Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Využití AFM mikroskopie při mapování mechanických vlastností Jan Přibyl, Radka Obořilová, Jakub Máčala CEITEC MU, Masarykova univerzita Email: jan.pribyl@ceitec.muni.cz 1. Úvod 1.1. Popis techniky Mikroskopie atomových sil (AFM)(1) je zobrazovací technika založená na rastrovacím pohybu sondy nad studovaným povrchem. Výsledkem této interakce je trojrozměrný obraz povrchu. Zjednodušeně lze konstatovat, že geometrie sondy ovlivňuje rozlišení, které může dosahovat až subnanometrových hodnot. Sledování různých parametrů interakce pak vede k tomu, že AFM poskytuje nejen topografický obraz povrchu, ale také informaci o rozložení adhezních sil, materiálovém složení, magnetických silách, tuhosti a dalších parametrech povrchu. Sonda totiž interaguje s povrchem vzorku prostřednictvím různých sil(2), jako jsou van der Waalsovy síly, elektrostatické síly a mechanické kontaktní síly. Popis přístroje AFM se skládá z několika klíčových součástí (Obrázek 1)(3). Srdcem mikroskopu je sonda (většinou ostrý pyramidální hrot, ale používají se i jiné tvary) umístěná na mikroraménku (nosník, nesprávně se označuje anglikanismem kantilever). Interakce sondy s povrchem je sledována prostřednictvím ohybu raménka, a to nejčastěji pomocí laserového paprsku, který je směřován na čtyřsegmentovou fotodiodu. Existují ale i jiné způsoby indikace ohybu. Jemné pohyby mikroraménka jsou obstarávány piezoelektrickým skenerem, což je keramická tyčinka potažená elektrodami, která na ni přivádí vysoké napětí, jenž způsobuje její pohyb. Systém zpětné vazby řídí velikost tohoto napětí na základě analýzy interakce mezi sondou a povrchem. Systém řízení zpětné vazby, vysílání napětí do piezoelektrických skenerů, analýza jednotlivých signálů a komunikace s počítačem a dalšími periferiemi jsou umístěny v řídící jednotce, což bývá nejdražší součást celého AFM. 1.1. Měřící módy Ve srovnání s jinými mikroskopiemi je AFM vlastně mikroskopií mechanickou, tj. vyhodnocující vlastnosti vzorku na základě interakce s próbou. Při kontaktu s povrchem pak próba proniká i do jeho struktury a umožňuje tak sledovat i vlastnosti pod povrchem, hovoříme o tzv. indentaci. Sonda zprostředkovávající interakci s povrchem pak může vykonávat různý pohyb ve všech osách, tím je pak řízen i měřící režim(4), tj. směr a způsob pohybu nosníku se sondou vzhledem ke vzorku. Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Obrázek 1: Schéma AFM mikroskopu, adaptováno z publikace (3). Kontaktní režim Je nejstarší a nejjednodušší způsob měření, při kterém je hrot (nebo jinak tvarovaná sonda) v nepřetržitém kontaktu s povrchem vzorku. Může pracovat ve dvou módech, a to v módu konstantní síly a konstantní výšky. V prvním módu je výchylka konzoly monitorována, aby se pomocí smyčky zpětné vazby udržovala konstantní síla mezi hrotem a vzorkem. Ve druhém se pak sonda pohybuje v konstantní výšce nad povrchem a je měřena aktuální výchylka nosníku. Kontaktní mód se využívá především pro zobrazování pevných a tvrdých povrchů, výhodou je experimentální jednoduchost a snadná kombinovatelnost např. s tzv. víceprůchodovými módy, kdy je v prvním průchodu měřena topografie a v druhém pak magnetické či vodivostní vlastnosti povrchu. Mezi nevýhody se často řadí destruktivnost při práci s měkkými vzorky (např. buňkami). Zvláštní podskupinu kontaktního módu měření pak představuje tzv. plně indentační režim, při kterém je vzorek deformován do dosažení zadané síly. Tuto deformaci popisuje silová křivka (závislost síly na výšce), jejím zpracováním pak dostáváme informace o elasticitě v daném bodě. Naměřením sítě těchto bodů pak vznikají mapy elasticity, vyjádřené jako rozložení Youngova modulu pružnosti. AFM nosník s próbou vzorek laser Fotodioda – detektor Piezo-skener (X, Y, Z pohyb) Smyčka zpětné vazby, elektronika, PC Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Při měření s čtyřbokou pyramidou lze Youngův modul pružnosti vypočítat proložením silové křivky rovnicí(5) (1). 