří k separačním metodám, které se v molekulární biologii používají k - Izolaci - Purifíkaci - Charakterizaci informačních makromolekul a nadmolekulárních struktur Základním principem separace založené na centrifugačních technikách je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole které vzniká otáčením rotoru centrifugy Chování částic při centrifugaci je dáno jejich fyzikálními vlastnostmi a povahou prostředí, v němž centrifugace probíhá. ulárních Typy centrifug ooo . Teoretické principy cen hladma častice e- osa otacem :: :^:5:::;5:;::;;f>::y;:; 7 kapalina cencnfygiíni kyveu Sily F,, F4J působící při centrífugaci na pohybující se částice; r„ = vzdálenost od středu otáčeni v čase t = 0, r = vzdálenost Částice od osy otáčení v čase t > 0, V = objem, ti = hustota částice, g — hustota kapaliny 5 to 30% Sucrose gradients Protein sample Molecules sediment according to their size, shape and density. Výpočet relativnix>dstředivé síly RCF = l,12r ' rpm N v 1000 rpm = 1000 x RCF J RCF - relativní odstředivá síla (relative centrifugal force) rpm - počet obrátek za minutu r - vzdálenost od středu otáčení, poloměr rotoru [mm] 1000xg, 5 min 3000xg, 10 min 10 000xg, 10 min 40 000xg, 30 min 200 000xg, 16 hr 400 000xg, 24 hr bakteriální buňky chloroplasty, jádra mitochondrie, inkluzní tělíska membrány, mikrozómy, peroxizómy aj. velké proteinové komplexy (ribozómy) proteiny 50 kDa • Jestliže se centritugaci v homogenním roztoku podrobí směs částic lišících se podstatně svou velikostí, hmotností nebo hustotou, budou jednotlivé složky směsi sedimentovat různou rychlostí. ^ • Opakovanou centrifugací lze z původní směsi při postupném zvyšování otáček získat jednotlivé složky nebo frakce ve formě sedimentu. • Výchozí krok pro hrubou separaci a izolaci složek z lyzátů buněk nebo homogenátů tkání, např. - buněčných jader - buněčných membrán - ribozomů - nukleových kyselin - mitochondrií -proteinů gace Diferenciální centrifugace Směs látek v roztoku. • J 1 f Centrifuface při nízkých otáčkách (1 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při středních otáčkách (20 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při vysokých otáčkách (80 000 g). Zonální centrifugace Rychlost sedimentace jednotlivých komponent přítomných ve výchozí směsi není vždy odlišná natolik, aby je bylo možné diferenciální centrifugací oddělit, např.: - různé typy nukleových kyselin - ribozomální podjednotky - jiné částice, vykazující podobné vlastnosti Pro oddělováni neboli separaci těchto látek se využívá zonální centrifugace, při níž je homogenní roztok v centrifugami zkumavce nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky narůstá. Takový roztok se označuje jako gradientní roztok. K jeho přípravě se používají dobře rozpustné a vůči analyzovaným částicím inertní látky - Sacharóza - Roztok chloridu česného Vzrůstající hustota a viskozita gradientního roztoku eliminují vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení směrem od osy otáčení, čímž brání nárůstu rychlosti sedimentace částic v průběhu centrifugace. Zonální centrifugace Before centrifugation Afl • Před zahájením centrifugace se vzorek obsahující směs částic nanese v tenké vrstvě na povrch gradientního roztoku v centrifugační zkumavce. ter centrifugation q = 1.15 g/ml e = 1.45 g/ml q = 1.50 g/ml q = 1.7 g/ml o i, 0 0 o . . • ' o* .: 0 ."ľ * * »p • * ň" * _ ° ojio o O 0 O » o • „ ->«,'•" »j° a e o o 0 0 * n A o O ° 0 ° * o « • »„ O % ° o o o debris virus particles cr« 203 roztok sacharózy VŠI Sr» roztok sacharóiy v průbčhu vrstvení se 20% roztok re d i 5% rOltokem • Jednotlivé složky výchozí směsi budou v závislosti na své velikosti, tvaru a hustotě sedimentovat gradientním roztokem různou rychlostí a vytvářet dobře oddělené zóny. • Gradient roztoku zároveň zabraňuje proudění uvnitř zkumavky, udržuje stabilitu a ostrost vytvořených zón a umožňuje jejich odebrání. Hustotní ienty Gradienty mohou být podle toho, zda se koncentrace roztoku mění plynule nebo stupňovitě. - Kontinuální - Diskontinuální Diskontinuální gradient je předem připravený gradient v centrifugační zkumavce postupným navrstvováním roztoků o různě koncentraci. Vzorek je pak nanesen na jeho povrch. V obou případech jsou po ukončení centrifugace částice příslušného druhu zkoncentrovány do úzkých pruhů, které lze detegovat a izolovat stejným způsobem jako při zonální centrifugaci. ^ K přípravě hustotních gradientů se používají látky, které se vyznačují vysokou rozpustností: / - chlorid česný - Sacharóza - Dextran - Ficol Rozdíly v hustotách se pohybují v rozmezí 1,0-1,3 g/ml u sacharózy a 1,0-1,9 