1 doc. RNDr. Petra Bořilová Linhartová, Ph.D., MBA ENVIRONMENTAL GENOMICS MICROBIOME LABS Environmentální genomika 2025, E6080 petra.linhartova@recetox.muni.cz ̶ Základní biologické, genetické a biochemické předměty + lab ̶ Epidemiologie a veřejné zdraví ̶ Klinická biochemie ̶ Fyziologie a Environmentální fyziologie ̶ Environmentální genomika 2 Bc. Environmentální zdraví NMgr. Environmentální biomedicína ̶ Patologická fyziologie ̶ Cytologie, histologie a embryologie ̶ Immunology ̶ Biomarkers ̶ Metagenomika ̶ Medicínský modul a PP ̶ Aplikovaná toxikologie a farmakologie ̶ Human Health Risk Assesment ̶ Projekt PhD Environmental Health Sciences Průchod studiem a návaznosti ̶ Cílem předmětu je seznámit studenty s vědním oborem environmentální genomika, který se zabývá interakcemi mezi člověkem a prostředím na genomové úrovni, tzv. gen-environment interakce, a s tím souvisejícími interakcemi mezi člověkem a jeho mikrobiotou, epigenomikou, genovou expresí, geneticky podmíněnou náchylností ke komplexním chorobám a PGx (farmakogenetika a farmakogenomika). ̶ Student po absolvování předmětu: - bude rozumět tomu, čím se zabývají obory environmentální genomika, PGx a populační genetika, - bude schopný diskutovat o vlivu expozičních faktorů na lidský genom a mikrobiom, - bude umět vysvětlit, co je to genetická predispozice k onemocnění a jaké jsou metody studia genetické složky u komplexních chorob, - bude seznámen s multiomickými přístupy studia lidského zdraví a nemoci. 3 Cíl a výstupy z učení ̶ 1. a 2. Úvod do environmentální genomiky. ̶ Genetická predispozice ke komplexním chorobám – studie kontrol a případů. ̶ 3. Základy populační genetiky, adopční studie a studie dvojčat. ̶ 4. Genetické asociační studie (GWAS), polygenní skóre a jeho využití. ̶ 5. PGx (farmakogenetika a farmakogenomika) – personalizovaná medicína. ̶ 6. Epigenetika a xenobiotika. ̶ 7. Lidský mikrobiom a farmakomikrobiomika. ̶ 8.Genové inženýrství. ̶ Velikonoce ̶ 9. Onkogenetika. ̶ 10. Epigenetika v onkologii. ̶ 11. Multiomické přístupy ve výzkumu. ̶ Zkouška4 Obsah předmětu 5 Vyučující ̶ 3. Základy populační genetiky, adopční studie a studie dvojčat. ̶ 4. Genetické asociační studie (GWAS), polygenní skóre a jeho využití. ̶ 6. Epigenetika a xenobiotika. ̶ 8.Genové inženýrství. ̶ 9. Onkogenetika. ̶ 10. Epigenetika v onkologii. ̶ Dr. Albert Kšiňan ̶ Dr. Gabriela Škovranová ̶ Dr. Martin Marek ̶ Doc. Sabina Ševčíková ̶ Výuka je realizována formou přednášky s prezentací. ̶ Návštěva přednášek není povinná, ale silně doporučená pro porozumění probíraným tématům. ̶ Závěrečné hodnocení (na konci semestru) bude realizováno formou písemné zkoušky (20 otázek, forma testu) s následnou ústní zkouškou 6 Forma výuky Zkouška z předmětu (a SZZ pro EZ) 7 Literatura Schwartz et al., 2004 8 Životní prostředí a zdraví (nemoc) člověka Genom Mikrobiom Environmentální expozice Interní expozom Epidemiologie Metabolomika Biomarkery Metatranskriptomika Metagenomika Genomika Epigenomika Toxikologie Proteomika Environmentální chemie Environmentální genomika 9 Environmentální genomika Genom Mikrobiom Environmentální expozice Interní expozom Biomarkery Metatranskriptomika Metagenomika Genomika EpigenomikaEtiopatogeneze Molekulární diagnostika Predispozice Terapie Prognóza Schwarz et al., 2004 10 Klasifikace chorob ̶ Základní pojmy ̶ Etiologie ̶ Patogeneze ̶ Nozologická jednotka ̶ Symptom ̶ Syndrom ̶ WHO ̶ Mezinárodní statistická klasifikace nemocí a souvisejících zdravotních problémů (MKN, anglicky ICD) Vrozené choroby (VVV, monogenní choroby) Multifaktoriální choroby (Komplexní choroby) Nemoci způsobené faktory vnějšího prostředí 11 Klasifikace chorob ̶ Význam genetické složky 12 Multifaktoriální choroby ̶ Příklady civilizační chorob Metabolická onemocnění Nemoci z nesprávné výživy Kardiovaskulární choroby Neurodegenerativní choroby Autoimunitní choroby Onkologická onemocnění Onemocnění pohybového aparátu Duševní onemocnění ortorexie CRC bigorexie anorexie bulimie bolesti páteře obezita RA alergieastma ateroskleróza PANC RNC…hypertenze ůnavový sy sy vyhoření AD PD závislostiGIT obtíže T2DM atopická dermatitida Poruchy reprodukce poruchy spánku METABOLICKÝ SY endokrinní poruchy dyslipidémie ̶ multifaktoriální, často polygenní ̶ roli hrají interakce