CHROMATOGRAFICKÉ METODY III. APLIKAČNÍ ROZSAH CHROM ATOGRAFIE Metoda Přibližný rozsah Mr analytů Analyzované látky GC 1-400 plyny, látky těkavé a teplotně stabilní, po derivatizaci i netěkavé, po pyrolýze i makromolekulami HPLC 3-106 ionty, látky polární i nepolární, nízkomolekulární i polymery PC, TLC 100-2000 ionty, látky polární i nepolární CE (CZE, CEC, MEKC) 3-106 ionty, látky polární i nepolární, nízkomolekulární i polymery PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE BASIC GAS CHROMATOGRAPHY Second Edition HAROLD M. MtľtAlf? JAMES M. MILLER &WILEY Leonid M. BlLimberg řWILEY-VCH Temperature-Programmed Gas Chromatography j Lai /v /yij PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE ■ Mobilní fáze - plyn ■ Stacionárni fáze pevná fáze, kapalina VÝHODY NEVÝHODY > Nižší viskozita mobilní fáze o Použitelné je pro těkavé látky > Rychlejší difúze o Látky musí být termostabilní SCHÉMA PLYNOVÉHO CHROMATOGRAFU Flow controller N/l Injector port l/M I Recorder Column oven Detector Carrier gas PLYNOVÝ CHROMATOGRAF ZDROJ NOSNÉHO PLYNU ELEKTRICKÉ MĚŘENÍ PRŮTOKU NOSNÉ PLYNY Plyn Výhody Nevýhody N2 levný, bezpečná práce nízká tepelná vodivost H2 vysoká tepelná vodivost explosivní He inertní drahý Ar inertní drahý PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO GC ■ Plyny, kapaliny - přímo ■ Pevné látky - po derivatizaci OBJEMY DÁVKOVANÝCH VZORKŮ Plyny 0,5-5 ml Kapaliny 0,1 -10 jal ľ 1 U ľ JI SCI ZPŮSOBY DÁVKOVANÍ VZORKŮ Přes septum Injector port controller Termální desorpcí Column oven Recorder Detector Carrier gas STŘÍKAČKOU „splitless" „spliť DÁVKOVACÍ STŘÍKAČKA RYCHLOST DÁVKOVÁNÍ ZPŮSOB DÁVKOVÁNÍ MUN AUTOMATICKÉ DÁVKOVAČE VENTILEM VENTIL DÁVKOVÁNÍ TERMÁLNÍ DESORPCÍ TERMOSTATOVÁNÍ TERMOSTATOVÁNÍ KOLONY ■ Náplňové - %" OD - ocel, sklo délka 1m ■ Kapilární - 0,1 - 0,5 mm ID - křemen, ocel, sklo délka -10-100 metrů KOLONY Pock&d 1 ) bead col umn porous layer conventional open (c Porous Layer Open Tubs Wall Coated Open Tube KOLONY U Pocked with porous layer liquid to ated packed capillary coated with porous [oyer NÁPLŇOVÁ KOLONA KAPILÁRNÍ KOLONA KAPILÁRNÍ KOLONA PEVNÉ STACIONÁRNÍ FÁZE Aktivní uhlí, grafitizované uhlí - dělení plynů a lehkých uhlovodíků Silikagel - dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin Molekulová Síta (krystalické hlinitokřemičitany) - dělení plynů a lehčích uhlovodíků Porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery) - dělení nízkomolekulárních uhlovodíků, anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů KAPALNÉ STACIONÁRNÍ FÁZE Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) - polární stacionární fáze, s rostoucí Mr klesá polarita Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty) - polární stacionární fáze Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) - často používané, široký rozsah polarity ELUCE Gradientova - zvyšování teploty - 400 °C ELUCE (a) Id i b! a - b- c - time initial tern] ramp (*C/min) final hold time and temperature DETEKTORY Destruktivní x Nedestruktivní Univerzální x Selektivní MUNI SCI DETEKTORY Tepelně-vodivostní Tepelná vodivost Plamenově-ionizační Ionizace íuhlovodíkv) Dusíko-fosforový N,P - určité formy Elektronového záchytu Elektronegativní struktury Atomově-emisní Emisní záření Plamenově-fotometrický P, S - určité formy Fotoionizační Absorbce UV Chemi luminiscenční Excitace (03, F2) FTIR IČ + Fourierova transformace Hmotnostní Ionizace DETEKTORY Citlivost a pracovní rozsah GC detektorů aed r ecd n d npd (n) npd (i3) FPD (i S) FPD (P) FTIR U S (S IM} MS (Scan) 10-« g 10r9g tcd 10«g TEPLOTNĚ VODIVOSTNÍ DETEKTOR TCD ■ Universální detektor ■ Nedestruktivní detektor ■ Lineární rozsah - 106 MU SCI ■ Princip - změna tepelné vodivosti eluentu v přítomnosti analytu v nosném plynu se zvyšuje tepelná vodivost plynu ■ TEPLOTNĚ VODIVOSTNI DETEKTOR TCD TEPLOTNĚ VODIVOSTNÍ DETEKTOR TCD PLAMENOVĚ IONIZAČNÍ DETEKTOR FID ■ Specifický ■ Destruktivní ■ Lineární rozsah - 107 ■ Princip - ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu nu ni SCI PLAMENOVĚ IONIZAČNÍ DETEKTOR FID PLAMENOVĚ IONIZAČNÍ DETEKTOR FID DETEKTOR ELEKTRONOVÉHO ZÁCHYTU ECD ■ Specifický ■ Nedestruktivní ■ Lineární rozsah - 104 ■ Princip - interakce (3~ částic vzorkem vyvolává pokles proudu MUNT DETEKTOR ELEKTRONOVÉHO ZÁCHYTU ECD DETEKTOR ELEKTRONOVÉHO ZÁCHYTU ECD GC MS PERMEAČNÍ INTERFACE GC MS PŘÍMÉ SPOJENÍ end oF column MS ionization source GC ANALYSA Ethanol v krvi 1. Ethanol-d6 (I.S.) 2. Ethanol _____k ■ i i t i i i i i i 4 ö S TO 12. Mi n Léčiva a drogy ',7 15.16 12 15 1 'f .