Manipulace s nukleovými kyselinami ■ hybridizace - identifikace specifických sekvencí ■ enzymy - zásahy do struktury DNA a RNA ■ vektory - klonování fragmentů DNA a RNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Enzymy ■ katalyzují chemické procesy v živých organismech ■ vysoká specifita ■ určují povahu i rychlost reakcí ■ enzymové reakce lze kontrolovat: závisí na koncentracích substrátů, teplotě, pH, aktivátorech a inhibitorech Substrate Active Site Enzyme-Substrate Complex The substrate can bind to the enzyme to form an enzyme-substrate complex. Enzymes are made of long chains of aminoacids. The chains are folded to form the active When the reaction is complete the products are released and the enzyme can be used again. ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Klasifikace enzymů, jejichž substráty jsou nukleové kyseliny Podle typu substrátu: ■ DNA-enzymy ■ RNA-enzymy Podle typu reakce: ■ enzymy anabolické = polymerázy ■ enzymy katabolické = nukleázy ■ enzymy spojující řetězce nukleových kyselin = ligázy ■ enzymy modifikující nukleové kyseliny (přidávají nebo odstraňují funkční skupiny) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Přehled vybraných anabolických enzymů ■ katalyzují syntézu nukleových kyselin Syntetizovaná molekula Matrice Enzymová třída Enzym Příklad zdroje DNA DNA DNA-polymerázy DNA-polymeráza 1 E. coli RNA Zpětné transkriptázy Zpětná transkriptáza AMV AMV Žádná Terminální tra nsfe rázy Terminální transferáza Telecí brzlík RNA DNA RNA-polymerázy RNA-polymeráza T3, T7, SP6 E. coli inf. fágem T3, T7, SP6 Žádná Poly (A) polymerázy Poly (A) polymeráza E. coli ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA " Přehled vybraných katabolických enzymů ■ katalyzují štěpení nukleových kyselin Rozkládaná molekula Typ degradace Enzymová třída Enzym Příklad zdroje DNA od konců exonukleázy Exonukleáza III E. coli Bal 31 Alteromonas espejiani uvnitř molekuly endonukleázv S1 nukleáza Aspergillus oryzae EcoRI (RE) E. coli DNáza I hovězí Pankreas ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Přehled vybraných katabolických enzymů Rozkládaná molekula Typ degradace Enzymová třída Enzym Příklad zdroje RNA od konců exonukleázy fosfodiesteráza hadí jed uvnitř molekuly endonukleázv ribonukleáza A hovězí pankreas ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Enzymy modifikující DNA Typ enzymu Enzym Příklad zdroje Metyláza Dam-metyláza E. coli DcA77-metyláza EcoRI-metyláza Kináza T4-polynukleotid kináza E. coli inf. fágem T4 Fosfatáza BAP-fosfatáza bakterie ClP-fosfatáza hovězí střevo ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Enzymy spojující molekuly DNA Typ enzymu Enzym Příklad zdroje DNA-ligáza T4-DNA-ligáza E. coli inf. fágem T4 ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Restrikční endonukleázy (RE) bakteriální původ objev prvního RE - HináW v roce 1970: Hamilton O, Smith spolu s metylázami součásti reštrikčné modifikačních systémů: ochrana bakteriálních buněk před cizorodými molekulami DNA omezují propagaci bakteriofágů ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA EcoRV nuclease Bacterial genome Restrikce bakteriofága Chromosomal-~T~ DNA l Phage Chromosomal DNA is protected by methylation — O Restriction endonudease attacks incoming DNA Degraded phage DNA (b) Unmethylated DNA Methylated DNA 5'[ 31 fEcoR\ \ y*{ methylase J G A A T T C E C T T A A G C fcoRI will not >/, cleave methylated ^CH DNA G A C T A T T C T A A G I CH, ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 10 Využití restrikčních endonukleáz ■ příprava rekombinantních molekul DNA ■ studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu ■ základ genového inženýrství ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Typy restrikčních endonukleáz ■ klasifikace založena na způsobu štěpení DNA, molekulové hmotnosti a požadavcích na kofaktory ■ typ I: disponuje aktivitou reštrikční i modifikační; štěpí náhodně ve vzdálených oblastech od místa vazebného ■ typ II: štěpí uvnitř vazebného místa nebo v jeho sousedství; nedisponuje metylační aktivitou ■ typ III: disponuje aktivitou reštrikční i modifikační, štěpí náhodně nedaleko rozeznávacího místa, ■ typ IV: štěpí modifikovanou DNA (metylovanou, hydroxymetylovanou, apod.) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Reštrikční endonukleázy produkovány bakteriemi sekvenčně specifické endonukleázy štěpí obě vlákna dvouřetězcové DNA většinou rozeznávají palindromy (typ II) palindrom: z řec. palindromos, běžící pozpátku - platí pro slovo, větu, číslo, melodii, sled znaků, které lze číst v libovolném směru a vždy má stejný význam rozdělují se do tříd/typů ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 5'- 3'--- G A A ■ " ( c ■ \ A G .....3' .....5' 13 Reštrikční endonukleázy třídy II vážou se na specifická rozpoznávací (cílová) místa (4-8 pb), která mají povahu palindromu štěpí dvouřetězcové molekuly DNA hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě, které je uvnitř cílového místa nebo v jeho bezprostředním sousedství přerušení cukr-fosfátové kostry DNA štěpení se podrobují všechna cílová místa v molekule DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA EcoRI i riii ľicttah enzyme recognition site -gIaatt ttaaíg tut EcoR I site EíoR I site TAACACTTChATTCAATTCCATCCATCCATCCATTTACTCftATTCCATCCA, ATTCTCAACTTAAGTTAACGTACGTACGTACGTAAATGACTTAAGCTAGGT X TAAGAGTTG AATT C AATT & C AT li C AT t C AT & C ATTTA C T C A A I T C C A T C C A 1TTrTruf 1 rAA nmrnirr.ufr.iifr.u^ir.iniAi re*trktton fragment Orientace cílových míst je důležitá 5 ... NGAATTCN... ... NG + EcoRI 3 ... NCTTAAGN... ~ ... NCTTAAp pAATTCN... GN... 