různých vlivů: • genetických, • epigenetických, • behaviorálních, • psychosociálních a • environmentálních podílejících se na výsledném stavu – vzniku, rozvoji a průběhu onemocnění ̶ Charakteristika Komplexní choroby 13 ̶ Charakteristika Komplexní choroby 14 geny další faktory Monogenní Komplexní Nemoci způsobené zevními vlivy ̶ pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci ̶ epidemiologickou charakteristikou komplexních chorob je statistická kumulace v rodinách ̶ fenotyp nevykazuje klasickou mendelistickou dominantní či recesivní dědičnost jako důsledek změn v jediném lokusu (tzv. jednolokusových) ̶ predisponující „geny” zvyšují pravděpodobnost onemocnění, ale nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost • je nutné spolupůsobení negenetických faktorů (prostředí) = dieta, fyzická aktivita, kouření, …. • a interakce genů mezi sebou ̶ stojí na vrcholu pomyslné pyramidy složitosti celé genetiky ̶ Charakteristika Komplexní choroby 15 ̶ dědičný znak nebo postižení, které buďto je nebo není přítomno ⇒ diskrétní (kvalitativní) znak ̶ měřitelné vlastnosti (fyziologické nebo biochemické veličiny – TK, výška, hladina cholesterolu, BMI) ⇒ kvantitativní znaky ̶ pochopení dědičné podstaty variability kvantitativních znaků je základem pro porozumění tomu, jak se geny podílejí na vzniku komplexních nemocí ̶ Charakteristika Komplexní choroby 16 • diabetes • esenciální hypertenze • dyslipidémie • alergie • obezita – hypotéza typu „thrifty genotype“ oselekce alel, které favorizují přírůstek váhy a skladování tuků ̶ Příklady Komplexní choroby 17 ̶ neúplná penetrance patologického fenotypu • u určité části osob, přestože zdědí nevýhodný genotyp (zde ve smyslu souboru vícero genů) se patologický fenotyp nerozvine ̶ imprinting • modifikace maternálních a paternálních genů během gametogeneze tak, že mají odlišnou expresi v zygotě • většinou pouze maternální nebo paternální alela daného genu je exprimována, druhá je utlumena ̶ Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby 18 ̶ spolupůsobením dalších mechanizmů přenosu • mitochondriální dědičnost ̶ existence fenokopií • patologický fenotyp může být přítomen u lidí, kteří nejsou nosiči zmíněného genotypu • navozeno vnějšími faktory - např. kortikoidy indukovaný DM ̶ genetická heterogenita klinický obraz není specifický, ale může se rozvinout v důsledku záměn: • v genech ležících na různých lokusech (= lokusová heterogenita) • v jednotlivých genech může být přitom vícero mutací či polymorfizmů (= alelická heterogenita) ̶ Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby 19 ̶ genetická heterogenita ̶ Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby 20 https://www.researchgate.net/figure/47812495_fig3_Figure-3-Genetic-and- allelic-heterogeneitya-Genetic-heterogeneity-When-alternative ̶ vysokou populační frekvencí alel zodpovědných za rozvoj patologického fenotypu • každá jednotlivá predisponující alela pravděpodobně není sama o sobě výrazně patogenní ̶ polygenní dědičností • predispozice k rozvoji patologického fenotypu se zvyšuje pouze při simultánním výskytu určitého souboru alel - více faktorů - tzv. „malé“ faktory ̶ Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby 21 ̶ jev, kdy jeden gen ovlivní organizmus mnoha způsoby se nazývá pleiotropie ̶ Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby 22 http://www.grossmont.edu/people/bon nie-yoshida-levine/online- lectures/genetics-mendel.aspx ̶ frekvence různých typů dědičných onemocnění ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 23 Typ dědičnosti chorob Incidence při narození (na 1000) Prevalence ve věku 25 let (na 1000) Prevalence v populaci (na 1000) genomové a chromozomové mutace 6 1,8 3,8 monogenní mutace 10 3,6 20 multifaktoriální ~ 50 ~ 50 ~ 600 ̶ 1918 R. A. Fisher - polygenní model ̶ Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby 25 ̶ v polovině 60. let přišel s tzv. prahovým modelem D.S. Falconer (limitní počet recesivních alel způsobí vznik onemocnění) ̶ Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby 26 ̶ prahový model s pohlavně rozdílným prahem ̶ Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby 27 ̶ současný model ̶ se od těch klasických v několika ohledech dost zásadně liší • je jasné, že genotypová