MUNI
SCI
CHROMATOGRAFICKE
METODY II.
aplikační rozsah chromatografie
Metoda	Přibližný rozsah /Wranalytů	Analyzované látky
GC	1-400	plyny, látky těkavé a teplotně stabilní, po derivatizaci i netěkavé, po pyrolýze i makromolekulami
HPLC	3-106	ionty, látky polární i nepolární, nízkomolekulární i polymery
PC, TLC	100 -2000	ionty, látky polární i nepolární
CE {CZE, CEC, MEKC)	3-106	ionty, látky polární i nepolární, nízkomolekulární i polymery
pc a tlc
■ 1944 - Martin, Synge PC aminokyselin (Nobelova cena)
1952 - TLC nahrazuje PC
INSTRUMENTACE PC a TLC
chromatografický papír
■ Nemodifikovaný
■ Modifikovaný - ionexy, acylace
f. Whatman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)
MU IJI
tlc
Vlastní příprava - sypané, nalévané
Komerčně dostupné - Silufol (ČR)
Whatman
U
SCI
I
pc a tlc - mody
■ rozdelovacf
■ adsorpcnf
■ ionexovä
■ hydrofobnf - RP a HIC
■ gelovä permeacnf
MUNI
SCI
nanášení vzorku
■ Pipety
■ Kapiláry
provedení
Vzestupné
Sestupné
Kruhové
U
SCI
I
Dvojrozměrné
vzestupné
sestupné
kruhové (radiální)
kruhové (radiální)
kruhové (radiální)
vyvíjení (v uzavřené nádobě)
vzestupné vyvíjení
sestupné vyvíjení
kruhové (radiální) vyvíjení
DVOJROZMĚRNÉ
dvojrozměrné
(<0
Drop of mixture
Solvent
Some hours later
Tun* paper 90" clockwise and use a different solvent
Same
ll (HITS
later
DVOJROZMERNE
provedení
■ Analytické
■ Preparativní
detekce
Fyzikální
■ UV VIS
■ Fluorescence
Chemická - derivatizacce
■ Specifická
■ Nespecifická
M U N
SCI
Na základě biologické aktivity
analýza kvalitativní
analýza kvantitativní
DENZITOMETRIE
1 světelný zdroj
2 čočka
3 monochromátor
4 zrcadlo
skenování chromatogramu
5 chromatogram
6 fotonásobič
7 zesilovač
8 zapisovač
PREPARACE
■ PC - vystřižení a eluce skvrny
TLC - vyškrábání a eluce skvrny - odsání a eluce
skvrny
U
SCI
I
kolonová chromatografie
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ
■ Nízkotlaká (atmosférický tlak) - LPC
■ Střednětlaká (4 MPa) - FPLC
■ Vysokotlaká (40 MPa) - HPLC
■ Ultravysokotlaká (100 MPa) - UPLC
KAPALINOVA CHROMATOGRAFIE
VYUŽITI
DOBA TRVANÍ
LPC - preparativní hodiny
FPLC - semipreparativní a analytická    desítky minut
HPLC-analytická
minuty
UPLC-analytická
sekundy
flUIJI
SCI
zařízení pro lpc
Gradient mixer
(2)
Recorder
Fraction collector
zařízení pro lpc
zařízení pro lpc
instrumentace pro lpc
■ Pumpa - peristaltická nebo gravitace
■ Gradient - mísič gradientu
■ Dávkování - přímo pumpou na kolonu
■ Kolony - skleněné
■ Detekce - spektrofotometrická 254, 280 nm
■ Vyhodnocování - zapisovač
■ Sběrač frakcí - programovatelný
zařízení pro lpc
t
P   1 '
V
4
mm
4
lpc
INSTRUMENTACE PRO
FPLC A HPLC
zařízení pro fplc a hplc
ZAŘÍZENÍ PRO FPLC
FAST PROTEIN LIQUID CHROMATOGRAPHY
zařízení pro hplc
zařízení pro uplc
UPLC X HPLC
• kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita)
• snížení nákladů = menší spotřeba HPLC rozpouštědel (ekologie)
• zvýšení separační účinnosti
• snížení meze detekce - zvýšení citlivosti
• více kvalitativních informací
uplc x hplc
uplc x hplc
uplc x hplc
	'ff]			HPLC Converted to UPLC™
Ě S
JL
30
J 6
5.?
