CENTRIFUGACE CENTRIFUGACE Důvodem použití centrifug je nutnost urychlit sedimentaci pevných částic či molekul v kapalném prostředí. um SCI CENTRIFUGACE Na sedimentaci má vliv 1. vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. vlastnost prostředí (rozpouštědla): hustota, viskozita LITERATURA o logica I Cent rif ugat ion J. ůríliírn UNI SCI Preparatíve Centrifuga tíon A Praclíial Appinach CENTRIFUGACE 20. léta 20. století - Svedberg - počátky laboratorních centrifug a analytické centrifugace; teoretické základy metody 50. léta - Brakke - centrifugace v gradientu hustoty THEODOR SVEDBERG (1884-1971) UPPSALA UNIVERSITET f Nobelova cena za chemii 1926 pojmenována po něm Svedbergova jednotka pro vyjádření sedimentačního koeficientu CENTRIFUGACE - POUŽITÍ ANALYTICKÉ U NI SCI Stanovení základních parametrů - MW, hustota, imentační koeficient ROZDĚLENÍ CENTRIFUG !!!! OTÁČKY-> g !!!! U U I SCI rad - úhlová rychlost (rad/s) co - 2tt. f i - otáčky/min OTACKY G 10,000 —— 6.000 —= 4.000 — 3,000 — 2,000 —= 1,000 boo 200 —— 30.000 H— 20.000 == 10.000 — 5,000 ^— 2.000 = 1.000 Nomogram is based on formula below, where: RCF = relative centrifugal force (g) RPM = centrifuge speed in revolutions per minute Radius= distance in mm from center of centrifuge spindle »0 bottom of Am icon device when in rotor RCF U.I18 x 10) (Radius in mm) - RPM —200 —100 =^5° s 20 =—10 ■500 ■475 ■4 50 -425 400 ■375 350 ■325 ■300 ■275 ■250 225 -200 ■ 1 75 -150 -140 ■ 1 30 120 ■ no - IOO ■90 SO ■70 • 60 50 RPM RCF Radius of Rotation (mm) PREPARATIVNÍ CENTRIFUGACE TYP entrifua DIFERENCIÁLNÍ - dvě fáze (sed i m e n t/s u pe r n ata n t) ZONÁLNÍ - tvorba zón v hustotním gradientu METODY NANÁŠENI VZORKU frontální orek v celé kvvet zonální zorek - úzká zón PREPARATIVNÍ CENTRIFUGA O 0 Control pane! O [ | O Sliding dooř Closed chamber Rotor Motor Cooling Vaccum pump PREPARATIVNÍ CENTRIFUGA PREPARATIVNÍ ULTRACENTRIFUGA ROTORY ■ Úhlový - diferenciální centrifugace ■ Výkyvné-zonální centrifugace ■ Zonální - bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru ÚHLOVÝ ROTOR diferenciální I zonální dvě fáze I zóny /r»/~k/^l ir*-i r\ k"»+ H In r<-» /■>! i r\ k"»\ DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE (sediment supernatant) opakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí otáček = gravitací Centrifugace • o OO 0;o »•0 lOOOg/10 min O O' o O o Dekantace supernatantu Centrifuaace VÝKYVNÝ ROTOR diferenciální dvě fáze (sediment pernatan 2 GRADIENTOVA CENTRIFUGACE Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální * ■ i A* ■ • i •A GRADIENTOVA CENTRIFUGACE Hustotní bariéra Diskontinuální Kontinuální flUÍJI SCI 000)00 • • • • • oocooo oooooo gradientova centrifugace média Kriteria pro výběr centrifugačního media: ■ musí v roztoku tvořit gradient ■ nesmí interferovat se vzorkem ■ musí být lehce odstranitelné ze vzorku MUNI SCI GRADIENTOVA CENTRIFUGACE MÉDIA Sacharosa Glycerol Ficoll - dextran Percoll - SiO, Hypertonické prostředí }- Nutno připravit gradient CsCI CsoSCX,' ■ } Gradient vzniká během centrifugac gradientova centrifugace príprava gradientu Minimum density solution Mixing chamber Centrifuge tube GRADIENTOVA CENTRIFUGACE GRADIENTOVA CENTRIFUGACE Sample g force Rate-zonal centrif ugation Hustota neznámá Time