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... + EcoRI ♦ a/Iii + ... NCTTAAGN... ... NGAATTCN... (no digestion) ... NC ... NGAATTp pTTAAGN... [CN^_ ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 15 Reštrikční endonukleázy třídy II ■ molekulová hmotnost: 20000 - 100000 ■ v současné dobé známo více než 3500 endonukleáz třídy II ■ REBASE - The restriction enzyme database (http://rebQSe.neb. com/rebase/rebase.htmO ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Využití restrikčních enzymů ■ fyzikální mapování DNA ■ analýza genových polymorfizmu ■ změny v uspořádání molekul DNA ■ příprava molekulových sond ■ příprava mutantů ■ analýza modifikací DNA, atd. ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Reštrikční endonukleázy třídy II produktem jsou definované reštrikční fragmenty DNA, které lze rozdělit elektroforézou podle molekulové hmotnosti Fyzikální mapování genomů - reštrikční mapy LU < G) c\i cd o < O m t- oj co ^ uo oo m <<- lo cd Ö o 00 0.9^ 0.56^ ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Power supply Příklad reštrikční mapy DNA fága lambda A W B C D E FZUVGT H M L K I bi ■n xis «io til. NOt d O. OP Base pari 1 5000 10000 15000 20000 25000 1 1 1 I 1 I 30000 35000 40000 1 1 1 45000 1 1 Acc\ 1 2191 i 13070 | 3574 | 1 11828 |,4»4|| 0857 j 2710 j 5580 i Apa\ j 10090 j 38412 Ava 1 j 4720 j .4*77 |16Q2| 688S | 3730 11881 | 471* |16T4| 8814 1 SamHl J 5505 j 16841 | 5628 1 6527 I «W I 6770 1 Bd\ I »44 | | 4459 | 1890» 1 4623 6330 1 3684 ,1578, , Sg/ll || 22010 1 13286 | 2392 | | 9 Cvnl 1 2671S 1 7801 | 14183 EeoRI 1 21226 1 «•» 1 5843 i 7421 | 5804 1 3530 f H/nd III 1 23130 1 20Z7 1 2322 9416 I 1 «W7 1 «361 1 Kpnl | 17057 |1503| 29942 | | 5090 | 9624 1 2419 j 3161 pzeq 26282 Marl 45680 1 2822 1 Atol | 19329 1 4872 1 3967 1 16380 1 4254 1 Afcfel j 27631 | 2253 1 3796 | 2433 | |16S9|1774| «370 1 AAel 34679 1 138i3 Nru\ 1 4592 1 23460 1 3853 1 1 9401 1 M Pw\ 1 1193« [ 14321 | 9533 1 12712 Sa/l 32745 II 15258 Seal j 14423 | 2263 | 7001 |1578| 5539 1 15698 Srna 1 1 19399 [ 12220 1 «271 [ 8612 1 Spftl Ssŕl 1 2211 1 9790 1 11940 | | 3003 | 12044 1 9083 1 j 2477í 1106 1 1 22621 SstU 1_ 20323 1076 II 1 18780 i 8113 1 Stu] 1 12436 | 19044 |«S)| 6995 1 1 7886 j Styl Xba\ | 18329 1 1882| 2890 1 1 3472 1 1 6223 |1489| 7743 j «254 j | 24508 1 23994 Xhol | 33498 ■ 15004 Polymorfizmus délek restrikčních fragmentu Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) Změny u 400 kb fragmentu Výsledné fragmenty Zadná 400 Dráha Získání Ztráta restrikčního místa 250+150 600 B C Inzerce Delece 50 kb oblasti i i i i i i i i 450 350 D (bp) E GEL 600 500 450 400 350 250 200 150 100 75 Počet změn 0 Reštrikční mapování (5 000 bp fragment je štěpený dvěma restriktázami A a B) Fragmenty štěpené restriktázou B_ ^ A A1 2200 B1 2500 A1 1900 A2 A3 A4 B1 1900 B2 B3 A2 1400 A3 900 A4 500 B2 1300 B3 1200 800 600 900 900 600 500 800 500 300 300 A3=900 A1 =2200 A2=1400 A4=500 i 900 300 1900 600 800 500 900 300 1900 600 800 500 B3=1200 B1=2500 B2=1300 Produkty štěpení RE tupé („blunť) konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) Sma1 □ □ É3ČČČGGGE3 3' 5' 3' 5" □ DD □□■□CCC G G G O □ ■ □ □ g 5' 3' n n 5' 3' Blunt ends umu □ □ ■ □ ■ ostré (lepivé, „sticky") konce (po štěpení řetězců v místech obvykle vzdálených 1-4 nukleotidy) - 5'-přečnívající („overhang") - 3'-přečnívající ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA EcoRI □ n í A A t Ť C É! 3' 5' ^■□SCTTAAGIpn Psfl f □ □ □ □ □ ■ □ G □ ■ □ E! A A T CS 5' 3' A A □ m □ □ g ■ □ ■ ĚŮÉĚCTGCAG □ ■ □ Q G A 5' 5' Sticky ends 3' 13 G A C I 3' 5' ÚŮÚ _^ SŮIQČTGČA c□□■□■ 'gipi 5' 3' 5' .tíl G s 3' □ □ □ E3 □ 5' 3' Sticky ends Přečnívající konce usnadňují spojování různých fragmentů DNA Spojování fragmentů DNA je základem tvorby rekombinantní DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Cut site pp 1 ů G TTTT ČĎ A A G P P PPP □ 4 Cut site EcoRI cut fragment from another source ŮP P ŮG P P C A A Im "" '" C L II [] J] [] C] II P ITTTÍI t PQ □ P P P E P Mix and anneal C] i II [3 U 11" ■■ C] II p p ČÉŮŮ □ A A G U p p p Sticky ends annealed ready for ligation Názvosloví restrlkčních endonukleáz např. EcoRl ■ 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie (Escherichia) ■ 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie (coli) ■ označení kmene (serotypu) produkční bakterie (R) ■ římská číslice (I) vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Examples of restriction endonucleases Enzyme Recognition site Number of bases Ends generated Original source of enzyme EcoRl G/AATTC 6 5' sticky Escherichia coli R Y13 BanňU G/GATCC 6 5' sticky Bacillus amyloliquefaciens H BglU A/GATCT 6 5' sticky Bacillus globigii PsÜ CTGCA/G 6 3' sticky Providentia Stuartii Xmal C/CCGGG 6 5' sticky Xanthomonas tnalvacearimi Snui\ CCC7GGG 6 blunt Serratia marcescens SaißA /GATC 4 5' sticky Staphylocoeccus aureus 3A AM AG/CT 4 blunt Arthrohacter luteits Noil GC/GGCCGC 8 5' sticky Nocardia otitidis-caviaruni Pael TT A AT T A A 8 3' sticky Pseudomonas a lea Heenes Only one strand of the recognition site is shown, with a slash (/) showing the position of the cleavage site. All the examples shown are palindromic, so the sequence of the second strand, read as the reverse complement, and the position of the cleavage site, will be the same as that shown. Thus the reverse complement of 5'-GAATTC-3' is also 5'-GAATTC-3, and both strands arc cut by EcoKl between G and A. ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Příklady cílových míst RE místo štěpeni 5 "o A T A <> g g c £1 Hae iii c] [c| |g| |g| 3-"Q 0 0 o o kostra cukerných fosfátů / \_r "ô ô < o ô A"' [g] |g| + jej jej jej [c] [g] [g] ::p A A > A Av: 1 ô 6 o ô o ô cr ;;5zš |g| Ia| IaIĽTl LtJ |cj Eco ri |g| ičl ľŕl pŕl IaI IaI M "O Q 0 0 O O Q" . ÍS [Ť1_[Ť1 [a] [a] "o o o oTl) Q p Q Q Q Q [aj |a| LrJ lil lej "o, a A A H ĚI S S Alu i m lej |g| |a| "O o O 00"" p, a ,< a, A A" ÍTl |C1 ± O O 0 > P O" A A A A A A A A"" "A A .