Original 30 minute HPLC    Converted 5.2 minute UPLC
TM
HPLC VERSUS
UHPLC
příprava mobilní fáze
PŘÍPRAVA MOBILNÍ FÁZE
odplynení mobilní fáze
přechod varem za nízkého tlak
ozvučení ultrazvukem
vakuová filtrace
•in-line membránové od	plynění
	i j
probublávání inertním plynem
PUMPY PRACUJÍCÍ ZA KONSTANTNÍHO TLAKU
tlaková pumpa
flUIJI
SCI
PUMPY PRACUJÍCÍ ZA KONSTANTNÍHO PRŮTOKU
LINEÁRNÍ DÁVKOVAČE
pumpa jednopístová
pumpa dvoupístová
pumpa dvoupístová
pumpa dvoupístová
tlumení pulsů
PISTON
CAMS    MOVEMENT FLOW/PRESSURE PROFILE PROFILES
single pi aton
dual piston
preiiuming luchlng
d&llwrln
jingle piston [optimi^d cam]
aft&r darnph&fing (fl.5 ml dampen
tlumení pulsů
gradient nízkotlaký
gradient vysokotlaký
dávkování - septum
DÁVKOVÁN í DÁVKOVACÍ VENTIL
dávkovací ventil - „load"
dávkovací ventil - „inject"
kolony pro fplc
1. kovový plášť
2. porézní kovová frita
3. stacionárni fáze
4. převlečný ochranný kroužek
5. koncová hlavice
6. vstup pro kapiláru se šroubem
předkolona
KOLONY PRO HPLC A UPLC
kolony pro
nano- a kapilární hplc
ČASTICOVÝ SORBENT
tvar: sférický (bez povrchových v rozměr pro kolony
analytické   1 - 8 p m eoarativní> 10
ad)
povrchové rozrůznění
pory
polymerní částice
monoliticky sorbent
makropóry: ~1500 nm; mezopóry: < 50 nm mikropóry < 2 nm
pórovitost monolitické stacionárni fáze až 85 % oproti časticové s pórovitostí max 60 %
vysoké průtoky za nízkých tlaků;
velká efektivní plocha => rvchlá separace:
vysoké rozlišení a vysoká kapacita
monomer + polymerační činidlo + porogen
ML-SF na bázi sililc
tetramethoxysilan (TMOS)
tetraethoxysilan (TEOS)    +   kyselina octová   +   polyethylenglykol (PEG)
ML-SF na bázi organických materiálů
styren-divinylbenzen (S-DVB) izooktan m et a kry I áty tet ra h y d rof u ra n
vinyl-deriváty (vinylpyrrolidon, vinylacetát) dekanol
nevýhoda: obtížná výroba
rovedení: disk, trubička, plněná kapilára
ľ:
• v*'
perfúzní chromatografie
■Využívá médií - , jejichž částice (10,
20,50 |um) mají velké příčné póry - 600 - 800 nm. Molekuly biopolymerů unášené mobilní fáze se těmito póry lehce dostávají do nitra částic. Příčné póry jsou navíc vzájemně propojeny krátkými "difuzními" póry - 50-150 nm. Vytváří se tak síťová struktura s rozsáhlým vnitřním prostorem pro interakci nosiče s biopolymerem. rf^KffČř***V*ľ \
u
SCI
Diffusive Pore
PERFÚZNÍ CHROMATOGRAFIE -PRINCIP
A. Conventional soft-gel media (diffusion) . 6. Sample penetration into the center of media
B. POROS media (perfusion)
S
Průtokem mobilní fáze vytváří napříč každou částicí média rozdíl tlaku, který indukuje
. Biomakromolekuly ve vzorku e tak dostávají do kontaktu jak s povrchem částic, tak i s vazebnými místy v jejich nitru.
perfúzní chromatografie
K efektu perfúze dochází jen při určité průtokové rychlosti. Moderní HPLC a FPLC systémy mohou zajistit podmínky perfúze pouze u malých analytických POROS kolon (4.6 x 100 mm, objem 1.7 ml, při průtokové rychlosti kolem 10 ml.min-1).