složka komplexních znaků není tak rozsáhlá, jak se předpokládalo (nezahrnuje stovky, max. desítky genů) • genotypová složka není homogenní ve smyslu rozsahu účinku jednotlivých genů (zahrnuje geny jak relativně velkého, tak i malého a středního účinku) • vzájemný vztah jednotlivých predisponujících genů není v žádném případě uniformně aditivní  vyjádřeno multiplikativním modelem ̶ Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby 28 ̶ multiplikativní model ̶ souhrnný účinek predisponujících genů je roven součinu jejich dílčích účinků (interakční efekty) ̶ uvažuje existenci dvou a více rizikových lokusů, kdy dispozice k nemoci je zvýšena při současném působení obou či více rizikových genotypů ̶ Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby 29 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC138948/ ̶ Podklady pro hledání genetické determinace • Zvýšený výskyt v rodinách • Zvýšená incidence u dvojčat: MZ > DZ • Dědičnost intermediárních fenotypů oneúplná dominance (heterozygot je intermediárním fenotypem) omezi nejčastěji používané intermediární fenotypy patří profily genové exprese (transkriptom), variabilita v množství proteinů (proteom), metabolitů (metabolom), atd. ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 30 ̶ Familiární výskyt nemocí – Familiární agregace • je charakteristikou komplexních nemocí, protože příbuzní sdílejí větší podíl genů navzájem mezi sebou než s nepříbuznými osobami • obráceně to platit nemusí – FA neznamená, že se na chorobě musí podílet dědičnost ⇒ rodina nesdílí jenom stejné geny, ale i vnější prostředí, kulturní návyky, vzorce chování apod. • nutno posoudit podíl genetických a negenetických faktorů ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 31 ̶ Familiární výskyt nemocí • měří se relativní riziko  (R) – vyjadřuje, kolikrát vyšší pravděpodobnosti onemocnění čelí definovaný příbuzný nemocného jedince ve srovnání s obecným rizikem populace prevalence nemoci u příbuzných „r“ postižené osoby R = -------------------------------------------------------------------------------------- prevalence nemoci v populaci • r – znamená obecně příbuzný („relative“), v praxi se měří např. λs („sibs“), λp („parents“) • čím vyšší je hodnota , tím snazší je genetická analýza daného komplexního znaku ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 32 ̶ Familiární výskyt nemocí • definovaný příbuzný – 1. stupně (dítě, rodič, sourozenec - S) Např. u DM 1. typu - =15 u DM 2. typu - =3,5 u astmatu - =3,5 u cystické fibrózy má  kolem 500 • hlavní příčiny rozptylu hodnot  mezi jednotlivými chorobami nejsou v absolutní velikosti geneticky podmíněného rizika, ale v obecné populační zátěži, která např. u DM 1. typu činí 0,4 %, u 2. typu 6-7 % (ve věku 80 let je kumulativní riziko kolem 17 %) ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 33 ̶ Konkordance a diskordance • mají-li 2 příbuzní jedinci v rodině stejnou nemoc – konkordantní • je-li jeden postižený a druhý ne – diskordantní ⇒ lze vysvětlit vlivem dalších faktorů nutných k nastartování patologického procesu • naopak – konkordantní fenotyp může vzniknout i při rozdílných predisponujících genotypech ⇒ nemoc u jednoho z nich je genokopií nebo fenokopií druhého ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 34 ̶ Konkordance a sdílení alel mezi příbuznými • čím blíže jsou si 2 rodinní příslušníci, tím více alel zděděných od společných předků mají totožných • pokud geny přispívají ke vzniku onemocnění významně, stoupá konkordance pro dané onemocnění s rostoucím stupněm příbuznosti oextrémní případ: MZ dvojčata opříbuzní 1. řádu: rodič + dítě (společná 1 alela s každým z rodičů) opár sourozenců vč. fraternálních (DZ) (25% má stejnou dvojici alel nebo žádnou alelu, 50% má stejnou 1 alelu) 0,25 (2 alely) + 0,5 (1 alela) + 0,25 (0 alel) = 1 alela ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 35 ̶ Pokud tedy geny k nemoci predisponují, lze očekávat, že λr bude nejvyšší pro MZ dvojčata, nižší pro příbuzné 1. stupně a dále klesá úměrně počtu sdílených alel ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 36 ̶ Podíly relativního rizika λr příbuzných probandů s vybraným onemocněním • hodnota λr = 1 znamená, že příbuzný nemá větší pravděpodobnost vzniku nemoci než