< 6. A A. A. A~XT" fel !S fel fel Ej S! ISl !S Noil |g| JCJ + |g] [g] |CJ [Cj |g| [C| iSl^lcllclNNlclIsl [cl N [či [či [g] |g| jej |g| "ô A P P o o o oo"' o o oo o o o > A P." "6. A A A A A f>'" B B @ S ä S Hind iii m m jej N R |a| ;;;o A po p p A.ľ. "o~7 o p o o ~o~ô~ + |a| |o| lei lii [TJ E m.[či H R - 0 0 O 0^^) 26 Izoschizomery různé RE se stejným rozpoznávacím místem (odlišní producenti, štěpení může být stejné nebo odlišné) izoschizomery mohou mít odlišnou citlivost k metylovaným bázím v cílové sekvenci Isoschizomers Products + Kasl 5 ...GGCGCC... 3' ...CCGCGG... + Narl ...G pGCGCC... ' ...CCGCGp j G... 5'...GG 3'...CCGCp PCGCC- (2 bp 5'overhang) j GG... ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 27 Izokaudamery ■ různé RE, které mají odlišné cílové sekvence, ale vytvářejí stejné lepivé konce ■ výhodné pro cílené spojování různých molekul DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Relaxovaná (uvolněná) specifita (hvězdičková aktivita) enzymu schopnost RE štěpit kromě cílového místa také jiné - příbuzné sekvence většinou za neoptimálních reakčních podmínek např. EcoRI může vedle sekvence GAATTC štěpit i sekvence GGATTC, GGATTT, AGATTT Complete digestion Incomplete cleavage i Star activity ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 29 Jednotka aktivity restrikčního enzymu množství RE, které zcela rozštěpí všechna cílová místa v 1 \xg DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí •restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů Počet restrikčních míst v molekule DNA statisticky závislý na velikosti (DNA i cílového místa) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů •reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Number of restriction sites DNA Genome source size (kb) 4bp 6bp 8bp 1 pUC19 3 10 0-1 0-1 2 SV40 5 20 1 0-1 3 Bacteriophage X 48 190 12 0-1 4 Bacteriophage T4 165 660 40 2-3 5 Bacteria 4700 18400 1100 70 6 Yeast* 16000 62500 390Ó 250 7 Fruit fly* 120000 470000 30000 1800 8 Mammals* 3000000 11700000 730000 46000 * Haploid values (most somatic cells have twice as much DNA) DalSí nukleázy ■ rozkládají molekuly DNA nebo RNA porušením fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy bez sekvenční specifity jejich aktivity jsou nežádoucí při izolacích nukleových kyselin - narušují integritu vzorků odlišnosti v substrátové specifitě, požadavcích na kofaktory nebo ve způsobu degradace substrátu (exonukleázy, endonukleázy, příp. obě aktivity současně) DNasc -Base Vy H DNbm YV \y -Base -^ Y> H/^Base Vy H H — Base H • ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 32 Exonukleázy versus endonukleázy ■ exonukleázy postupně odstraňují nukleotidy od konce molekuly DNA ■ endonukleázy štěpí vnitřní fosfod i esterové vazby v molekule DNA Exonukleáza Štěpení -ô-ô-ô-ó-ô-c^— Vodíková vazba Endonukleáza Štěpení \^ Nukleotid 1 Fosfodiesteroká vazba f Štěpení ~*Ok ~o ^~^~^~"q q^""q^""o^~o"~q^""o""o^ ó""ó~o~o^~ —O- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 \ -o-o- -o-o-o-o- -o-o-o -o-o-o-o-o- -o-o-> I 1 1 1 1 lil 1 1 1 1 1 II -o-o- -o-o-o-o- -o-o-o- -o-o-o-o-o- -o-o- ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Deoxyribonukleáza I (DNáza I) Aktivita: ■ nespecifická endonukleáza ■ v DNA vytváří zlomy, od kterých se DNA degraduje na mono-/oligonukleotidy Substrát: dvouřetězcová (ds) i jed n o řetězcová (ss) DNA Hlavní produkty: mononukleotidy, dinukleotidy, trinukleotidy, tetranukleotidy fosforylované na 5'-konci DNáza I -o-o-o- -o-o-o-o-o- -o-o-o- i i i ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA -o-o -o -o-o-o- -o-o- Deoxyribonukleáza I (DNáza I) Vliv kofa kto rů: ■ za přítomnosti Mg2+jsou místa štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích: náhodné zlomy ■ za přítomnosti Mn2+jsou přednostně štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě: tupé konce nebo přesahy 1 - 2 nukleotidů Využití: ■ nízké koncentrace: vytváření jednořetězcových zlomů v ds DNA před značením „nick translací" ■ vyšší koncentrace: odbourání DNA z roztoků RNA ■ analýza interakcí protein-DNA („DNase footprinting") ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Nukleáza Bal31 ■ štěpí lineární dsDNA od obou konců ■ ssDNA uvnitř molekuly Aktivita: ■ endonukleázová pro ssDNA ■ exonukleázová pro dsDNA 5' -> 3' ■ exonukleázová pro dsDNA 3' -> 5' Podmínka aktivity: ■ přítomnost iontů Ca2+ (možnost inaktivace chelatačními činidly) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA I ^-9-9-9-0-0-9-0-0- -O Nukleáza Bal31 Zdroj: ■ bakterie Alteromonas espejiana Využití: ■ cílené zkracování dvouřetězcové DNA od obou konců ■ zavádění delecí ■ odstraňování jednořetězcových oblastí z duplexů DNA/RNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Nukleáza S1 Endonukleáza specifická pro ssDNA a RNA Zdroj: Aspergillus oryzae Využití: ■ odstraňování ssDNA z dsDNA a duplexů DNA/RNA ■ mapování intronů analýzou hybridních molekul DNA-mRNA ■ odstranění jednořetězcových konců DNA: zatupení ■ produktem jsou nukleotidy fosforylované na 5'-konci ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA £1 rmU»é** I ■o-o-o- - I Nukleáza Exolll Aktivita: ■ exonukleáza 3'-5' ■ katalyzuje postupné odstraňování 5'-mononukleotidů z 3'-OH konců dsDNA (na dsDNA postupně zkracuje každé vlákno od 3'-konce) Substrát: ■ preferovaná je dsDNA s tupými nebo 5'- přečnívajícími konci ■ nízká účinnost na dsDNA s 3'- přečnívajícími konci ■ inaktivní na jednořetězcové DNA Zdroj: E. coli ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Exonukleáza III 5' 3' Nukleáza Exolll Využití: ■ vytváření jednosměrných delecí od konců linearizovaných fragmentů DNA ■ místně-specifická mutageneze ■ příprava jednořetězcových sond nebo substrátů pro sekvenování DNAdideoxyterminační metodou ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Příprava jednosměrných delecí pomocí Exolll ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Promoter 5' GATCC I 3' G' 5' GATCC GATCC Single-stranded DNA Promoter intact Cloned cDNA Cleave DNA with Ps/I and BamHI Exonuclease Nuclease SI Ligate linker CTGCA G CTGCA G Extent of deletion controlled CTGCA G by time of digestion C G C G \ cDNA remaining after deletion Nukleáza fága Lambda (Lambda Exonuclease) Aktivita: ■ exonukleázová, odstraňuje 5'-mononukleotidy z dsDNA ve směru 5'^ 3' ■ produkty jsou 5'-nukleosidmonofosfáty Substrát: preferovaná je dsDNA Zdroj: bakterie E. coliinfikované fágem Lambda Využití: vytváření jednosměrných delecí ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 42 Umělé nukleázy ZFN („zinc-finger nuclease") TALEN (^transcription activator-like effector nuclease") ■ chimérické nukleázy složené z „programovatelné" sekvenčně specifické domény pro vazbu na DNA a domény pro nespecifické štěpení DNA ■ připravené genovým inženýrstvím ■ způsobují přerušení obou řetězců dsDNA („double-strand breaks") ■ aktivují opravné mechanismy, kterými lze za přítomnosti specifického templátu vnášet trvalé a cílené změny do genomu buňky ■ nukleázy „na míru" lze připravit technikami rekombinantní DNA v podobě sekvencí, které je kódují a přenést do buněk transfekčními nebo infekčními postupy ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Umělé nukleázy ZFN Zinc Finger Nuclease TALEN Transcription Activator-Like Effector Nuclease la®* Left ZFN spacer Right ZFN 9 nt target site 5-7 nt 9 nt target site Mil I NN HI IUI I.....II _1 fokl I LMM Left TALEN 16-17 nt target site spacer 16-19 nt NUN UN Right TALEN 16-17 nt target site MU I MM HI Mill TTT [ill IĽO NU HUI IN HU I indel ■ ZFNs a TALENs se navážou na cílovou sekvenci a orientují doménu restriktázy Fok\ tak, aby mohla štěpit DNA ■ mají vícenásobné domény pro vazbu na DNA uspořádané do sérií ■ každá řada se váže na samostatnou vazebnou sekvenci ■ dimenzovaná nukleáza Fok\ štěpí DNA obou řetězců v oblasti zvané „spacer" ■ vzniklé zlomy jsou opraveny buněčnými reparačními mechanismy které často vedou k inserci nebo deleci několika bází („indels") ■ pomocí současně doručených homologních ramen lze rekombinací dosáhnout stabilní integrace transgenu do genomu hostitele („genome editing") ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 44 Nukleázy Cas v systému CRISPR ■ bakteriální DNáza pro ochranu před horizontálním přenosem genů ■ má dvě střihová místa - jedno pro každé vlákno DNA ■ pomocí naváděcí „guide" RNA lze nukleázu zacílit na libovolnou sekvenci DNA a rozstřihnout ji ■ vyžadují navržení mezerníků a konstruktů pro syntézu proteinů, které dokáží rozeznat cílovou sekvenci DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA pHpNpHpŮp +GHP + HüNfjNpNpGü + NpGp + NpNpN N -any rixnudeoside. ercept G (i.e. A. Coř U) G -guanosine p -phoaphate ■ degraduje specificky RNA v místech G Substrát a aktivita ■ štěpí RNA v poloze 3'-fosfátů guanosinových nukleotidů: ■ vznikají oligonukleotidy s 3'-koncovými GMP Využití ■ odstraňování nespárovaných oblastí RNA z hybridů DNA/RNA ■ sekvenování RNA ■ mapování/studium struktury RNA Zdroj: Aspergillus oryzae (dnes příslušný gen klonován v E. coli) Ribonukleázy Ribonukleáza T1 ■ sekvenčně specifická ribonukleáza ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 46 Ribonukleáza A (RNáza A) 5' CH; Base HC ( Phosphodiester bond RNase A H, 0 Substrát a aktivita ■ endoribonukleáza degradující RNA do oligonukleotidů fosforylovaných na 3'-konci ■ štěpí fosfodiesterovu vazbu mezi ribózou a fosfátovou skupinou Využití: ■ eliminace nebo snížení koncentrace kontaminující RNA v izolátech DNA ■ mapování mutací v DNA nebo RNA štěpením nespárovaných oblastí RNáza štěpí RNA v hybridech RNA/DNA v místech nespárovaných oblastí (jednořetězce), produkty štěpení jsou následně analyzovány ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy •další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA DNA-ligázy enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby za spotřeby ATP nebo NAD význam při replikaci, rekombinaci a opravě DNA Oprava přerušeni Přerušení DNA ligáza mohou spojit dva fragmenty dvouvláknové DNA -využití při genových manipulacích ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy •DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Spojení obou molekul I DNA ligáza ■ i i i i i i i i -00-00 o-o-o-oo Reakce katalyzovane DNA-ligázami ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy •DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Nick OH , E>—- r AMP -OH 5 3' Nicked DNA Ligase-AMP —*- Ligase PPi ATP AMP Nicked DNA is joined 49 Použití DNA-ligáz příprava rekombinantní DNA spojování fragmentů DNA různého původu (reštrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.) s komplementárními konci připojování spojek a adaptérů cirkularizace lineárních molekul DNA Ligace tupých koncu • • • • • ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy •DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Ligace kohezních koncu -o-o-o Prerušení Prechodné • • • párování bazí \ DNA ligáza zaplňuje přerušeni_ 50 Běžné typy DNA-ligáz T4-DNA-liciáza ■ izolována z buněk E. coli infikovaných fágem T4 ■ spojuje lepivé i tupé konce DNA ■ opravuje jednořetězcové zářezy („nicks") v dsDNA, RNA a hybridech DNA/RNA ■ vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5'-konci a OH skupiny na 3'-konci molekuly Insert I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ATCNNNNNNNNNNNNNNN TAGNNNNNNNNNNNNNNN ..................p 5 Vector Bakteriální DNA-ligáza ■ izolována z buněk E. coli ■ spojuje jen DNA s lepivými konci ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy •DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA backbone ^ DNA fragments join at stick) ends insert Sticky end Recoinhiiunt DNA 51 Polymerázy ■ syntetizují nukleové kyseliny postupným doplňováním nukleotidů k 3'-OH konci primeru ■ není známá žádná polymeráza prodlužující 5'-konec DNA ■ matricí (templátem) je jednořetězcová DNA nebo RNA ■ polymerázy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce Základní reakce Primer Nově syntetizované vlákno i i O" -A-T-G-C- A-T-T-G C A-T ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA T-A-C-G T-A-A-C-G-T-A-v Tempiát _T_A-C G-T-A-A-C-G-T-A-5' 3 5 Polymerace DNA tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3'-OH skupiny rostoucího řetězce na 5'P -dNTP za odštěpení pyrofosfátu ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA DNA polymerase &<Ěr® rn nucleoside V triphosphat .A ■- :- T . C A . c . .G . G Extension [error] . .C . G 5' Proofreading Extension 53 DNA-polymeráza I 3 aktivity, jejichž rychlost je ovlivněna stavem DNA a koncentrací dNTP: ■ DNA-dependentní DNA polymerační ■ 3' -» 5' exonukleázová ■ 5' -» 3' exonukleázová Polymerace: nové nukleotidy připojovány pouze na 3'-konec nově vznikajícího řetězce: prodlužování ve směru 5' -» 3' ■ matrice čtena ve směru 3' -» 5' ■ požadavek přítomnosti primeru Exonukleázová aktivita: ■ 3' -> 5': oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo („proofreading") ■ 5' -> 3': využití při opravách a značení DNA („nick translace") (b) DNA polymeráza 1 Zářez (mezera) Stávající nukleotidy jsou nahrazeny ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA -T-A-C-G-T-A-A-C-G-T-A- -A-T-G- G-C-A-T- -A-T-G-C-A-T- T-G-C-A T--T-A-C-G-T-A-A-C-G T-A- 54 DNA polymeráza I - struktura ■ jeden aminokyselinový řetězec (109 kDa) ■ distinktní domény pro jednotlivé funkce ■ vysoká evoluční konzervativnost ■ tvar molekuly připomíná dlaň, palec a prst ■ prstová doména - váže nukleosidtrifosfáty, palcová doména zajišťuje procesivitu (procesivita = průměrný počet nukleotidů, které enzym zvládne pospojovat při každém připojení k templátu), translokaci a správné umístění DNA ■ dlaňová doména - zajišťuje polymerační aktivitu ■ proteolýzou lze vytvořit zkrácené varianty, které postrádají některou z domén ■ DNA-polymeráza I je vhodná pro značení DNA, syntézu ds cDNA a pro modifikaci konců při tvorbě rekombinantních molekul DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Klenowův fragment DNA-polymerázy I vzniká odstraněním N-koncové části DNA-polymerázy I štěpením subtilisinem postrádá exonukleázovou aktivitu 5'-3' DNA polymerase I Holoenzyme polymerase domain Proteolysis L 5' -> 3' eKonuclease 3' -> 5' exonuclease domain domain CP \__/ Large fragment [Klenow fragment] 0 5' ■> 3' enonuclease ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Struktura DNA-polymerázy typu Klenow Klenowův fragment DNA-polymerázy I syntetizuje vlákno DNA komplementární k danému templátu na rozdíl od původní DNA pol I - jakmile vyplní mezeru, nemůže v syntéze pokračovat komerční enzymy: produkty exprese zkráceného genu v bakteriích ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA (b) DNA polymeráza I 2áfe2 (mezera) Stávající nukleotidy jsou nahrazeny -A-T-G- G-C-A-T ■ ■ ■ ■ * * * -T-A-C-G-T-A-A-C-G-T-A-(c) Klenoxův fragment -A-T G ■ G-C A-T- ■ h ■ p ■ ■ ■ _T-A- C-G-T- A -A-C-G T-A- -A-T-G-C-A-T^T-G^C-A J--T-A-C-G-T-A-A-C-G-T-A- Zaplněn je Stávající nukleotidy pouze nick nejsou nahrazeny ^T-G-C-A-T-T G-C-A-T-_T_A_C-G- T-A-A-G-G-T-A- 58 Klenowův fragment DNA-polymerázy I - využití ■ syntéza dvouřetězcové DNA z jednořetězcových templátů oligonucleotide GJkGTTC 3 1 JmCCTCJUlGTCCCjlTGCCTCjlGCCnTjlCTCCGGjlTJlGCCTCJlCGjlTCCCIlTCJlTTC 5 tlATP, dCTP, dGTP, dTTP GAGT T CAGGCT ACGGACT C GGT AT C AGGC CT AT CGGAC T GCT AGGC T 3 ' AAGC T C AAGT C CGAT GC C TGAGCC ATAGT CC GGAT AGC C TGAC GAT CC GATC ATT C 5 ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA pnmer template DNA K léno w fragment. Klenowův fragment DNA-polymerázy I - využití Doplnění zkrácených 3'-konců fragmentů DNA („fill-in reaction") vytváření tupých konců vhodných pro klonování. 5' A-G-G-C-A-G 3' T-C-C-G-T-C-C-T-A-G Klenow and \ i-G-A-T-C nucleotides / 3 ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Klenowův fragment DNA-polymerázy I - využití Odstranění přečnívajících 3'-konců (zatupení) s využitím 3'^ 5' exonukleázové aktivity: vytváření tupých konců vhodných pro klonování Odstraňování nukleotidů od 3'-konců má tendenci pokračovat i po zatupení, ale za přítomnosti nukleotidů je tato aktivita vyrovnána aktivitou polymerační a vede k tvorbě tupých konců ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 5' G-A-C-G-A-G-C-T 3" C-T-G-C Klenow 5' G-A-C-G 3' C-T-G-C T4 DNA-polymeráza ■ DNA-polymeráza fága T4 ■ polymerázová aktivita 5'^ 3' ■ exonukleázová aktivita 3'^ 5' (200 x vyšší než u Klenowa) ■ 5'^ 3'exonukleázová doména chybí ■ využití při značení 3'-konců DNA nahrazovací reakcí: exonukleázová aktivita degraduje ds DNA za tvorby molekul s překrytými 3'-konci. Po přidání značených dNTP jsou konce doplněny polymerační aktivitou enzymu ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA T7 DNA-polymeráza ■ DNA-polymeráza bakteriofága T7 Aktivity: ■ DNA-polymerázová 5'^ 3' ■ 3'-» 5' exonukleázová ■ 5'-» 3'exonukleázová doména chybí ■ velmi podobná