STANOVENÍ POTENCIÁLNÍ NITRIFIKACE PŮDNÍCH ORGANISMU 1. Předmět metody Organicky vázaný dusík v půdě je působením mikroorganismů přeměňován na amoniak (amonifikace), který je dále oxidován na dusitany a dusičnany (1. a 2. fáze nitrifikace). Aktivitu nitrifikačních enzymů (1. fáze nitrifikace) můžeme stanovit metodou označovanou jako krátkodobá potenciální nitrifikace (SNA – short-term nitrification assay) nebo PAO (potential ammonium oxidation). Metoda je založená na stanovení produkce dusitanových iontů v půdě obohacené přídavkem amonného substrátu během krátké doby inkubace, kdy nedochází ke změnám ve velikosti mikrobiální populace. Vzorky půdy jsou inkubovány v půdní suspenzi za neustálého třepání při teplotě 25 °C. Suspenze obsahuje saturující množství substrátu (síran amonný) a chlorečnan sodný, který působí jako inhibitor 2. fáze nitrifikace – oxidace dusitanů na dusičnany. Předpokládá se lineální nárůst koncentrace NO[2]^- iontů v čase. V hodinových časových intervalech (do doby 6 hod) se odebírají vzorky suspenze, ve kterých se stanovuje množství dusitanových iontů. Metoda je použitelná pro všechny typy a druhy půd. Půda by měla být odebrána a manipulována ve shodě s ISO 10381-6 (1993). Analýza by měla být provedena co nejdříve po odběru půdy. Před měřením by měla půda být skladována ve 4 °C maximálně 3 měsíce. Metoda je vhodná i jako test toxicity přičemž můžeme testovat jak čisté chemické látky tak kontaminované pevné vzorky (kaly, půdy apod.). V prvém případě se testovaná látka přidává do pracovního roztoku pro inkubaci. V druhém případě je nutno zajistit zdravou a nekontaminovanou půdu s PAO cca 0,2–0,8 µg NO[2]^--N.g[suš]^-1.h^-1, která slouží jako referenční. 2. Zdrojové normy a relevantní SOP Zbíral J., Honsa I., Malý, S., Čižmár, D. (2004): Analýza půd III, Jednotné pracovní postupy, ÚKZUZ – Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Brno. ISBN 80-86548-60-0. str. 152-154. Alef, K. (1995): Nitrogen mineralization in soils. Assay of nitrification (short-term estimation). In Alef, K. and Nannipieri, P. (eds): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press London. p. 241-242. ISO 15685 (2004): Soil quality – Determination of potential nitrification – Rapid test by ammonium oxidation. International Organization for Standardization, Geneve, Switzerland. ISO 10381-6 (1993): Soil quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. International Organization for Standardization, Geneve, Switzerland. SoilECT-SOP-01: Stanovení sušiny a maximální vodní kapacity (WHC) 3. Materiál, pomůcky, chemikálie a přístroje — 150 ml skleněné infuzní lahve; 15 ml plastové zkumavky s víčky — váhy s přesností 0,1 g a analytické váhy s přesností 1 mg — automatické pipety 5, 10 ml a 30-300 µl, špičky, multikanálová mikropipeta 30-300 µl — třepačka, centrifuga, spektrofotometr na mikrodestičky — odměrný válec 100 ml, odměrné baňky 1000 ml, 200 ml a 100 ml, lžička, mikrodestičky — deionizovaná voda (dH[2]O) — 4 M KCl (298,24 g / 1000 ml) — 2 M KCl (149,12 g / 1000 ml) — 0,2 M dihydrogenfosforečnan draselný – KH2PO4[ ](2,72 g / 100 ml) — 0,2 M hydrogenfosforečnan draselný – K2HPO4[ ](3,48 g / 100 ml) — 1M chlorečnan sodný – NaClO4[ ](10,6 g / 100 ml) — síran amonný - (NH[4])[2]SO[4] (řádově gramy) — 0,19 M chlorid amonný – NH4Cl (10 g / 1000 ml) — 6 % roztok hydroxidu amonného – NH4OH pro úpravu