Time III g force Isopycnic centrif ugation Hustota známá i me Time GRADIENTOVA CENTRIFUGACE DIFERENCIÁLNÍ VERSUS GRADIENTOVA CENTRIFUGACE 10 ni" IFillered homogcnatc -Mitoiitondrifl, chlo rop lasts, and pEírulEisomfis p LPla™ L Ribosomal membrane, suhunils, microsomal small fraction polyriho-(fragmfinlsnf somes endoplasmic reticulum], and large olvriboHjmBs Soluble iwrlkHi of cytoplasml (cytosoll l Organella J fraction Lysosomes Mitochondria — [LIS g/cm*} Peroxisomes / {1.23 g/cm3] \ Before ccntrifugation After ccntrifugationl ZONÁLNÍ ROTOR ZONÁLNÍ ROTOR 332676 Push-Pull Capping Mechanism 011519 O-ring Inside Cap (Not Visible) 012780 O-ring (Visible) ROTOR LID 332682 Cone 815472 O-ring 33269L Seal Fitting 011167 O-ring for Fitting (Mot Visible) 333856 Rotor Core 858506 0 ring 328948 Non-Extrusion Ring 328945 Rotor Gasket ROTOR BOWL CENTRIFUGACE SE ZONÁLNÍM ROTOREM Tvorba gradientu Nanášení vzorku Centrifugace CENTRIFUGACE SE ZONÁLNÍM ROTOREM CENTRIFUGACE ROTOREM SE ZONÁLNÍM Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru 27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pu.fr pH 7,0 Cushion - 50 ml 42% sach. Overlay - 100 ml pufru Plnění - 2 000 ot/min Dělení - 40 000 ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml 1M 3 M ?OŮ ! *A I q 10 ÍŮ IO Ml bD EO 7Q Bílkoviny + RNA DNA 2.5S 26-35S agregáty DNA ULTRACENTRIFUGACE 800 km/s2) Chem. Listy 104, 1155-1162(2010) Referát ANALYTICKÁ ULTRAC E>"TRIF1TG-A A JEJÍ VYUŽITÍ V BIOCHEMICKÉ LABOR.ÍTOKI ONDŘEJ VANĚK^b a KAREL BEZOUŠKA'* " Kiatedrvt biochemie Přírodovědecké fakultx Univerzity Korinty v Praze, Hlavová S. 12S 40 Praha 2, ŕ Mikrobiologický ústav AVČR, \.v.i\, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 kanaví^seznam.cz, bezoitska<íi'hio»ted. cos. cz Došlo 15 7 10, přijato 26. B. 10. Klíčová slova.: analytická ultracentirifuga. sedňnentačni rychlost sedíme oráč ca rovnováha., molekulová hmotnost, rovnovážná konstanta Obsab 1. Úvod 2. Historie analytické iútencen1iiru.ey 3. Přistroj a jeho parametry 4. Přehled aplikaci 5. Sedimentační rychlost o. Seánnentačni rovnováha 7. Analýza semmentacnicb dat S. Příklady analýz 9. Závěr L. tvDíl Cilem sedinientačm analýzy prováděné pomoci analytické tracen 3 Lfvgv ie cliarakterizace iedinaentuiicicti částic z hlediska jej ach molekulové hmotnosti., sedirnentač-ruhc- koeficientu a dalších hydmdynaimckých vlastností. Ze sedňnentačuich dat lze zinkat odhad velikosti a tvaru částic, údaje o distribuci jednollivých. typu. sedimentujících částic ve vzorku a v neposlední řade studovat rovnovážné sy st émv, vře tne určeni pří s Lusný ch rovno v ážný c h k o □ -srant. Vztáhneme-li pojem sedimentující částice napríklad na molekulu proteinu- je z výše uvedeného výčtu hlavních aplikací této metody zřejmé, ze v oblasti, výskumu bio-niakromolekul. především proteinů a nukleových kyselin. může mít sedimentační analýza velké uplatnení. Je to navi;- edna z inemnolia metcd. k:erě umožnili určit molekulovou hmotnost přimo. bez nutnosti kalibrace ci interakce s matricí, a to přimo ve vodném prostředí (nejčastěji v puTTu} za fyziologických podmínek. A tak přestože se jedná o metodu jiz bezmála sto Let starou, naeházi stále velká uplatnení nejen ve vede a \yzkumu. ale i ve farmaceutickém pnunyslu. CiLeni tohoto referátu je podat přehled o principech a praktických, aplikacích sedimentační analýzy s důrazem na analýzu bio makromolekul. Tento referát je publikován ve zkrácené verzi, plnou verzi dvojnásobného rozsahu lze stáhnout ze stránek katedry biochemie UK PfF. httpi/^T.v^v.nahn.cum.cz^hemíe^biochem-'' služby. 