^l^lIIijÖl 22.23 0 4 10 Q 22 min GC ANALYSA SUPERKRITICKA FLUIDNJ CHROMATOGRAFIE Supercritical Fluid Chromatography with Packed Columns TftlnfJH an! Jppbt atom MUI Klaus Artw Pr^cliiMl Supercritical And ExlrAdFOtt SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ CHROMATOGRAFIE ■ Mobilní fáze ■ Stacionární fáze - superkritická kapalina pevná fáze, kapalina SUPERKRITICKÁ KAPALINA SUPERKRITICKA KAPALINA um SCI Fluid P£, atm <Š co2 31.3 72.9 0.96 3Ó.5 72,5 0.94 132.5 112.5 0.40 n-C5 196.6 33.3 0.51 n-C4 152.0 375 0.50 CCI2F2 111.8 407 1.12 CHF3 25.9 46.9 "den sily ' in g/ml cit 400atm SFC X KOMPROMIS MEZI GC A HPLC GC + vysoká difúze - vysoká teplota + nízká viskozita - těkavé látky HPLC + nízká teplota + kapacita - nízká difúze - rychlost analýz r i u ľ j i SCI SUPERKRITICKA FLUIDNI CHROMATOGRAFIE II UN COT £ 150,000 53 O 8 o £ 100,000 50,000 1.0 capillary GC HPLC 1,1 1.2 U, SGlGctivity Number of plates required to achieve a separation with Rs = 1.5 and k' = 2 VÝHODY Superkritická kapalina se viskozitou blíží fázi plynné, hustotou fázi kapalné Účinnosti srovnatelné s GC Rychlost větší než u LC brá rozpouštěcí schopnost M F u r j i SCI NEVÝHODY Zařízení musí odolávat větším tlakům Vyšší cenová náročnost při srovnání s GC a LC u r j i SCI SUPERKRITICKÄ FLUIDNI CHROMATOGRAFIE pump system flUfJ O O X pressure trän sduie!- solvent prerjöoter oven f \ detector lumn infection valve vent re stricter SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ CHROMATOGRAFIE SFC ANALYSA Bioanalýza (tokoferoly), Lipidomika Dopingová kontrola Analýza potravin Kontrola průmyslových pr Životní prostředí SUPERKRITICKA FLUIDNÍ EXTRAKCE SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE pump SFC fluid II M U I Q P U modifier Fluids / ůtfradion thimble collection — trap \ nestrictor nozzle SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE ■ Používané kapaliny - C02 - levný, - netoxický - nízká kritická teplota ■ Požívané modifikátory - HCI - kyselé prostředí bazické prostředí SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE ■ Výhody - 10-IOOx rychlejší přestup hmoty - přímé ovlivnění extrakční síly měněním hustoty (změnou tlaku nebo teploty) - velká redukce objemů extrahovadel ÍIUÍJl SCI některá SF-extrakční činidla jsou za normálních podmínek plyny (C02) =^> jednoduché odpaření SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE Nevýhody matricové efekty - neg. vliv matric; interakce se vzorkem i extrakční tekutinou - složitá instrumentace - vysoké teploty a tlaky; práce s plyny (restriktor) UÍJl C P T MUNI SCI FFF FIELD FLOW FRACTIONATION FIELD FLOW FRACTIONATION PRINCIP FIELD FLOW FRACTIONATION PRINCIP UNI SCI size (m) KT10 10"° 1 1 1 Á 1 nm KT8 i 10"7 1CT6 10"s 1 1 1 100 nm ^\^m I0^m 10^ i i0nm 100pm GC Capillary electrophoresis SEC/GPC/GFE Thermal FFF 1 Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation H PAGE Centnfugalion Electrical FFF Sedimentation FFF i 1 10° 103 I 106 1 1 1 109 10,ž 101S 1 10,e _molecular weight (Da)_ FIELD FLOW FRACTIONATION PRINCIP POUŽÍVANÁ POLE ■ Sedimetační ■ Termální ■ Hydraulické ■ Elektrické FIELD FLOW FRACTIONATION PRINCIP CHANNEL TOP p fi r ifj o ü hi: flow profile Iprge panicle? I CrQBBlltJW^ LL small particle ■ CHANNEL BOTTOM o _i ii CO o ir i i i FIELD FLOW FRACTIONATION INSTRUMENTACE FIELD FLOW FRACTIONATION INSTRUMENTACE 1000 0 10 20 30 40 50 Volume (mL) PREPARATIVNÍ FFF