kterýkoliv jedinec v populaci ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 37 http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/15199/title/The-Infection-Connection-in-Schizophrenia/ ̶ Studie dvojčat • „experiment přírody na lidech“ • základním přístupem je tradičně stanovení stupně fenotypové shody u MZ a DZ dvojčat → minimalizace relativních vlivů zevního prostředí • čím vyšší je fenotypová shoda MZ oproti DZ dvojčatům, tím vyšší je relativní genetický příspěvek studovaného komplexního znaku • výhody: umožňují abstrahovat od variability prostředí ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 38 ̶ Studie dvojčat • omezení: oMZ dvojčata i přes totožný genotyp nemají stejnou genovou expresi (např. náhodná Xinaktivace u žen) ove skupinách lymfocytů se MZ budou lišit díky somatickým chromozomálním přestavbám v lokusech pro Ig a T-buněčný receptor onitroděložní prostředí nemusí být pro obě stejné oexpozice faktorům zevního prostředí nemusí být stejná (zejména u chorob s pozdní manifestací) ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 39 ̶ Porovnání konkordance u MZ a DZ dvojčat • vyšší konkordance u MZ dvojčat oproti DZ dvojčatům je silným argumentem pro přítomnost genetických faktorů (zejména u onemocnění s časným výskytem) ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 40 ̶ Heritabilita (H2) • je definována jako relativní podíl variability podmíněné geneticky na celkové variabilitě znaku H2 = VG/VP • variabilita fenotypu (VP) = genetická variabilita (VG) + variabilita zevních faktorů (VE) • čím je vyšší a blíží se jedné, tím vyšší je obecný příspěvek genetické složky ve fenotypu • nejjednodušší způsob odhadu znaku H2 je  dvojnásobek rozdílu korelačního koeficientu MZ a DZ dvojčat ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 41 ̶ Odhad heritability 1. pomocí rozptylu F1 a F2 generací rozptyl u F1 – rozptyl u F2 H2 = -------------------------------------------------------------- rozptyl F2 ̶ je-li variabilita znaku určena zejména prostředím, je rozptyl u F2 blízký rozptylu u F1 a čitatel, a tím i hodnota H2, se bude blížit 0 ̶ pokud je variabilita dána pouze genetickým složením, rozptyl u F1 je nulový a H2 je rovna 1 ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 42 ̶ Odhad heritability 2. pomocí sledování inbredního kmene pokusných zvířat 3. ze studií dvojčat ̶ dle Holzingerova indexu heritability (H) relativní zastoupení konkordantních párů ve skupině MZ dvojčat – DZ H = --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 – relativní zastoupení konkordantních párů ve skupině DZ dvojčat ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 43 ̶ Heritabilita běžných komplexních nemocí (znaků) ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 44 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí • důležité je definovat studovaný fenotyp komplexní choroby  konglomerát fenotypů nižších úrovní  intermediární fenotypy • vágní stanovení fenotypu  komplikace při porovnávání různých nezávislých studií ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 45 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí • má vždy statistický charakter  zdědění jednotlivé patologické alely není ani nezbytné, ani dostatečné pro manifestaci komplexního fenotypu FENOTYP = ZEVNÍ FAKTORY + GENETICKÉ FAKTORY • dosud se nepodařilo charakterizovat žádnou komplexní polygenní chorobu ve formě úplného souboru „patologických“ alel a jejich interakcí (navzájem a se zevními faktory) ̶ Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby 46 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí – fáze studia: • formulace hypotézy • selekce kandidátních genů os intermediárním fenotypem os klinickou manifestací nemoci os klinickou závažností nemoci os odpovídavostí nemoci na léčbu • studium FA (studie na dvojčatech) • asociační studie (case-control studie) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 47 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí – fáze studia: • tvorba modelu dědičnosti • hledání oblasti, kde se gen nachází (vazebná nerovnováha, haplotypy) • analýza struktury a fce genu • odhad frekvence různých mutací a zhodnotí se rizikovost každé z nich, a to v kombinaci s dalšími faktory, například věk nebo prostředí • určení míry asociace – statisticky významná závislost dvou proměnných. Sílu asociace zjišťujeme pomocí statistického testu, např. t-testu, chí-kvadrát test, analýzou variance nebo mnohočetnými lineárními nebo logistickými regresemi. ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 48 ̶ Metodologie genetického výzkumu komplexních nemocí ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 49 ̶ Genetické studie • strategie výběru tzv. kandidátních genů ojednodušší u mendelisticky děděných nemocí • studie na modelových organizmech • studie na lidech (jednotlivci, rodiny, populace) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 50 ̶ Studie na modelových organizmech • identifikace genetických determinant komplexních onemocnění u experimentálních modelů • vycházíme ze dvou inbredních kmenů (potkana, myši), tedy takových kmenů, kde všichni jedinci (téhož pohlaví) každého z kmenů jsou geneticky identičtí • tyto dva parentální kmeny se liší ve zkoumaném znaku - např. hypertenzní kmen vs. normotenzní kmen • pokud jedince těchto dvou kmenů navzájem křížíme, jejich potomstvo (F1) je heterozygotní v rozsahu celého genomu ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 51 ̶ Studie na modelových organizmech • dále postupujeme přes zpětné křížení (F1 s P) nebo křížíme navzájem dvojice F1 a získáme populaci druhé filiální generace (F2, zpravidla několik set jedinců) • nejčastěji se používá sada několika set tzv. mikrosatelitních markerů, které jsou rovnoměrně rozmístěny po celém genomu • u každého jedince F2 zjistíme, jestli zdědil obě alely daného markeru od jednoho či druhého progenitora (parentálního kmene), příp. jestli má po jedné alele od každého a je tedy pro daný úsek genomu heterozygotní (u zpětného křížení samozřejmě připadá v úvahu jen jeden typ homozygota nebo heterozygotní stav) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 52 ̶ Studie na modelových organizmech • za pomoci specializovaného softwaru zkoumáme, jestli některé alely nejsou výrazně předávány potomkům současně s dispozicí pro vysoké nebo naopak nízké hodnoty sledovaného kvantitativního znaku • nejjednodušší variantou je porovnání hodnot • např. inzulinémie - mezi skupinami rozdělenými podle genotypu postupně v každém markeru ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 53 ̶ Studie na modelových organizmech • "marker regression„ - pokud budou jednotlivé genotypové třídy vykazovat signifikantně rozdílné parametry sledované charakteristiky (např. krevního tlaku), lze předpokládat, že daný marker, případně variace DNA v jeho blízkosti nějakým způsobem ovlivňuje tuto charakteristiku • nevýhody: oFP - náhodně odlišná distribuce markeru kvantitativního znaku (! P-hodnota) otestujeme asociaci jen přímo v místech, ve kterých se nacházejí námi typizované markery, což v experimentu běžných parametrů znamená pomíjení desítek megabází DNA mezi nimi ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 54 ̶ Studie na modelových organizmech • metoda tzv. intervalového neboli QTL (quantitative trait locus) mapování oumožňuje odhadovat genotyp i v úsecích mezi námi genotypizovanými markery opokud se QTL (tedy lokus, který výrazně ovlivňuje variabilitu ve zkoumaném znaku) podaří identifikovat, nastává fáze pozičního klonování, která je v principu velmi podobná strategii popsané u studií lidských ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 55 ̶ Studie na lidech • zhodnocení síly asociace genů s chorobami olinkage (vazebná) analýza – para a neparametrická oasociační studie – retro, prospektivní a TDT studie např. case-control – studium několik SNPs např. celogenomové asociační studie (GWAS = Genome-Wide Association Study) – vyhledávají SNPs nebo běžné genové variace, které se typicky chovají jako ukazatelé genových oblastí s malým efektem u stoupajícího rizika nemocí ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 56 ̶ vazebné vs. asociační studie ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 57 http://www.intechopen.com/books/type-1- diabetes-pathogenesis-genetics-and- immunotherapy/genetics-of-type-1-diabetes ̶ Linkage (vazebná) analýza – dva základní principy: • geny umístěné na různých chromozomech segregují nezávisle a není tedy mezi nimi žádná vazba • čím blíže u sebe lokusy na stejném chromozomu leží, tím je pravděpodobnost rekombinace θ mezi nimi menší, přičemž může dosahovat maximálně hodnoty 0,5. Jestliže jsou dva lokusy na jednom chromozomu příliš blízko u sebe, mezi těmito lokusy existuje vazba a dochází ke společné segregaci alel. Pokud například zjistíme, že rekombinační poměr genetického markeru s určitou nemocí je nízký, můžeme usoudit, že se tento marker nachází blízko genu pro nemoc. ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 58 ̶ Linkage (vazebná) analýza • testuje kosegregaci genového markeru a fenotypu nemoci v rodině • marker a nemoc se v dané rodině mají vždy vyskytovat spolu oparametrické metody - je-li stanoven model dědičnosti ovs. neparametrické metody ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 59 ̶ Linkage (vazebná) analýza – parametrické metody • je-li stanoven model dědičnosti (při genetickém mapování monogenních nemocí) odostatek rodin, ve kterých daná nemoc postihuje alespoň dvě generace, a jasně definovaný fenotyp ohodnocení dle LOD skóre – logaritmus šance (odds), že tato vazba existuje. Konvenčně je LOD skóre 3 (šance 1000:1 ve prospěch existence vazby) přijímáno jako důkaz vazby a LOD skóre – (minus) 2 (1:100 proti) jako důkaz, že lokusy nejsou vázány oporovnání NULOVÉ HYPOTÉZY (neexistuje vazba, θ = 0,5) s alternativní hypotézou ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 60 ̶ Linkage (vazebná) analýza – neparametrické metody • u komplexních chorob onapř. studium sourozenců, sdílení alel ozjišťuje se, jestli pár zdědil daný marker častěji než v případě náhodné segregace. K tomu slouží počet tzv. IBD alel (identical by descent, identické původem) oNULOVÁ HYPOTÉZA = oba sourozenci sdílejí dvě IBD alely s pravděpodobností 25 %, jednu IBD alelu s pravděpodobností 50 % a žádnou takovou alelu s pravděpodobností 25 % oMožná vazba by se projevila tím, že oba nemocní sourozenci by sdíleli více IBD alel než kdyby šlo o náhodu ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 61 ̶ Linkage (vazebná) analýza • Posun zjištění (ascertainment bias) orozdíl v pravděpodobnosti, s jakou budou nahlášeni postižení příbuzní pacientů ve srovnání s postiženými příbuznými kontrol • Posun hlášení (recall bias) ovětší motivace příbuzných probanda k vyplnění dotazníku, protože je jim dané onemocnění bližší ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 62 ̶ Asociační studie • vyšetřují souvýskyt markeru a nemoci na populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markerů u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control) • retrospektivní studie • prospektivní studie • TDT studie ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 63 ̶ Asociační studie • statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako např.: oklinické subtypy nemoci (studie case-case) ozávažnost nemoci očasný začátek nemoci orizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví ovhodné biologické znaky (např. plazmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfizmů v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 64 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • srovnávání frekvencí alel studovaného genu mezi dvěma skupinami nepříbuzných osob ze stejné populace (zamezení tzv. stratifikace) • u metod retrospektivních se vyvinula daná nemoc a až poté se zjišťuje, zda postižená osoba byla nebo nebyla vystavena sledovanému rizikovému faktoru (například přítomnost určité formy genu) • nutné definovat kritérium, podle kterého se subjekty rozdělí do skupin (např. dle klinického vyšetření) • charakteristika skupin – srovnatelnost (např. věk, pohlaví nebo rasa) = strukturální vyvažování případů a kontrol (matching) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 65 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 66 http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n12/box/nrg2670_BX3.html ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • funkční kandidátní geny oprodukty genů se patofyziologicky uplatňují u dané choroby • pozičních kandidátních genů omohou tak navazovat na vazebné metody, u nichž se vymezil úsek chromozomu, kde se pravděpodobně hledaný gen nachází, a tento gen odhalit ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 67 