Adobe Systems 1 Petra Vašíčková pvasickova@sci.muni.cz Odpadní vody http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 090620098687 Adobe Systems Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) SARS-CoV-2 •Vylučování stolicí až u 50 % infikovaných Øneprokázán přenos fekálně-orální cestou (infekčnost viru ve stolici?) Øneprokázán přenos kontaminovanou vodou – předpoklad inaktivace viru během procesů čištění odpadních vod Ø •Průkaz RNA SARS-CoV-2 v moči (30 %) Ø https://heis.vuv.cz/data/webmap/datovesady/projekty/ covmon/ docvystupy/Vsouhrn_COVMON-VI04000017_2022_final.pdf Ø • H1N1 virus (https://en.wikipedia.org/wiki/History_of_coronavirus) http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 2 Adobe Systems 3 •Primární zaměření projektu Øposoudit současnou epidemiologickou situaci – SARS-CoV-2 Østanovit míru výskytu SARS-CoV-2 v odpadních vodách v ČR Øposoudit míru rizika přenosu SARS-CoV-2 ve spojení s odpadní vodou •Analyzované vzorky Ø7 ČOV, 2 × 28 vzorků (interval 3 týdny) Øvoda na přítoku, během čistírenského procesu a na odtoku z ČOV Øanonymní vzorky Øadaptace akreditované metody (Mlejnkova et al., 2020) • http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) Projekt SOVAK (14.4. – 6.5.2020) Sdružení oboru vodovodů a kanalizací ČR Vilém Žák Adobe Systems Výsledky projektu SOVAK – RNA SARS-CoV-2 -negativní, + pozitivní výsledek; Vašíčková a kol., 2020 - 4 http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/ VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022, MV0/VI) 5 Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/ VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022, MV0/VI) 6 Vašíčková, Hrdý, Krásna, Sovová, Gharwalová, Mlejnková. Metodický postup analýzy odpadních vod na přítomnost specifických oblastí genomu SARS-CoV-2. Metodický postup 141, 2022. https://www.vri.cz/vyzkum/databaze-aplikovanych-vysledku/ Adobe Systems 7 Metodický postup •Výběr vhodné metody •Řádný odběr vzorku •Transport vzorku do laboratoře × stabilita vzorku •Systém kontrol celého postupu Økontrola odběru vzorku a podmínek transportu do laboratoře (preanalytická fáze) Økontrola zpracování vzorku v laboratoři (analytická fáze) Økontrola detekčního a kvantifikačního kroku (analytická fáze) •Charakteristika metodického postupu a mezilaboratorní porovnání •Řádná interpretace výsledků ØStatistická analýza dat ØFaktory ovlivňující výsledky http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg https://www.cdc.gov/nwss/testing.html 7 Odběr 18 (malé čov) x 24 (velké čov) hod, vzorek na nátoku na ČOV Chlazený v temnu PEG ihned po nátoku Adobe Systems 8 Metodický postup •Výběr vhodné metody Øvzorky odpadních vod uměle kontaminovány definovaným množstvím vybraných virových agens (5 × 106 GE), výpočet účinnosti Ødůraz – uživatelsky jednoduchá metoda, dostupné vybavení/reagencie, cena, rychlost http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 8 Agens Organická flokulace, BE Precipitace, PEG/NaCl Anorganická flokulace, Al Centrifugace 10 000×g/30 min Virus přenosné gastroenteritidy prasat (TGEV) 42,64 % 43,94 % 17,55 % 17,55 % Defektní bakteriofág MS2 (aRNA) 5,81 % 26,94 % 0,83 % 5,41 % Bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1) 11,40 % 41,11 % 0,56 % 15,85 % Adobe Systems Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) SARS-CoV-2 •Vylučování stolicí až u 50 % infikovaných Øneprokázán přenos fekálně-orální cestou (infekčnost viru ve stolici?) Øneprokázán přenos kontaminovanou vodou – předpoklad inaktivace viru během procesů čištění odpadních vod Ø •Průkaz RNA SARS-CoV-2 v moči (30 %) Ø https://heis.vuv.cz/data/webmap/datovesady/projekty/ covmon/ docvystupy/Vsouhrn_COVMON-VI04000017_2022_final.pdf Ø • H1N1 virus (https://en.wikipedia.org/wiki/History_of_coronavirus) http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 