Adobe Systems
1
Petra Vašíčková
pvasickova@sci.muni.cz
Metody detekce virů v potravinách
a prostředí
http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 090620098687

Adobe Systems http://www.aafp.org/afp/2012/1201/afp20121201p1027-f2.gif
(Cristina and Costa-Mattioli, 2007)
Metody detekce
•Průkaz protilátek (IgM, IgG) – komerčně dostupné soupravy
•Přímý průkaz viru (RT-PCR, RT-qPCR)
ØStolice, sérum
ØKladen důraz na včasný odběr vzorku, řádné skladování/transport
ØRT-qPCR možno použít ke stanovení virové nálože ve vzorku
ØRT-PCR - analýza sekvencí
(nástroj molekulární epidemiologie)
Ø

Adobe Systems
Metody detekce – přímý průkaz viru
•Infekce prasat či jiných experimentálních zvířat (opice, prase domácí, myš, tarbík, králík,
potkan, kosman)
•Klinické příznaky – opice, vysoká infekční dávka
•Bez klinických příznaků – vylučování viru trusem, viremie a/nebo serokonverze
•
•
(Dalton et al., 2008)

Adobe Systems
Metody detekce – přímý průkaz viru
•Buněčné kultury – buněčné linie lidského karcinomu jater (PLC/PRF/5, HepG2/C3A), karcinomu plic
(A549)
• Ve většině případů bez cytopatického efektu  - RT-qPCR, immunofluorescence
•2D × 3D formát
•
•Není standardizováno
•
•

Adobe Systems
•Problémové kultivace virů na tkáňových kulturách → metody založeny na přímém průkazu genomu viru
•V potravinách či prostředí malé množství virových částic →  potřeba dostatečně citlivé metody
•RT-qPCR
•
•ISO/TS 15216
•
•
Metody průkazu virů v potravinách a prostředí
LC480

Adobe Systems
•„Komplikovaný“ proces analýzy vzorku → zavedení externí kontroly celé analýzy
ØBakteriofág MS2 - do genomu vložena unikátní sekvence (vakovlk tasmánský a pták moa)
ØKontrola celého postupu analýzy každého vzorku (přidáno definované množství)
ØStanovení účinnosti izolace NK – kvantifikace virové nálože v definovaném množství vzorku
•
•
•
•
Metody průkazu virů v potravinách a prostředí
Foto H. Malenovská

Adobe Systems
Homogenizace
Centrifugace
8 000 x g
20 min
4°C
Bakterie, parazité
Detekce DNA (qPCR)
Kultivace
Viry
Detekce RNA (RT-qPCR)
Peleta
Supernantant
(Stomacher/vytřepávání v TGBE)
Postup zpracování vzorků v laboratoři
LC480

Adobe Systems
Vyšetření vzorků
Izolace RNA
LC480
TqRT-PCR
-
+
Nested RT-PCR
Sekvenování
Analýza sekvencí
Genotypizace
Epidemiologické × epizootologické studie

Adobe Systems
Voda
Filtrace/primární zakoncentrování
Eluce virových částic
Sekundární zakoncentrování
Izolace nukleových kyselin
Detekce genomu viru
Detekce infekčních virových částic
?

Adobe Systems
Odběr vzorku
•Čistý kanystr/nádoba
•Objem vzorku 10 l, možnost i menší objemy (200 ml)
•Vzorek skladovat v temnu a chladu
•Transport do laboratoře (chlazené) nejlépe do 24 hod od odběru
•
Figure 4
(Cashdollar and Wymer, 2013)

Adobe Systems
Izolace virových částic z vody
•Adsorpce na negativně nabité filtry (Millipore)
Ø10 l
ØLimit detekce 100 000 virových částic (10 000/l)
•
•Přímá flokulace
Ø200 ml
ØLimit detekce 10 000 virových částic (50 000/l)

Adobe Systems
Průkaz viru ve vzorku
•Molekulární metody - qPCR, RT-qPCR
ØKvantifikace – DNA/RNA koncentrační gradient
ØProblém s falešně negativními výsledky – inhibiční faktory (interní amplifikační kontrola, analýza
ředěné NK)
•
•RT-PCR (molekulární epidemiologie/epizootologie)
•
•Problém rozlišit infekční × neinfekční virové částice
•
•
•
AdV_FAM-F2