g/ml u CsCl, což umožňuje oddělit a izolovat např. buněčná jádra, mitochondrie, nukleové kyseliny atp. Čistota získaných preparátů je vysoká. Vy 2 typy zona Izokinetická centrifugace Vzorek nanesený na povrch 5 - 20 % sacharózového gradientu. o o o J Centrifugace. Pomaleji sedimentujfci částice. Rychleji sedimentující částice. Frakcionace obsahu zkumavky. J ntrifugace o O •3' 0 Izopyknická centrifugace Roztok CsCI obsahující směs částic. Centrifugace. O o| Částice s nižší hustotou. Částice s vyšší hustotou. Frakcionace obsahu zkumavky. J J J Sběr frakcí. Sběr frakcí. dber frakci po ultracentrifugaci v hustotnim gradientu debris virus particles needle, bevel up • Scotch Tape to prevent leaks hypodermic needle (21 gauge) Sběr frakcí vykapáním 5"Á,' jacharóia 20/í sacharóia vzorek DNA nebo RNA rozvrstveni vzorku béhem cerurifugace iiriáni frakci Schéma ultracentrifugace v sacharózovém gradientu Odběr frakcí pomocí frakcionátoru 'A Sedimentační^oeficient Veličina, kterou lze rychlost pohybu částice při izokinetické centrifugaci charakterizovat, se označuje jako sedimentační koeficient nebo též hodnota S. Rychlost sedimentace částice při centrifugaci lze vyjádřit obecným vztahem: árlát = S.a = s.c&r, kde r je vzdálenost částice od osy otáčení, /je doba centrifugace, a je odstředivé zrychlení, S je sedimentační koeficient, co je úhlová rychlost rotoru při otáčení. Po integraci uvedeného vztahu získáme rovnici pro sedimentační koeficient S = á(\nr)la?át = Inr/rjrffotý, / z níž lze vypočítat hodnotu sedimentačního koeficientu analyzované částice, jestliže známe její polohy rx a r2 v centrifugační zkumavce v příslušných časových intervalech tx a t2 a rychlost otáčení. Abychom mohli srovnat hodnoty S stanovené při různých podmínkách centrifugace, jsou získané hodnoty přepočítány na standardní sedimentační koeficient S9-20yp které charakterizují rychlost sedimentace částic o koncentraci blízké nule ve vodě při 20°C. Sedimentační oeficient ■ Hodnoty sedimentačních koeficientů se pro většinu informačních makromolekul a molekulárních komplexů pohybují v rozmezí řádů 10-naž 10-13 sekund. Vyjadřují se proto ve Svedbergových jednotkách (S), kde 1 S (Svedberg) = 10~13 sekundy. Hodnot sedimentačních koeficientů se využívá k popisu a charakterizaci informačních makromolekul, buněčných organel a jejich struktur. Příkladem je označování jednotlivých druhů - ribozomových RNA • 23S-rRNA • 16S-rRNA - ribozomových podjednotek • 30S • 50S Pro jednotlivé typy informačních makromolekul lze pomocí empirických vztahů z hodnot sedimentačních koeficientů vypočítat rovněž jejich molekulové hmotnosti. Příklady hodnot standardních sedimentačních koeficientů S0™ „ 0 Inzulín i Lysozym 2 Trypsin 3 Albumin 4 tRNA B-lipoprotein _ 5,8S rRNA Myosin 6 Gama globulin 7 Fibrinogen g Kataláza 10 20 ~~ 23S rRNA Ribozomová podjednotka ^ RNAfágaMS2 DNA fága T7 80 Virus poliomyelitidy ^qq _ DNA fága T4 200 400 Virus chřipky 600 Bakteriofág T2 800 Bakteriofág T4 1 000 — 2 000 4 000 6 000 8 000 10 000 — Mitochondrie Cytoplazmatické membrány 100 000 — Uspořádání analytic . „ . Light path Mirror Jf---------H)" Detector lens í Ultracentrifuge | Rotor Armored chamber ft ! I Motor i i UV Light 1 source Motor Cooling Vacuum pump 300... 3000 ran L 12 ... 1200 vy ^ light source sample cell transmission profil CCD sensor i Výpočet molekulové^hmotnosti DNA z hodnoty S S>w = a . M M= molární hmotnost nukleové kyseliny a,K= empirické konstanty Výpočet srovnáním s vnitrním standarde L= vzdálenost od hladiny M= molární hmotnost K = empirická konstanta Stanovení vznášivé hustoty izopyknickou centrifugací n i -k -i * i i 25 °C = 10,8601 x nD25oC ^13,4974 nD25 oC = index lomu roztoku CsCl Separace různých forem DNA Speciálním případem využití izopyknické centrifugace je rozdělení odlišných strukturních typů DNA v gradientech CsCl za přítomnosti etidium-bromidu. Po navázání etidiumbromidu na DNA se její vznášivá hustota významně snižuje, přičemž množství navázaného etidiumbromiduiftím i pokles hustoty DNA závisí na jejím strukturní typu. To umožňuje vzájemně separovat a izolovat ruzne formy DNA, např. kovalentně uzavřené kružnice plazmidových DNA od otevřených a lineárních molekul plazmidové a chromozómové DNA. ýpočet ^«T(G+C) Separace částic na základě jejich odlišné hustoty se používá k jejich izolaci a charakterizaci. Je známo, že na vznášivou hustotu dvouřetězcové DNA má vliv zastoupení jednotlivých typů párů bází, čehož se využívá ke stanovení podílu GC-párů ve vzorcích DNA. Platí, vztah % (G+C) = (p - 1,660/0,098) .100 kde p = vznášivá hustota vzorku dvouřetězcové DNA.