9 Adobe Systems 10 •Primární zaměření projektu Øposoudit současnou epidemiologickou situaci – SARS-CoV-2 Østanovit míru výskytu SARS-CoV-2 v odpadních vodách v ČR Øposoudit míru rizika přenosu SARS-CoV-2 ve spojení s odpadní vodou •Analyzované vzorky Ø7 ČOV, 2 × 28 vzorků (interval 3 týdny) Øvoda na přítoku, během čistírenského procesu a na odtoku z ČOV Øanonymní vzorky Øadaptace akreditované metody (Mlejnkova et al., 2020) • http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) Projekt SOVAK (14.4. – 6.5.2020) Sdružení oboru vodovodů a kanalizací ČR Vilém Žák Adobe Systems Výsledky projektu SOVAK – RNA SARS-CoV-2 -negativní, + pozitivní výsledek; Vašíčková a kol., 2020 - 11 http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/ VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022, MV0/VI) 12 Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/ VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022, MV0/VI) 13 Vašíčková, Hrdý, Krásna, Sovová, Gharwalová, Mlejnková. Metodický postup analýzy odpadních vod na přítomnost specifických oblastí genomu SARS-CoV-2. Metodický postup 141, 2022. https://www.vri.cz/vyzkum/databaze-aplikovanych-vysledku/ Adobe Systems 14 Metodický postup •Výběr vhodné metody •Řádný odběr vzorku •Transport vzorku do laboratoře × stabilita vzorku •Systém kontrol celého postupu Økontrola odběru vzorku a podmínek transportu do laboratoře (preanalytická fáze) Økontrola zpracování vzorku v laboratoři (analytická fáze) Økontrola detekčního a kvantifikačního kroku (analytická fáze) •Charakteristika metodického postupu a mezilaboratorní porovnání •Řádná interpretace výsledků ØStatistická analýza dat ØFaktory ovlivňující výsledky http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg https://www.cdc.gov/nwss/testing.html 14 Odběr 18 (malé čov) x 24 (velké čov) hod, vzorek na nátoku na ČOV Chlazený v temnu PEG ihned po nátoku Adobe Systems 15 Metodický postup •Výběr vhodné metody Øvzorky odpadních vod uměle kontaminovány definovaným množstvím vybraných virových agens (5 × 106 GE), výpočet účinnosti Ødůraz – uživatelsky jednoduchá metoda, dostupné vybavení/reagencie, cena, rychlost http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 15 Agens Organická flokulace, BE Precipitace, PEG/NaCl Anorganická flokulace, Al Centrifugace 10 000×g/30 min Virus přenosné gastroenteritidy prasat (TGEV) 42,64 % 43,94 % 17,55 % 17,55 % Defektní bakteriofág MS2 (aRNA) 5,81 % 26,94 % 0,83 % 5,41 % Bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1) 11,40 % 41,11 % 0,56 % 15,85 % Adobe Systems 16 Metodický postup •Systém kontrol celého postupu Økontrola odběru a transportu vzorku do laboratoře Øhumánní adenoviry (indikátory fekálního znečištění) - qPCR Ø Økontrola zpracování vzorku v laboratoři (účinnost izolace) Øumělá kontaminace každého vzorku TGEV (5 × 106 GE) – RT-qPCR Ø Økontrola detekčního a kvantifikačního kroku - RT-qPCR Øinterní amplifikační kontrola Øpozitivní kontrola - RNA gradient (in vitro transkript) Økvantifikace http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg https://www.cdc.gov/nwss/testing.html 16 SARS-CoV-2 (GE/500 ml) = ((x / 5) × y) × 14,29 × (100 / účinnost izolace TGEV) Adobe Systems 17 Metodický postup •Charakteristika metodického postupu ØCitlivost/limit detekce (LOD), opakovatelnost a účinnost http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 17 Ředění Teoretické množství kopiía Získané množství kopií b Počet pozitivních vzorků /celkový počet analyzovaných vzorků Účinnost (%) Průměr SDc 1 5 000 000 3 555 500 2 029,66 12/12 59,43 2 500 000 307 403 2 544,28 12/12 42,64 3 50 000 29 715 304,42 12/12 35,41 4 5 000 974 21,29 12/12 19,48 5 2 500 914 62,38 12/12 36,56 6 1 250 80 47,07 12/12 6,40 7 500 - - 4/12 - a Množství kopií viru, které bylo stanoveno použitím RT-qPCR. b Skutečné množství