■ Výhody ve srovnání s chromatografií konvenční:
■ Kapacita je vysoká, nezávisí na průtokové rychlosti.
■ Rozlišení je vysoké, nezávisí na průtokové rychlosti.
Rychlost separace je obvykle 10 - 100x větší než u konvenčních lédií, řádově se pohybuje v minutách.
UÍJ
SCI
PERFUZNi CHROMATOGRAFIE -PRINCIP
Time [ min) Time ( min)
Fig. 14. Separation of model proteins on POROS S/M; 75 ^g load of a protein mixture containing chymotrypsin (1), cytochrome c (2), and lysozyme (3); detection at 280 nm: column, 100 x 4.6 mm ].D<; 20 mA^ 2'[N-morpholino]elhanesulfonic acid buffer, pH 6.0; detection at 280 nm+ (a) 1 ml/min, 15-min gradient to 0.5 M NaCl; (b) 5 tnl/min; 3-min gradient to 0.5 M Nad
UPLC stacionární fáze Waters
U PLC stacionární fáze Waters
CHIPOVÁ CHROMATOGRAFIE
struktury vyleptané do křemíkové (Si) destičky
pohyb MF: pumpa, odstředivá síla, elektrostaticky
výhody: rychlost analýzy, velikost, malá spotřeba vzorku (< nl!)
nevýhody: práce s malými objemy (povr. napětí, elektrostatické interakce)
PILLARS (SLOUPKY)
Coupling Chan fie is
IccllMatad \\y/ Monolith Collector
4
Nod J Chords
CHIPOVA CHROMATOGRAFI
AGILENT
Inert Integrated Integrated Integrated Built-in
polyimide Sprayer-tip       Nano LC Enrichment Microfilter
Column Column
Microcolumns        Mini columns MP columns Pilot columns Process columns Industrial columns
2to25ml 20-1500 ml 1-60 L 2-50L 30-2500 L 30 - 2500 L
R&D / Process validation Stale-up Commercial
Segmented columns
Full radial columns
PRŮMYSLOVÉ SYSTÉMY
DETEKTORY
DETEKTORY
	RI	UV-VIS	IR	FLD	ECD	CONDUCT	CORONA	ELSD
typ detektoru	nedestruktivní	nedestruktivní	nedestruktivní	nedestruktivní	destruktivní	nedestruktivní	destruktivní	destruktivní
odezva	univerzální	selektivní	selektivní	selektivní	selektivní	selektivní	selektivní	univerzální
měřená veličina	index lomu	absorbante	absorbance	intenzita fluorescence	elektrický proud	vodivost	elektrický proud	rozptyl světla
typická citlivost (hmotnost/mi)	N	ng		pg	ra		ng	n
lineární rozsah	10«	ID5	30*	103	Kŕ		Kŕ	10*
závislost odezvy na průtoku	ano	ne	ne	ne	ano	ano	ano	ano
teplotní závislost	vysoká (10^ jed. ind. lomu)	nízká	nízká	nízká	vysoká (1,5%)	vysoká (2,0%)	nízká	vysoká
gradientova eluce	ne	ano	ne	ano	ne	ano	ano	ano (částečně)
REFRAKTOMETRICKÝ DETEKTOR
index lomu
šum 10"7
dyn. rozsah 104
citlivost 10"7 g/m
inen be a
refraktometrický detektor
refraktometrický detektor
„LIGHT SCATTERING" DETEKTOR
Heated Drift Tube
Sample Droplets
Laser
Light Source
Column Effluent
Nebulizer Pressure Re lief I
Nitrogen Gas Webulirer
Piiotode lector
Rozptyl
šum 10 8
dyn. rozsah 104
citlivost 109 g/ml
uv - vis detektor detekční cela
Absorbance
šum 10 4 dyn. rozsah 104 citlivost 10-10 g/ml
uv - vis detektor
s fixní vlnovou délkou
UV - VIS DETEKTOR
S PROMĚNLIVOU VLNOVOU
DÉLKOU
reference
diiterium       beam        hoto dj0(íe lamp splitter |—
comparator
grating photo diode
sample cell
amplifier
uv - vis detektor s diodovým polem
fluorescenční detektor
Fluorescenc
citlivost 10"9 g/ml
ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR
KONDUKTOMETRICKÝ DETEKTOR
Vodivost
šum 10 3
dyn, rozsah 106
citlivost 10"8 g/ml
KONDUKTOMETRICKÝ DETEKTOR BEZKONTAKTNÍ
ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR AMPEROMETRICKÝ
ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR COULOMETRICKÝ
OO
■•• •■ .......