2. Historie auaLyri-ckě ultra centrifugy Historii analytické inteacentrifugy započal jej i kon-struktér a objevitel metody' sedimentační analýzy Theodor Svecber? ['.££4-19~1 r. 7!.cdák ze švédského Fleräng. okres Gávleborg, se stal v roce 1904 studentem univerzit}.' v Uppsale, která už také zůstala jebo hlavním celoživotnou působištěm V letech 1912—1349 zastával na této univerzitě fimkci profesora fyzik áhn chemie. Svedbergova práce ^e týkala prevážne koloidů a makromolekularnich látek. Spolu s celnými n 1 iipra rovník y -studoval fXrzikálrjí vlastnosti koloidu, zejména.jejich.difúzi, absorpci světla a sedimentaci, což mu umožnilo potvrdit, že termodynamické zákony plynů lze aplikovat také na disperzní systémy. Pro studium sedimentace sestrojil anal>-tickou idiracentiYfiuju. s niž sledoval sedimentaci velkých molekul (proteinů, sacharidů, polymeru) v roztoku a tato pozorováni uvedl do vztahu k molekulové velikosti a tvaru sedimentujicích molekul. Ukázal tak. že molekuly daného čistého proteinu maji všechny stejný tvar a ze s využitím analytické ultra-eentriŕusy lze prokázat přítomnost konta minuj icích Látek. Za práci na disperzních systémech mu byla roku 192<5 udělena Nobelova cena za chemii. 3. Pristroj a jebo paríimetĽy Vzhledem k tomu. že již pres padesát let se vývoji a výrobe analytické idixacentriŕu-ey venuje zeiména firma Beckinan Coulter. výčet technologických možnosti metody je omezen na popis současného typu analytické ultra-centiiíiiey ProteomeLab XL-A/XL-I tohoto výrobce. Z hlediska odstředivé sily lze dosahovat tíhového pole v rozmezí přibližné- 60 až 300 000 * g (min. rychlost 1000 nt nim"1, mas. rychlost 60 000 ot min"1). Molekulové hmotnosti částic, které tak lze pomoci analytické centrifugy studovat, se pohybuji približne v rozsahu 100 Da až 10 GDa. Sedimentaci biomakromolekul lze sledovat pomoci dvou nezávislých optických systémů, absorbanční Q£L-A) i úiterferencrrí optiky CXL-ľJ. Absorbanční optika sestál ze zábleskové xenónové Lampy, monocbroniátoru (200—S00 cm), pohyblivé štěrbin}7 a fbtonásobice. V klasickéni uspořádáni ie vzcrek im-.k-fn do kv.etv je dvěma sektory. Do jednoho je umístěn analyzovaný vzorek, druhý sektor obsahuje konrmlní vzorek, zpravidla pufr, v němž je vzorek rozpuštěn resp. do něhož je převe- lí:-- ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA THEODOR SVEDBERG ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE x Ii Ä Lisrht path mor ^ŕ> & * ---------—O- Detector lens U Itracentrif uge Rotor Armored chamber rr Motor UV Light source Rotor Balance Cell .Mr- Motor Cooling Boli i i d el ry Sol u tion Sample OelI Vacuu m pump Schleirin Optics (schematic) Sample Cell goes here Gen.triiYiga.1 for cc ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA Instrumentace ProteomeLab XL-I Optima AUC maximálni rycnlost 60 000 rpm temperat jre range 0° to 40° C absorbčnom optika vlnové délky 190 až 800 nm Rayleighova interferenční optika vlnová