kopií bylo získáno podle příslušné kalibrační křivky zařazené v každém experimentu, následně byl spočítán průměr a směrodatná odchylka. c Směrodatná odchylka. ØLOD - 1 250 GE/500 ml, tzn. 2,5 GE/1 ml odpadní vody ØSpecifita - Alphacoronavirus 1 (CAPM V-346, TGEV), Canine coronavirus (CAPM V-485), Avian coronavirus (CAPM V-440), Betacoronavirus 1 (Bovine coronavirus CAPM V 326), Porcine hemaglutinating Encephalomyelitis virus (CAPM V-316), Human adenovirus 2 (CAPM V-665), Human respiratory syncytial virus (NCPV, Catalogue No. 0012031v), Human rhinovirus (NCPV, Catalogue No 930), Influenza A (NCPV, Catalogue No 878), Influenza B (NCPV, Catalogue No 797). Adobe Systems 18 Metodický postup •Mezilaboratorní porovnání Øpořadatel - Laboratoř hygieny půdy a odpadů, SZÚ Øúčastníci - laboratoř Virologie potravin a prostředí a Zkušební laboratoře Ústavu biochemie a mikrobiologie (VŠCHT) Øvyhovující z-skóre: |z| ≤ 2 • http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg https://www.cdc.gov/nwss/testing.html 18 Adobe Systems 19 Metodický postup •Řádná interpretace výsledků Østatistická analýza Øepidemiologická data Øfaktory ovlivňující výsledky – srážky, chemické parametry, množství odpadních vod (faktor ředění srážky), podíl průmyslových odpadních vod, délka kanalizační sítě, počet obyvatel napojených na ČOV, varianta viru, roční období, četnost vzorkování, počet „napojených“ obyvatel atd. http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 19 Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 20 Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) 20 Predikce vzniku a vývoje epidemie Nástroj molekulární epidemiologie ØRNA SARS-CoV-2 v odpadních vodách je možné detekovat dříve, než je prokázána klinickými testy Øk dosažení pozitivní detekce RNA SARS-CoV-2 v odpadních vodách – min. 4-17 (medián 8), 9-43 (medián 18) a 17-97 (medián 38) denně hlášených nových případů covid-19/100 000 obv. pro hladiny pravděpodobnosti 50 %, 80 % a 99 % Østanovení/sledování variant agens v populaci Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Genom Čeleď Zástupci Klinické příznaky ds DNA Adenoviridae adenovirus sérotyp 40/41 zvracení, průjem (zejména děti) Polyomaviridae JC polyomavirus neurologické příznaky ds RNA Reoviridae rotavirus (genoskupina A) zvracení, průjem (zejména děti) +ss RNA Astroviridae lidský astrovirus sérotyp 1 zvracení, průjem (zejména děti) Caliciviridae norovirus GI a GII zvracení, průjem Hepeviridae virus hepatitidy E hepatitida Picornaviridae virus hepatitidy A, poliovirus, enterovirus A 71, aichivirus hepatitida, neurologické příznaky, obrna, myokarditidy, průjem 21 Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE) 21 Agens Lokalita 1 (vstup/výstup) Lokalita 2 (vstup/výstup) Lokalita 3 (vstup/výstup) Lokalita 4 (vstup/výstup) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 AdV -/- +/- -/- -/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ NoV GI -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/- NoV GII -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/- -/+ -/+ +/+ -/- -/- -/- -/- HAV -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- HEV -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- ČOV (odběr vzorků – vstup/výstup, 4×, 2019) Spolupráce DEKONTA a.s. 22 Adobe Systems Výsledky projektu SOVAK 23 - negativní + pozitivní výsledek NoV - noroviry HAV - virus hepatitidy A HEV- virus hepatitidy E AdV - adenovivy, indikátory fekálního znečištění http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Adobe Systems Výsledky projektu BV http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 24 Adobe Systems Projekt MZe QK1810212 Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Povrchová voda ČR (odběr jaro/podzim, 2018-2019) Lokalita AdV NoV GI NoV GII HAV HEV 2018 2019 2018 2019 2018 2019 2018 2019 2018 