/ \
OO
OO
v
\
O Reference electrode Counter electrode
OO
Working electrode
ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR
and impador
Charge B (town off d"d measured by 4 -SenyiW <*frtiarni-lti
HPLC column
^•Ifndl out ÍMg^al n directly
proponwaJ 10
Araryte particles
Ptmtiws rharge i/«ri»fmcti to
by chafged opposing secondly 9a* siwsm
< j ruLni> {jas irriřsiTi by a hflh-v^fcjge
LC-MS
„ELECTROSPRAY"
ionizace
analyzátor
ION TRAP
šum a drift detektoru
>3
—i
Noi
Mez detekce S/N > 3
Mez stanovitelnosti S/N > 10
SCI
lineární rozsah detektoru
derivatizace
■ zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec
■ zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec
■ zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně
MUIJI
SCI
požadavky na deriváty
chemické individuum
stabilní
■ reakce kvantitativní, rychlá, selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (pH, teplota)
■ činidlo musí být dobře separovatelné od svých Toduktů na koloně jiné fyzikálně-chemické vlastnosti
DERIVATIZACE
„pre-column" - před vlastní analýzou
„post-column" - za kolonou po analýze
flUIJI
SCI
DERIVATIZACE
t
r
u r j i
SCI
1 - der i vat i začni pumpa der i vat i začni ho reagentu
2 - postkolonový systém
3 - směšovací komůrka (mixér)
4 - chromatograf icka kolona
5 - směr toku mobilní fáze
6 - der i vat i začni reaktor (smyčka)
7 - směr toku činidla (efluentu) k detektoru
Jednostupňová postkoloná derivatizace
VYHODNOCENÍ
■ Zapisovače
■ Integrátory
■ Integrační software + PC
MU IJI
HISTORIE KVANTIFIKACE
Zjištěni plochy piku u zapisovačů vážením
Zjištěni plochy piku u zapisovačů planimetrem
Zjištěni plochy piku
u zapisovačů výpočtem
1	l-J	—► vážení
-fdt		
ia = základna x výška
PROVEDENÍ
■Analytické ■ Preparativní
ANALÝZA KVALITATIVNÍ
■ Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů
■ „spiking" - přidání standardu do vzoru nárůst výšky píků
U
SCI
I
Specifická detekce - UV-VIS, fluorescence, elektrochemická
ANALÝZA KVANTITATIVNÍ
i
Plocha (výška) piku
METODA EXTERNÍHO STANDARDU
METODA EXTERNÍHO STANDARDU
METODA VNITŘNÍHO STANDARDU
Kvantitace + eliminace chyb při přípravě vzorku
U
SCI
I
Vnitřní (Interní) standard IS
• nesmí být přítomna v původním vzorku
• nesmí reagovat s žádnou složkou vzorku
• musí být dobře oddělena od všech složek v původním vzorku musí se eluovat v blízkosti stanovované složky
METODA VNITŘNÍHO STANDARDU
METODA VNITŘNÍHO STANDARDU
Figure 2: Internal standard calibration plot from data In Tablo 1.
METODA STANDARDNÍHO PŘÍDAVKU
METODA STANDARDNÍHO PŘÍDAVKU
DŮLEŽITÉ KVANTATIVNÍ PARAMETRY
lc analýza