𝐹 = 𝐹 tan (𝛼) (1−𝜈2)√2 𝛿2 (1) Kde F je hodnota síly, E je Youngův modul pružnosti, ν je Poissonova konstanta, α je úhel který svírá próba s nosníkem, δ je hloubka indentace (distance). Polokontaktní (poklepový) režim V tomto režimu se nosník rozkmitá v blízkosti své rezonanční frekvence a přerušovaně se dotýká povrchu vzorku. Amplituda kmitání se využívá k udržování konstantní interakční síly a její změna pak slouží k převedení na informaci o topografii povrchu. Fázová změna frekvenčního signálu pak doplňuje topografii o mechanických vlastnostech vzorku. Výhodami poklepového režimu je jeho citlivost při použití na měkké vzorky. Je vhodný pro zobrazování v běžné atmosféře i v kapalině. Dosahuje nižších rychlostí zobrazování než kontaktní mód, u moderních přístrojů je jeho rychlost dostatečná i pro tzv. video-režim, tj. snímání s rychlostí vyšší než 15 obrázků za sekundu. Typicky se pak využívá pro zobrazování biologický vzorků, jakými jsou např. biomolekuly nebo buňky. Mimorezonanční poklepový režim Je nejnovější měřící mód dostupný dostupný na nejmodernějších mikroskopech. Principem činnosti je rychlé přibližování k povrchu po velmi krátké výškové trajektorii, při kterém je zaznamenávána silová křivka (Obrázek 2). Jedná se o mimorezonanční poklep, kdy je nosník poháněn frekvencí mnohem nižší, než je jeho rezonance. Vzorkovací frekvence je až 8 kHz, tj. každou sekundu se naměří a vyhodnotí 8 tisíc přibližovacích křivek, na jejichž základě je sestaven obraz povrchu s vysokým rozlišením spolu s mapováním elasticity či adhezivity povrchu. Vysokou přesnost zobrazení určuje právě princip měření, kterým je udržení konstantní konstantní síly interakce v každém bodě. Tyto režimy mají komerční označení např. Peak Force Quantitative NanoMapping (PFQNM)(6), Force Volume a Quantitative Imaging(7). Výhodami tohoto druhu měřících módů je možnost dosáhnout velice podrobné mapy mechanických vlastností (např. tuhost, adheze). Jsou ideální pro práci prakticky se všemi druhy vzorků, od tuhých a rigidních materiálů až po měkké, hydratované vzorky typu biomolekul, gelů a buněk. Minimalizuje poškození choulostivých Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz vzorků. Typickým příkladem je struktura dvoušroubovice DNA na Obrázek 3. Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Obrázek 2: Příklad silové křivky s vyznačenou přibližovací a oddalovací částí křivky, adhezním minimem a indentační částí, jejíž tvar odpovídá mechanickým vlastnostem vzorku. Obrázek 3: Struktura dvoušroubovice DNA nasnímaná AFM mikroskopem pracujícím v PFQNM módu je provedena v odstínech hnědé. Teoretická Watson-Crickova struktura je schematicky znázorněna v barvách modré a růžové. Převzato z(8) . 1.2. Příklady použití AFM je s výhodou využíváno pro zobrazování a další charakterizaci celé škály vzorků(9), výhodou je snadná příprava a možnost zobrazování ve všech druzích prostředí – od prostředí vakua či inertního plynu až po fyziologické prostředí kultivačního roztoku. Pracovní teplota se může pohybovat od hlubokého mrazu až po teploty atakující 600 oC. Při vlastní aplikaci AFM se pak většinou pohybujeme ve dvou rovinách – použití pro charakterizaci připravených vzorků.tj. např. charakterizujeme drsnost leptaného povrchu, nebo pak pro analýzu struktury vzorku, který je přítomen v roztoku nebo suspenzi. První případ je jednoduchý, vzorek není potřeba nijak upravovat a je možné ho podrobit přímo vlastní analýze. Druhá možnost, tedy analýza struktury vzorku v roztoku, pak vyžaduje jeho vhodnou imobilizaci na podkladní materiál. Pro úspěšný experiment je potřeba splnit několik podmínek – vybrat vhodný podkladní materiál (chemické složení, drsnost, případně biokompatibilita), správný imobilizační postup a také optimalizovat koncentraci tak, aby na povrchu byla správná hustota studovaných objektů. Plánování experimentu tedy začíná výběrem vhodného podkladního materiálu. Popišme si teď ty nejčastěji používané. Tradičním materiálem je vysoce uspořádaný pyrolytický grafit (HOPG), vysoce uspořádaná forma čistého pyrolytického grafitu, grafitového materiálu s vysokým stupněm preferované krystalografické orientace, který se obvykle získává grafitizačním tepelným zpracováním uhlíku nebo chemickým