2019 I +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- II +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- III +/+ +/+ -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/- IV +/- +/+ -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- V +/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- VI +/+ -/+ -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/- VII +/+ +/- -/+ -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- VIII -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- IX +/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- X +/+ +/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- XI +/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- XII -/- -/- -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/- XIII -/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- XIV -/- -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- XV +/+ +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Projekt MZe QK1810212, ZÚČM 26 26 Adobe Systems 27 27 Adobe Systems Matrice Teplota Doba „přežití“ Virus Hlávkový salát, jahody, šunka 4 , 10 a 21°C > 7 dní NoV Voda, mléko 63 a 72 °C 10 min NoV, HAV Borůvky, maliny, jahody, bazalka, petržel - 20°C 90 dní NoV, HAV Zelí, hlávkový salát 4, 25 a 37°C 21 dní NoV, HAV Podzemní voda 10°C 2 roky NoV Povrchová voda 4/22 °C > 42 dní/42 dní NoV Odolnost virů souvisejících s alimentárním onemocněním •Odolnost vůči vlivům vnějšího prostředí (chlad, acidorezistence, běžné desinfekční postupy) → persistence dny, měsíce, roky • • http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 28 Adobe Systems Odolnost virů souvisejících s alimentárním onemocněním •Odolnost vůči vlivům vnějšího prostředí (chlad, acidorezistence, běžné desinfekční postupy) → persistence dny, měsíce, roky • • http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg 29 Adobe Systems Povrchová voda ČR (zelenina) Farmy NoV HAV Zelenina 1/318 0/318 Voda 1/12 0/12 Prostředí (stěry) 0/58 0/58 Bylinky 4/115 0/115 Voda 5/14 0/14 Prostředí (stěry) 2/80 (ruce sběračů) 0/80 Projekt MZe QJ1210113 spolupráce ZÚČM 30 30 Adobe Systems http://www.slowfood.cz/wp-content/uploads/2011/06/jahudky.jpg Povrchová voda ČR (drobné ovoce) Farmy NoV HAV Jahody 2/156 0/156 Voda 3/23 0/23 Prostředí (stěry) 3/218 (ruce sběračů, toalety) 0/218 Tržní síť Jahody CZ 0/45 0/45 Jahody dovoz 1/24 0/24 Ovoce mrazené 0/72 0/72 Ostatní (maliny, borůvky, ostružiny) 1/83 0/83 Projekt MZe QJ1210113, spolupráce ZÚČM 31 Adobe Systems Molekulární epidemiologie 32 •Snaha o dosledování vehikula/zdroje kontaminace •Potvrzení/vyvrácení epidemiologických souvislostí •Porovnání sekvencí genomu virových agens prokázaných u lidí × prostředí × potravin Ø http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Adobe Systems http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg Noroviry - pitná voda, epidemiologické souvislosti 33 • • • 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 NoV GI 5 / 10 2 / 14 6 / 32 6/40 3/26 2/23 2/44 NoV GII 5/10 1/ 14 9 / 32 5/40 0/26 1/23 1/44 Spolupráce KHS, podpora grantu MZ 17-31921A 33 Adobe Systems 34 NoV II Noroviry - pitná voda, epidemiologické souvislosti 34 NoV I norovirus - you don't want it | Norovirus is the most common… | Flickr Adobe Systems Virus hepatitidy A – epidemiologické souvislosti 35 •Epidemie VHA (Moravskoslezský kraj) Øvoda výstup z domácí ČOV – HAV + Øpitná voda (blízká studna) – HAV + Øsekvenčně shoda s kmenem prokázaným u uživatelů studny Øpřenos pitnou vodou podpořen epidemiologickými daty Spolupráce KHS, podpora grantu MZ 17-31921A •Epidemie VHA (Liberecký kraj) Øvoda vstup, výstup z komunální ČOV – HAV + Øčistírenské kaly– HAV + Øsekvenčně shoda s kmenem prokázaným u tamních VHA pacientů 35 http://jeromekahn123.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderpictures/h5n1-virus.jpg