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • poměr šancí (OR, odds ratio) osíla asociace je vyjádřena podílem nadějí vypočítaným z frekvence dané alely u pacientů a kontrol oje-li frekvence studované alely shodná u pacientů i kontrol, je podíl nadějí = 1 oOR=(80*50)/(50*20)=4 ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 68 pacient kontrola Alela G 80 50 Alela A 20 50 ̶ Vyjádření rizika u komplexních chorob • riziko = pravděpodobnost vývoje onemocnění numericky: 0 – 1 • znaky (genetické, environmentální,…), které zvyšují tuto pravděpodobnost  rizikové faktory ovýsledky různých studií daného RF by měly být konzistentní oasociace by měla být silná a specifická (nezávislá na jiných faktorech) oodpověď dávka/efekt obiologická věrohodnost ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 69 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • přímá asociace opředpokládá se, že sledovaný marker je zároveň patogenetickým lokusem pro nemoc a má tedy hypoteticky přímý (kauzální) efekt na fenotyp oje tedy nutné vybrat několik kandidátních lokusů, které by mohly být přímo zodpovědné za danou nemoc ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 70 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • pokud kandidátní lokusy neznáme, můžeme využít nepřímé studie, kde genotypizací musí projít daleko více většinou disperzně rozptýlených markerů o u asociovaného markeru/ů předpokládáme, že se nachází v blízkosti lokusu pro nemoc ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 71 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • nepřímé studie okdyž jsou alely v těsné blízkosti, segregují společně a dochází zde k minimálnímu crossing-overu – dva lokusy jsou ve vazebné nerovnováze (Linkage disequilibrium, LD, allelic or gametic disequilibrium) osíla LD, a tedy hustota pokrytí genomu markery, je pro tyto studie stěžejní ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 72 ̶ Asociační studie – prospektivní • “cohort” studie oz populace se vybere vzorek subjektů (kohorta), kteří v době výběru netrpí danou chorobou ozjišťováním přítomnosti příslušných genetických markerů v jejich genetické výbavě se vymezí skupina, u které se vyskytuje studovaný rizikový faktor oskupina je po určitou dobu sledována, zpravidla jde o několik let opoté se porovnávají alelické frekvence osob, u nichž došlo k rozvoji dané choroby (fenotypu) a ostatních, u kterých se tato choroba neprojevila ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 73 ̶ Asociační studie – prospektivní – “cohort” studie • relativní riziko (RR) opoměr incidence onemocnění v exponované skupině ku incidenci v neexponované skupině oporovnává riziko vzniku nemoci při nosičství určité alely s rizikem bez nosičství této alely ou vzácných onemocnění se přibližně rovná i OR (B < D a A < C) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 74 ̶ Asociační studie – prospektivní – “cohort” studie • nejprve je tedy určen rizikový faktor a až poté sledujeme, zda dojde k rozvinutí onemocnění • rovněž je možno sledovat populaci nemocných např. s ohledem na rychlost progrese nemoci či úmrtí • jestliže se smíříme s délkou trvání těchto metod (a tedy typicky většími finančními a personálními náklady), získáme hned několik výhod • můžeme vyjádřit RR dané alely a nemusíme řešit častý problém s výběrem kontrolní skupiny ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 75 ̶ Asociační studie – Test nerovnováhy přenosu (angl. transmission disequilibrium test, TDT) • ke studiu se využívají tzv. tria, které tvoří vždy dítě, postižené danou chorobou, a jeho rodiče, kteří ovšem musejí být v kandidátním lokusu heterozygoty • protože se jedná o heterozygoty, můžeme snadno zjistit, která alela pochází od kterého rodiče • měří se frekvence, s jakou se na dítě přenášejí kandidátní alely, a frekvence, s jakou se na něj přenášejí alely alternativní – porovnávání oshoda = alela se na vzniku onemocnění neúčastní orozdíl = alela je s chorobou v asociaci (jedná se o aplikaci McNemarova testu) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 76 ̶ Asociační studie – TDT • nevýhoda pro nemoci s pozdním nástupem ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 77 ̶ Asociační studie • kauzální souvislost • přirozená selekce • populační stratifikace • statistický artefakt ohodnoty pravděpodobností asociačních studií musí být korigovány: ne p=0,05 (event. 