napařováním. Jedná se o vrstevnatý materiál, který lze snadno čistit odlupováním horních vrstev. Je vodivý a vysoce hydrofobní. Hydrofobicita umožňuje nespecifickou imobilizaci prakticky jakéhokoliv vzorku, tento druh interakce je však velmi silný a může vést k denaturaci biomolekul. To, spolu s vysokou cenou, brání jeho širšímu využití pro biologicky zaměřené experimenty. V této oblasti se naopak široce prosazuje muskovit (světlá slída), hydrofilní křemičitanový materiál, který má vrstevnatou strukturu, což se i zde s výhodou používá pro snadné čištění jeho povrchu. Isoelektrický bod tohoto materiálu je na hodnotě 3.1 a proto je pro většinu aplikací v biologii a Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz biochemii, tj. při pH kolem fyziologické hodnoty, nabit negativně. Na to je potřeba myslet, pokud imobilizuje vzorek pomocí iontové interakce. Např. DNA je také negativně nabita, a proto je potřeba aplikovat systém, který tuto interakci zprostředkuje. Tím je např. použití dvojmocných kationtů (Mg2+, Co2+), polyeletrolytů (polylyzin) nebo silanizací povrchu v parách. Při imobilizaci proteinů je třeba se řídit jejich isoelektrickým bodem, tj. použít takové pH roztoku, aby byl protein kladně nabitý, tj. pH mezi isoelektrickým bodem muskovitu a proteinu. Iontová interakce pak dostačuje k tomu, aby biomolekuly byly dostatečně pevně zachyceny pro zobrazování v kapalině i v přirozené atmosféře. Pro práci s živými buněčnými kulturami se i pro AFM aplikace používá standardní kultivační materiál, kterým je nejčastěji plast (polystyren, polypropylen) a sklo. Pro útvary velikosti buněk (plošná velikost v desítkách a výška v jednotkách mikrometrů) není potřeba používat materiál extrémně hladký (HOPG, muskovit). Samotná imobilizace pak probíhá přirůstáním buněk k podkladu, který se často modifikuje specifickými proteiny podporujícími adhezi (kolagen, fibrin, lamin). I zde stejně, stejně jako u sledování individuálních biomolekul platí, že sledované objekty musí být na podkladním materiálu dobře uchyceny, aby umožňovaly interakci s AFM sondou. Nelze tak proto pracovat se suspenzí mikročástic nebo neadhezivními buňkami. 2. Praktická úloha – zobrazování fágové DNA v nativních podmínkách 2.1. Úvod Jak již bylo řečeno výše, v úvodní části, je AFM vhodnou metodou pro zobrazování struktury jednotlivých molekul DNA. Lze sledovat strukturní změny na úrovni molekul v prostředí blízkém fyziologickým podmínkám, tj. v pufrovaném prostředí s řízenou hodnotou teploty. V praktické části si vyzkoušíme imobilizaci DNA na povrch pomocí monovrstvy polyelektrolytu polylyzinu a její zobrazení na moderním přístroji Bruker Dimension FastScan Bio v mimorezonančním poklepovém režimu PFQNM. Závěrem bude jednoduchý protokol o provedeném experimentu a jeho výsledek. 2.2. Praktické provedení Pomůcky a chemikálie ▪ AFM mikroskop Bruker Dimension FastScan Bio ▪ Sonda Bruker ScanAsyst-Fluid+ ▪ Roztok DNA v TRIS pufru ▪ 0,1% roztok poly-L-lyzinu (pLL) ▪ TRIS pufr pH=7,4 ▪ Muskovit upevněný na nerezové podložce ▪ Pipety automatické vč. špiček ▪ Plastové mikrozkumavky ▪ Pinzeta Příprava vzorku pro zobrazování Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz 1. Očistěte povrch muskovitu na povrchu nerezového plíšku lepící pásky tak, aby byly viditelně odstraněny vrchní vrstvy, a přitom povrch zůstal bez šupin. 2. Na povrch muskovitu naneste 50 µl 0,1% polylyzinu, tj. tak aby celý povrch muskovitu byl pokryt kapkou tohoto roztoku. 3. Inkubujte 20 minut při laboratorní teplotě, přikryjte víčkem Petriho misky. 4. Po skončení inkubace opláchněte roztok pLL velkým množstvím TRIS pufru, před dalším nanášením nenechte povrch zaschnout. 5. Naneste na povrch roztok DNA o koncentraci 1-5 nmol/l, objem 50 µl, tj. opět tak, aby byl zakryt celý povrch muskovitu. 6. Inkubujte 20 minut při laboratorní teplotě, přikryjte víčkem Petriho misky. 7. Po skončení inkubace opláchněte roztok pLL opakovaným přidáváním a odsáváním TRIS pufru (5 x 100 µl TRIS pufru), před dalším nanášením nenechte povrch zaschnout, nechte na něm kapku TRIS pufru. 