délka laseru 660 nm ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA OPTICKÝ SYSTÉM • Absorbční optický systém ■ UV-VIS od 200 do 800 nm detekce makromolekul obsahujících silný chromofor Rayleighův interferenční optický systém ■ měří změnv indexu lom analýza makromolekul neobsahujících silný chromofor ^^^^^^^^^ v pufru silně absorbující látky oxidovaný ■ Absorbanční optika 1/iV difrakcii í mříž k a 0 ni ii ///! i a ///! j? /// incident light detektor cela 3* štěrbin £3 xenónová lampa motorek fotonásobič ABS optika -selektivní detekce absorbujících látek Lam bert-Beerův zákon A — czl (linearita jen v určité oblasti) A - abecr bance, c — koncentrace látky [M], e - extjnkční koeficient [M-1™-1], , I— optická dráha [cm] l e mis n i spektrum Xb lampy wavelength [nm] OPTICKÝ SYSTÉM OPTICKÝ SYSTÉM Fluorescenční detekční systém (FDS) solid state laser 438 nm F=1gQec F - irve-nsŕla fluorescence, iD - inlenziLa excitačního paprsku, Q - kvantový výměšek, r — eKtinkini koeficient, c — konoent - vyšší citlivost a selektivita - analýza vysoce afinitních interakcí (Kd v pM oblasti) - analýza značených molekul v komplexních vzorcích (e.g. krevní sérum, buněčný lyzát) OPTICKÝ SYSTÉM Zkřížená optika Interferenční optika ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE METODA SEDIMENTAČN ROVNOVÁHY (D Diffusion Sedimentation ¥ " I " 9 w 9 " 1 ■ w Cell radius METODA SEDIMENTAČNÍ ROVNOVÁHY METODA SEDIMENTAČNÍ ROVNOVÁHY ♦ Termodynamické informace (závisí na Mr) ♦ Experimentálně lze stanovit: • Relativní molekulovou hmotnost - sacharosa Mr (Mr = 360) až po viry (Mr = mnoho milionů) • Stav molekul v roztoku - asociace • Rovnovážné konstanty v roztoku, K -> výpočet volné energie asociačních reakcí METODA SEDIMENTAČN RYCHLOSTI 00 ■a O -o C o r™ M C O I ■ 1 ■ Meniskus der Lösung __Meniskus des Lösemittels SeoimeiTationsf'ont bei fortschreitender Zeit Zellradius m2xMr(l-Vp) □ .SO sed. koeficient, S METODA SEDIMENTAČNÍ RYCHLOSTI ♦ Hydrodynamické parametry (závisí na Mr a tvaru molekuly) ♦ Experimentálně lze stanovit: • Sedimentační koeficient s • Difúzni konstantu D nebo frikční faktor/ • Relativní molekulovou hmotnost Mr • Tvar molekuly v roztoku STIDIUM BIOMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ Self-asociace (oligomerizace proteinů) A + A ^± A2 Hetero-asociace (protein-NK, protein-poly sacharid, průtoin nínlcomolokulúmí lótlto) A+B^AB Co se dá určit? - stechiometrie (reakční schéma) • afinita (síla vazby) - Kd (nebo Ka) Použitelná SV i SE metoda FDS IF Kd [M] ABS r i u i 10-12 I I 1 1 10H I 10* I 10-4 I I 102 I I I STIDIUM BIOMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ HUN r r t Self-asociace - y-conglutin Sedimentační rychlost 40000 rpm, 20 °c, ABS detekce (230 a 280 nm) 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 Reverzíbilní systém dimer-hexamer 3.0 -^2.5-•o 2.0 H O 0.025 mg/ml (230 nm) 005 rngŕml (230 nm) 0 1 mg/ml (230 nm) 0.2 mg/ml (280 nm) 0.4 mg/ml (280 nm) 0.8 mg/ml (280 nm) hexamer |S6 5) dimer (4,9 S) 2 4 6 8 10 12 sedimentation coefficient (S) —i— 14 Určení Ka - analýza pomocí vazebné izotermy [sw) s-ľtodnota he/arnenj 10 10 10 " 10 concentratkin {M} Ka[26) = 4,5-lQ11 M-2 (popuiace dimeru o hexameru stejné při koncentraci 1,49 fíM) Czubinski (2024), Food Hydrocoii