0,01) ale p=0,05/m (Bonferonni correction) m=počet zároveň provedených testů • linkage disequilibrium ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 78 ̶ Asociační studie • v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií oneodůvodněné očekávání nalezení genů velkého účinku ovelká skepse k existenci genetického podkladu u nemocí, které jsou v populaci časté (>1 %) ̶ Design genetických studií Komplexní choroby 79 ̶ Variabilita počtu kopií genu (CNV) • v roce 2004 objevena nová forma strukturní variability lidského genomu • CNV dnes tvoří asi 12 % lidského genomu • CNV se podílejí na genetické variabilitě jedinců ̶ Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby 80 http://cnv.gene-quantification.info/ ̶ Variabilita počtu kopií genu (CNV) • pokud CNV ve formě delecí/duplikací postihují důležité geny, mohou způsobovat genetické choroby • CNV mapování (cytogenetické techniky, karyotypizace se SNP sondou, NGS) • CNV asociovány s nádorovými onemocněními, autismem, schizofrenií a dalšími ̶ Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby 81 http://slidedeck.io/yulingl/cnv-cs374 ̶ Jednonukleotidové polymorfizmy (SNPs) • v regulačních oblastech, intronech i exonech • důsledkem může být: ozměna AA oukončení translace, a tím pádem zkrácení polypeptidu (často dochází k rychlé degradaci) ovliv na sestřih, transkripci nebo stabilitu mRNA • cca 7 milionů známých lidských SNPs v dbSNP databázi • HapMap projekt – běžné SNPs s MAF>5 %, populační rozdíly • Haploview – k vizualizaci LD struktury dané oblasti genu ̶ Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby 82 ̶ Nové směry (tzv. high-throughput techniky) • multiplexing (určení velkého množství markerů v jediná reakci) nebo DNA pooling (zjištění alelické frekvence při smísení DNA vzorků více jedinců) • DNA microarrays, SnaPshot, NGS, MS a další ̶ Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby 83 ̶ Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby 84 doi:10.1371/journal.pcbi.1004259 ̶ Závěr – Otázky k hodnocení významu genetických faktorů u komplexních nemocí Komplexní choroby 85 ̶ 1. Jak důležité jsou genetické vlivy u nejčastějších forem těchto nemocí? ̶ 2. Jaký je vliv prostředí na vznik nemoci? ̶ 3. Které jsou nejslibnější přístupy k determinaci genetických faktorů pro nemoc? ̶ 4. Které geny již byly vybrány jako možní kandidáti? ̶ 5. Které cesty přispívají ke genetické vnímavosti pro danou nemoc? ̶ Závěr – Otázky k hodnocení významu genetických faktorů u komplexních nemocí Komplexní choroby 86 ̶ 6. Kolik genů se podílí na vnímavosti k nemoci? ̶ 7. Jsou nejčastější formy polygenní nemoci asociovány s častou nebo vzácnou genetickou variabilitou v populaci? (hypotéza častá variace/častá nemoc vs. genetický heterogenní model) ̶ 8. Proč alely, které jsou asociovány s nemocí, nebyly z populace eliminovány? ̶ 9. Jak důležité jsou pro danou nemoc interakce geny-prostředí a geny-geny? ̶ 10. Jaké jsou důsledky pro farmakogenetiku? ̶ Závěr – Genetická analýza komplexních nemocí vs. monogenních chorob Komplexní choroby 87 Gen Nalezení „variant“ v příslušném genu Analýza genových variant Mendelistické nemoci Komplexní nemoci Diagnostika „Náchylnost“ (susceptibility) Klinický význam dosud „problematický“ Léčebná intervence Prognostický indikátor Genetické poradenství ̶ Závěr – Cíle genetického výzkumu u komplexních nemocí Komplexní choroby 88 doi: 10.1038/nrg2344 ̶ Závěr – Cíle genetického výzkumu u komplexních nemocí Komplexní choroby 89 ̶ zlepšit porozumění patofyziologii uvedených chorob ̶ přispět k diagnostice onemocnění ̶ nalézt parametry rizika progrese nemoci či stupně její závažnosti ̶ Nové poznatky by měly napomoci upřesnění diagnostických a/nebo léčebných postupů (individualizovaný přístup k terapii). ENVIRONMENTAL GENOMICS ̶ Tato prezentace je autorským dílem vytvořeným zaměstnancem Masarykovy univerzity. ̶ Studenti kurzu/předmětu mají právo pořídit si kopii prezentace pro potřeby vlastního studia. ̶ Jakékoliv další šíření prezentace nebo její části bez svolení Masarykovy univerzity je v rozporu se zákonem. Informace o duševním vlastnictví Personalizovaná medicína 91