8. Takto je vzorek připraven pro zobrazování, přeneste ho do komory AFM, kde ho připevníte na měřící základnu. Zobrazování DNA 1. V průběhu imobilizace vzorku s DNA, která je popsána v předchozím odstavci, si můžeme připravit AFM mikroskop. 2. Měřící sondu Bruker ScaAsyst Fluid+ umístěte pomocí pinzety do držáku Z-skeneru. 3. Na oblast sondy a okénka na tomto skeneru umístěte 30 µl TRIS pufru, tak aby tato oblast byla zakrytá pufrem. 4. Umístěte Z-skener do AFM mikroskopu a navigujte pohyb základnu se vzorkem a měřící hlavu tak, aby se kapky vzorku a na skeneru navzájem spojily. Vznikne tím souvislý meniskus kapaliny, kterým může procházet světlo i laser AFM, vidíte optický obraz povrchu. 5. Další nastavení a vlastní měření proveďte podle přiloženého videa a dle pokynů personálu laboratoře, který vás bude experimentem provázet. 6. Uložené obrázky pak vyhodnoťte v softwaru Gwyddion (viz kapitola 2.3), vyexportujte a použijte ve finálním protokolu. 2.3. Vyhodnocení naměřených dat Pro vyhodnocování dat z AFM mikroskopu je možné použít celou řadu programů, některé z nich jsou volně dostupné, jako např. software dodávaný s mikroskopem, Gwyddion, WSxM, atp., některé placené – např. SPIP. My použijeme software Gwyddion (více informací, vč. návodů a podpory na webu http://gwyddion.net), který má svou základnu v Brně. 1. Otevření příslušného souboru – v dialogu Open nebo přetažením z prohlížeče souborů: Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz 2. Pro zpracování obrázku je potřeba aplikovat několik funkcí, které jsou již v programu připraveny. V následujícím schématu jsou vyznačeny červenými kruhy. Použijte je v pořadí od horního levého rohu dolů, není to ale esenciální: 3. Výsledný obrázek můžeme vyexportovat ve formátu JPG pomocí File – Save as. 4. Zanalyzujte další vlastnosti řetězců DNA na obrázku, jako je např. délka řetězců, jejich průměrná šířka, drsnost povrchu atp. K tomu si najděte návod na stránkách softwaru Gwyddion - http://gwyddion.net. 3. Literatura Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz ▪ Video popisující přípravu a zobrazování vzorku DNA, je uloženo ve Studijních materiálech tohoto předmětu. ▪ eKurz CEIT_NAN_1 Přístroje a metody CF Nanobiotechnology dostupný na is.muni.cz (vyberte místo studijního období eKurzy). ▪ Odborná literatura: 1. Binnig G, Quate CF, Gerber C. The Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 1986;56:930–3. 2. Seo Y, Jhe W. Atomic force microscopy and spectroscopy. Rep Prog Phys. 2007;71:016101. 3. Kabanov D, Klimovic S, Rotrekl V, Pesl M, Pribyl J. Atomic Force Spectroscopy is a promising tool to study contractile properties of cardiac cells. Micron. 2021;103199. 4. Moreno-Herrero F, Colchero J, Gómez-Herrero J, Baró AM. Atomic force microscopy contact, tapping, and jumping modes for imaging biological samples in liquids. Phys Rev E. American Physical Society; 2004;69:031915. 5. Roa J, Oncins G, Diaz J, Sanz F, Segarra M. Calculation of Young’s Modulus Value by Means of AFM. Recent patents on nanotechnology. 2011;5:27–36. 6. Young TJ, Monclus MA, Burnett TL, Broughton WR, Ogin SL, Smith PA. The use of the PeakForceTM quantitative nanomechanical mapping AFM-based method for high-resolution Young’s modulus measurement of polymers. Meas Sci Technol. 2011;22:125703. 7. Chopinet L, Formosa C, Rols MP, Duval RE, Dague E. Imaging living cells surface and quantifying its properties at high resolution using AFM in QITM mode. Micron. 2013;48:26–33. 8. Ido S, Kimura K, Oyabu N, Kobayashi K, Tsukada M, Matsushige K, Yamada H. Beyond the Helix Pitch: Direct Visualization of Native DNA in Aqueous Solution. ACS Nano. American Chemical Society; 2013;7:1817–22. 9. El Kirat K, Burton I, Dupres V, Dufrene YF. Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy. Journal of Microscopy. 2005;218:199–207. 4. Vzor protokolu k této laboratorní úloze Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Jméno, příjmení, ročník, obor Datum vypracování úlohy Použité pomůcky Pracovní postup Výsledky – zahrnují grafický výstup a další parametry popisující zaznamenaný obrázek povrchu (délka řetězců, jejich šířka, drsnost povrchu atp.) a popis dosažených výsledků Závěr