pH; získáme naředěním z koupeného roztoku 25% roztoku, např. 12 ml a 38 ml dH[2]O (Lachner, kat. č. 30023) — sulfanilamid (CAS: 63-74-1) (od firmy ROTH Prod. No. 4716.1) — Griess-Ilosvayovo činidlo: N-(1–naftyl)ethylen-diamin dihydrochlorid (CAS: 1465-25-4) (od firmy Fluka Prod. No. 70721) — kyselina fosforečná (H[3]PO[4]) koncentrovaná — zásobní roztok 1000 µg NO[2]^--N / ml: 2,4629 g dusitanu sodného – NaNO2[ ]/ 500 ml 2M KCl — všechny roztoky výše vydrží cca měsíc, pokud jsou uchovávány ve 4 °C Pracovní postup - PAO Příprava a inkubace půdní suspenze V případě použití vysušené půdy či půdy skladované v lednici: do větší nádoby si navážíme množství půdy, které budeme používat do testu a 5 g navíc. Půdu ovlhčíme na 60%, promícháme a zavřeme víčkem s otvorem. Půdu necháme při 22 °C aktivovat 4 – 7 dní. Stanovení NO[2]^- iontů 1. Do infúzních lahví 150 ml navážíme 3 x množství odpovídající 10 g suché půdy. 2. Ke vzorkům půd přidáme 20 ml roztoku B (obsahuje pufry, substrát k oxidaci (NH[4])2SO[4] a chlorečnan amonný k zastavení oxidace NO[2]^- na NO[3]^-), uzavřeme víčkem se skleněnou trubičkou (= aerobní prostředí, přístup vzduchu, po celou doby inkubace), promícháme a dáme třepat na horizontální třepačku při amplitudě 180. 3. V časových intervalech 0 (před začátkem třepání), 3 a 6 hodinu od založení testu odebíráme z každého vzorku 2 ml suspenze pomocí automatické pipety se špičkou s odříznutým koncem a vatou před pipetou (poté co suspenzi rychle promícháme, aby odběr byl velmi reprezentativní). 4. 3 ml suspenze pipetujeme do 15 ml zkumavek a přidáme 3 ml roztoku 4M KCl (extrakce NO[2]^- iontů). Promícháme a hned centrifugujeme 5 min při 4000 rpm (nastavíme 24 °C). 5. Supernantant přefiltrujeme do nové 15 ml zkumavky a stanovujeme na přístroji FIAlab. Dusitanové ionty stanovujeme do půl hodiny od odběru. Výpočet Kalibrační přímku sestrojíme z hodnot absorbance kalibračních roztoků. Z kalibrační rovnice vypočítáme množství dusíku ve formě dusitanových iontů v µg NO[2]^--N / ml. Množství dusitanového dusíku v půdě v jednotkách µg NO[2]^--N / g[suš] se vypočítá podle rovnice: NO[2]^--N (µg / g[suš]) = (µg NO[2]^--N / ml × 2 × V) / 10 µg NO[2]^--N / ml - koncentrace v suspenzi vypočítaná dle kalibrace V - celkový objem (40 ml + objem vody již přítomné v půdě) – toto množství platí pro první odběr, další má již objem pouze 38, další 36 atd. Získáme tak narůstající obsah NO[2]^--N (µg / g[suš]) pro 6 hodin po třech opakováních. Potenciální nitrifikace je vyjádřená jako produkce NO[2]^--N za jednu hodinu vztažená na množství sušiny půdy. Tento výsledek získáme tak, že provedeme lineární regresi závislosti kumulativního obsahu NO[2]^--N (µg / g[suš]) na čase (např. v programu STATISTICA, modul Multiple regression - parametr B je "slope" regresní přímky a současně i PAO v jednotkách µg NO[2]^--N.g[suš]^-1.h^-1. Pokud je "intercept" statisticky nevýznamný, provedeme regresi s nastavením "intercept" roven nule. "Standard error of B" je S.D. pro PAO. Princip metody * PAO = ammonification, first step of nitrification * 3 h oxidation of ammonium sulfate * sodium chlorate added – stops nitrite oxidation to nitrate * nitrite measured by colorimetric test Princip měření: Azo coupling of sulfanilamide acid and N-(1-Naphthyl)ethylenediamine.png Zdroj: Wikipedie (https://en.wikipedia.org/wiki/N-(1-Naphthyl)ethylenediamine)