Klenowovu fragmentu a T4 DNA-polymeráze ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 63 T7 DNA-polymeráza - výhody Vysoká procesivita: Průměrná délka syntetizované DNA před tím než enzym disociuje od templátu je podstatně vyšší než u jiných enzymů. Využití při sekvenování DNA Sekvenáza - chemicky ošetřený nebo genetickými manipulacemi vytvořený derivát T7 DNA-polymerázy, postrádající i 3' -» 5' exonukleázovou aktivitu ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy •polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Termostabllní DNA-polymerázy Katalytická aktivita je maximální mezi 75 a 80°C a klesá při nižších teplotách. Kromě Taq DNA-polymerázy bylo izolováno několik dalších termostabilních DNA-polymeráz, např. Pfua Vent polymeráza Taq z Thermus aquaticus, poločas života je 1,6 hod v 95°C Pfu z Pyrococcus furiosus, která má nejvyšší přesnost Vent z Thermococcus litoralis, poločas života je 7 hod v 95°C ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Termostabilní DNA-polymerázy ■ nepodléhají denaturaci teplem (podmínkou PCR je, že enzym vydrží teplotu denaturace DNA) ■ Využití pro PCR - katalyzují syntézu DNA z nukleosidtrifosfátů na templátech (jako jiné DNA-polymerázy) ■ požadavky pro iniciaci polymerace: - volná 3'-OH skupina - přítomnost horečnatých iontů ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Zpětná (reverzní) transkriptáza ■ RNA-dependentní DNA-polymeráza ■ přepisuje genetickou informaci z RNA do DNA ■ nutná přítomnost primeru a templátu ■ poskytuje v první fázi hybrid RNA/DNA, po odstranění RNA působením hydroxidů nebo RNázy H lze zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA ■ syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA-polymeráza I Zdroi: retroviry M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) AMV (Avian Myeloblastosis Virus) RSV (Rous Sarcoma Virus) Objevitel zpětné trankriptázy Howard Temin (1934-1994) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Zpětná (reverzní) transkriptáza Aktivity: ■ polymerázová: v životním cyklu retrovirů se uplatňuje pouze při kopírování RNA, v laboratoři lze využít pro zpětnou transkripci jednořetězcové RNA i replikaci jednořetězcové DNA; v obou případech je pro iniciaci syntézy nutná přítomnost primeru ■ 5 ^ 3 exoribonukleázová ■ 3' -» 5 exoribonukleázová a endoribonukleázová (RNáza H): zajišťuje degradaci RNA z hybridů RNA-DNA, které vznikají při zpětné transkripci. Využití: tvorba komplementární DNA (cDNA) - nespecificky (primer: oligo dT) - specificky (primer: komplementární k 3'-oblasti určité mRNA) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Využití zpětné transkriptázy Syntéza cDNA: inkubace mRNAs krátkým (12-18 bází) polymerem tymidinu (oligo dT), který se váže na polyA mRNA a zpětná transkriptáza jej využije jako primer pro iniciaci syntézy prvního řetězce DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA AC GGCUAUAC C GCUAGC CUAAGCAAAAAAA TTTTTTT primer—A AC GGCUAUAC C GCUAGC CUAAGCAAAAAAA reverse transcriptase -r dATP, dCTP, dGTP, dCTP TGCCGATATGGCGATCGGATTCGTTTTTTT AC GGCUAUAC C GCUAGC CUAAGCAAAAAAA Syntéza cDNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA tkáň (např. mozková) lýze buněk a purifikace mRNA 5' mRNA 3' -AAAAAAA hybridizace s poly(T)-primerem 5' mRNA vytvoření kopie pomocí reverzní transkriptázy cDNA 3' 3'-konec cDNA tvoří vlásenku užití alkalického roztoku pro odbourání RNA syntéza komplementárního DNA-řetězce s použitím DNA-polymerázy; spárovaný 3'- konec funguje jako primer 3' -AAAAAAA M i I I I I TTTTTTT 3' 5' AAAAAAA TTTTTTT ■TTTTTTT 5' 5' reakce s jednořetězcovou DNA-nukleázou štěpí vlásenku 5" 3' _____ 5' dvouřetězcová cDNA je kopií původní mRNA Syntéza cDNA - alternativy 3' r- ccccc Alkali.nbonuclease S' dCTP Terminal transferase - 5' 5' AAAAA-3' T T T T T - 5' mRNA oligo ( 4 Nick unligated 79 Použití alkalické fosfatázy při klonování DNA Plasmid cut open (linear DNA) Recircularization of plasmid Alkaline phosphatase zabránění nechtěné recirkularizaci „prázdného" vektoru rekombinantní vektor je scelen reparačními procesy v transformovaných buňkách DNA ligase —X—► No reaction HO OH HO" P- •P •HO Foreign DNA fragment DNA ligase ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA Fig. 6.5 : Action of alkaline phosphatase to prevent the recircularization (religation) of vector plasmid. 80 Polynukleotidová kináza T4 Funkce: ■ katalyzuje přenos P z yATP na 5'-OH skupinu polynukleotidů (ss i ds DNA a RNA) a nukleosid 3'-monofosfátů (resyntéza fosfomonoesterových vazeb za spotřeby ATP) ■ má i fosfatázovou aktivitu a proto může katalyzovat výměnu fosfátových skupin na 5'-konci (využití pro značení fragmentů nukleových kyselin na 5'-koncích pomocí 32P) Zdroj: - původně bakterie E. coli infikované fágem T4, komerční preparáty jsou obvykle produkty bakteriální exprese klonovaného genu (b) Polynukleotidová kináza ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA Polynukleotldová kináza T4 Enzymová aktivita se využívá ve dvou typech reakcí: ■ "forward reaction"- přenos fosfátu y z ATP na 5'-konec DNA nebo RNA; cílový Polynukleotid nemá 5'-fosfát, protože byl defosforylován nebo tak byl chemicky syntetizován "exchange reaction", cílová DNA nebo RNA, která nese 5'- fosfát je inkubována v nadbytku ADR Za těchto podmínek PNK nejprve přenáší fosfát z nukleové kyseliny na ADP za vzniku ATP a defosforylované cílové molekuly; následně PNK běžnou reakcí „forward" přenese fosfát z ATP na cílovou NK. ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA Forward Reaction Exchange Reaction 5' P OH 3' 5' HO' OH 3' ADP ATP PNK r S' HO' PNK T ■+ ATP 1 OH 3-" ¥ ADP ATP sJ OH 3' ADP 4- PNK T sJ OH 3J Polynukleotidová kináza T4 Využití: ■ značení 5'-konců DNA nebo RNA pro přípravu hybridizačních sond a sekvenování DNA ■ připojení 5'P k oligonukleotidům (např. linkerům a adaptérům) a fragmentům DNA pro umožnění jejich ligace nebo amplifikace ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA Terminálni deoxynukleotidyl transferáza ■ připojuje deoxynukleotidy k 3'-koncům ss nebo ds DNA Substrát: ■ přečnívající, zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA (preferovanejšou přečnívající 3'-konce) nebo jed n o řetězcová DNA ■ nevyžaduje matrici ani primer ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA (c) Terminálni deoxynukleotidyl transferáza 0) 5' 3' (ii) 5' 3' Terminálni deoxynukleotidyl transferáza Kofaktor: kobalt Zdroj: telecí brzlík (jedná se o savčí enzym exprimovaný v lymfocytech, komerčně dostupné varianty jsou produktem exprese hovězího genu v E. coli) Využití: ■ přidání homopolymerních konců k 3'-koncům DNA ■ značení 3'-konců DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA dGTP V 5' Terminal transferase Přidání homopolymerních konců terminálni transferázou Využití: klonování DNA Princip: Terminálni transferáza se využije k přidání úseku polyG k linearizovanému plazmidovému vektoru a k přidání úseku polyC ke klonované DNA; po smísení a inkubaci obou molekul dojde k vazbě komplementárních úseků a tím ke včlenění klonované DNA do vektoru, který se pak použije k transformaci E. coli ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA ^Linearized plasrnid J + dGTP cDNA terminal transferase + dCTP r ■GGGGGGG GGGGGGG- ■CCCCC CCCCC- r -GGGGGGG-CCCCC- ■CCCCC -■GGGGGGG- Výhody terminálni transferázy (a) Syntéza homopolymerního konce 3' '5' velikost připojených úseků nemusí být stejná (pokud se jedná o úseky větší než 20 nukleotidů, jejich párování je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě) v transformovaných buňkách se nespárované oblasti opraví reparačními mechanismy ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA Terminálni transferáza + dCTP (b) Ligace homopolymerních konců Vektor - poly(dC) konce Vložit DNA -poly(dC) konce Molekula rekombinantní DNA (c) Opravné kroky Nick / G-G-G-G / c-c-c-c-c-c-c- Přerušení Klenowova polymeráza opravuje zářez •..... -G-G-G-G-G-G-G-j c-c-c-c-c-c-c/ >^ Ligáza opravuje J přerušení Značení 3-konců terminálni transferázou Substrát: obvykle fragment ds DNA s 3'-přečnívajícím koncem připravený restrikčním štěpením Princip: DNA je inkubována se značenými nukleotidy, terminálni transferáza začlení skupinu nukleotidů k 3'-přečnívajícímu konci G-A-T-C-A-C-T-G-C-A-T-T-T-T-T-T-T T-T-T-T-T-T-T-A-C-G-T-C-T-A-G-T-G ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy •další enzymy ■enzymy a klonování DNA 5G-A-T-C-A-C-T-G-C-A A-C-G-T-C-T-A-G-T-G 5. Terminal transferase dTTP Přehled enzymů používaných při manipulaci s DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA 5'P' 3'N-N-N-N' terminálni transferáza 5'P 3'OH dNTP N-N-N-N3' 5'P 3'OH 5'p DNA-ligáza ATP- alkalická fosfatáza 5'OH" 3'OH' DNA-ligáza ATP' 3'OH 5'OH mdonukleázy 5'P' 3'OH' DNA-polymerázy dNTP 5'P-3'0H« '3'OH "5'P exonukleázy -3'OH -5'P DNáza I mono- a oligonukleotidy 89 Enzymy a klonování DNA ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA O^^Gen Molekula rekombinantní DNA Metody spojování molekul DNA s lepivými konci: ■ za vhodných podmínek dochází k párování komplementárních úseků, kovalentní spojení zajistí DNA-ligáza s tupými konci: ■ vysokými koncentracemi T4 DNA-ligázy ■ přeměnou tupých konců na lepivé prostřednictvím linkerů/adaptérů s přečnívajícími konci, které nejsou kompatibilní: ■ terminálni transferázou přidat k 3'-koncům jednoho fragmentu homopolymerní extenze (např. poly-dA) a k 3'-koncům druhého fragmentu komplementární homopolymerní extenze (poly-dT) ■ „zatupení" konců (polymerace, degradace) ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA Vytváření rekomblnantních molekul DNA (A) SPOJENI DVOU KOMPLEMENTÁRNÍCH NEROVNÝCH KONCŮ 5' "Q < 3' 0 0 0 0 0 0" 3" B m m H El 3- Q Q Q 0 0 0 5' + ligáza » ATP 3' OĽ s1 5-"Q ooooo Q*** 3- 3-" 0 0 0 0 0 0 0" 5' rekombinantni DNA (B) SPOJENI DVOU TUPÝCH KONCŮ '"o~o~7 \g\ \g\ ó, 0 P" |C| [Ti + [C] [C] |G| |A| ' oo c -? o o:: + ligáza > ATP "6 6 P ó P"" 0 g | E [q |cl |g| [Ä] - p' P P P <5~ rekombinantni DNA (C) SPOJENI TUPÉHO KONCE S NEROVNÝM KONCEM [č] $ mm H W o o oo y-^ ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a Honování DNA + deoxyribo nukleotidy ______ a Vh ffl 5j + polymeráza [cl m [?] R n "Q 0 0 0 0 P ♦ ligáza + ATP r o~X?" Lcj icj [g| [g| > o o" "ó, ,ó. A ,ó, ,ó °. ,ó. ,ó""" Igl W W ffl ij jfi S! S m m Pi Pl |g| N - p1 'p' 'p' 'p' 'p' 'p' 'p' 'o - rekombinantni DNA Lepivé konce zvyšují účinnost ligace tupé konce ■ ligace není efektivní ■ setkání konců DNA pro ligační reakci je náhodné ■ vhodné zvýšení koncentrace DNA kohezní konce ■ probíhá s vyšší účinností ■ využití tvorby vodíkových vazeb komplementárních bází ■ prodloužení doby, kdy jsou konce v kontaktu ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA LIgace tupých konců nezaručuje jednotnou orientaci Blunt end ligation can combine fragments from different restriction enzyme digestions... Insert Recombinants (with blunt ends) Hindi £ Hindi ^^r^ Smal ^^^L | Vector/plasmid (opened with the blunt-cutter Smal) + ligase (a) ..but the products are heterogeneous! ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA Sticky end' ligations combine only fragments with matching restriction enzyme digestion-produced overhangs.. Insert Recombinants (with different, 'sticky' ends) PstI EcoRI PstI /EcoRI Vector/plasmid (cut to generate insert-matching ends) + ligase ■ (b) ..but the products are more uniform Úpravy konců fragmentů DNA Přeměna lepivých konců na tupé: ■ doplněním chybějících nukleotidů polymerací („filling in") ■ odstraněním přečnívající sekvence („trimming back") ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA Doplnění 3-zkrácených konců DNA i umožněny přítomností 3'-OH skupiny, která se uplatní jako primer i chybějící sekvence je doplněna polymerací a) Filling in 5' OH 3' LI □ G C A A EcoRl sticky end Extension by addition ol nucleotides to 3-QH 5' □ 3' □ El G A A C T T A A ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA 96 Úpravy 3p ře č n ívaj í c í c h konců DNA ■ doplnění polymerací není možné ■ k zatupení je třeba použít enzym, který disponuje 3'^ 5'-exonukleázovou aktivitou (např. Klenow, T4 DNA-polymerázu) b) Trimming back 5' Psřl sticky end m □ □ d ■ 3' C G 3' Removal of unpaired bases by 3'-5' exonuclease G Č Á action 5' 5' 3' □ m □ m c mm g 3' 5' ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA 97 Linkery ■ krátké synteticky připravené oligonukleotidy (např. CCGGATCCGG) ■ nesou cílovou sekvenci pro RE (např. BamVW - GGATCC) ■ v případě, že jsou autokomplementární, postačuje jen jeden řetězec ■ mají tupé konce Použití: ■ linker se připojí k tupým koncům DNA ■ štěpením RE se vytvoří jednovláknové lepivé konce DNA ■ spojení původně nekompatibilních molekul DNA ligací Význam: ■ umožňují opatřit jakoukoliv DNA žádoucími konci ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA 5' 3' CCGGATCCGG Self-complementary oligonucleotide GGCCTAGGCC 3-1 I I I 1 I I I I 15- Blunt-ended (Sma1) fragment 5' - - i i i i i i i 3' 5' t Anneal 3' CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 3' 5' - 3' AAliUUAAUUAU Tm?mmmm__ I Cut with BamW AUAUUW TTmffffffTŤf.. Fragment with sticky ends 98 Použití linkerů pro usnadnění vazby linkerů a ligace „na tupo" se používají vysoké koncentrace linkerů muze dojit k vazbě vetsiho počtu linkerů za sebou odstraní se následným štěpením ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA (a) Typický linker C-G-A-T-G-G-A-T-C-C-A-T-C-G III.......I I I I G-C-T-A-C-C-T-A-G-G-T-A-G-C Místo SamHI (b) Použití linkerů Molekula s tupým koncem / c=3 ^2 Linkery t? c? DNA ligáza Barn HI Připojené linkery Kohezní konec Bam s Nevýhoda llnkerů reštrikční místo linkeru nesmí být přítomno uvnitř klonované sekvence earn HI ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-lígázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a kíonování DNA Rozštěpeni z důvodu existence vnitřních míst BamH\ 100 Adaptéry Použití: přeměna tupých konců na ostré přeměna jedné přečnívající sekvence na jinou S'i Two synthetic, partly ^-. complementary, oligonucleotides GGGCCCTTAA ......II \s GATCCCCGGG 5' 3' ■■■■ íí~íí~G mi S3 C C T A G Fragment with BamHl sticky ends 3' GATCCCCGGG GGGCCCTTAA 5' Li g ate GATCCCCGGG CCTAGGGGCCCTTAA Fragment with fcoRl compatible ends dvojice krátkých synteticky připravených oligonukleotidů, které se spolu částečně párují a přitom vytvoří krátký fragment dvouřetězcové DNA zakončený jedním tupým a jedním přečnívajícím koncem nebo dvěma přečnívajícími konci ostrý konec je získán bez restrikčního štěpení ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA 101 Nevýhoda adaptérů pokud se jedná o adaptéry s jedním ostrým a jedním tupým koncem: kohezní konce jednotlivých adaptérů se mohou párovat mezi sebou, čímž vznikají dimery - a nová molekula DNA má znovu konce tupé (a] Typický adaptér g-a -T—C-C-C-G —G I I I I G-Gr-C-C 4-*-' Kohezní konec SamHI (b) Adaptéry w mohou vzájemné ligovat g—c-g—□ 1 1 1 1 g-a-t- -c- i i i g-g-c- g ■ 1 1 1 g-g-c-c- -c-t-a -g 1 c ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA (c) Nová molekula mé stál* tupé konce Molekula zametená tupými konci Adaptéry se vzájemné ligují 102 Řešení: ■ defosforylace adaptérů - OH skupina místo fosfátu na 5'-konci znemožňuje vzájemnou ligaci adaptérů ■ fosforylace adaptéru Polynukleotid kinázou se provádí až po připojení ke klonované DNA, před spojením s vektorem ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA (a) Přesná struktura adaptéru HO. Modifikovaný konec 5-OH G-A-T-C-C-C-G-G' I I I I G-G-C-C. HO OH •P023 (b) Ligace použitím adaptérů ho—q Molekuly s tupými konci °-0H HO-n Adaptéry °-OH DNA ligáza r, HO ^-OH OH <í> Polynukleotidová kináza 2o3p- \ poi Keiner *i'-P 103 Přestavba restrikčního místa 4?a/7iHI-přehled ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■reštrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy ■enzymy a klonování DNA Sl-nukleáza -G -c G- Pol -GGATC GATCC -CCTAŮ CTAGG--GG a) GATCC -CCTAG GG- Sl-nakteáza — GG -CC CC-GG- klonovaný fragment dna -GG CC-GG CC- CC GG-CC ******* Jednořet&cové přesahující konce k: ■) odstranit (hydroryiovat), b) zaplnit c) nebo částeíaé doplnit. Ariž dojde ke zmínž struktury klooormého fragmentu, je reštrikčná místo pro BunHT bud a) odstraněno b) regenerováno c) nebo změněno Způsoby modifikace konců DNA - přehled ■enzymatická manipulace s nukleovými kyselinami ■přehled enzymů ■restrikční endonukleázy ■další nukleázy ■DNA-ligázy ■polymerázy ■další enzymy •enzymy a klonování DNA 5'-G0H 3' Alkaline -^. 5-Goh 3" 3'-CpTpTpApAp5. phosphatase 3-CpTpTpApAoH^ 5-Goh 3' y-32P-ATP 5'-G0h 3 3'-CpTpTpApAoňi -45 i-„—■ ■■ ■--y Polynucleotide-kinase 3'-CpTpTpApAp*5. 5-Qoh 3' S 1-Nuclease ,- 5'-Goh 3' 3'-CpTpTpApAp *----• '- 3-CPy 5'-G0H - - -> Klenow-polymerase ,—-—-- 5'-GpApApTpT0H y 3'-CpTpTpApAps, dATP. dTTP 3-CpTpTpApAp 5. 5'-GpApApTpT0H 3' \-Exonuclease —v. 5'-GpApApTpT0H 3' 3-cp5. ^ 3'-CpTpTpApAp 5. ,-_^ S-GpApApTpToH^' 3'-CpTpTpApAps. Exonuclease III ■-^ 5'"goh3 *Np5' 3'-CpTpTpApAp5, 5'-GpApApTpToH 3' Bal 31 5,pApA0H3'. Oligo-and 3'-CpTpTpApAps. ■- y mono-TpTp5- nucleotide