Konfokální mikroskop
confocal laser scanning microscope (CLSM)

ˇ Minský M. (60. léta 20. století)
ˇ Petráň M. a Hadravský M. (1967) - konstrukce konfokálního
mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče
ˇ rozvoj od konce 70. let 20. století
- laserový paprsek, počítač
ˇ dvou (multi-) fotonový mikroskop
Historie

Confocal - conjugate (sbíhat) + focal (ohniskový)
obě clonky jsou umístěny v ohniscích
Laser
Scanning
Microscop
(internet)

Schéma současného
konfokálního
mikroskopu
(s rozmítaným laserovým
paprskem)
(Vesmír, 1995)
zaostřená rovina
zrcadlová
bodová
clonka
laser
dělič
paprsků a
rastrovací
zařízení
informace o
souřadnicích bodů
(X - Y)
konfokální
bodová
clonka
detektor
světla
informace o intenzitě
světla
objektiv
objekt

konfokální clonka
paprsky z ohniskové roviny
paprsky z mimoohniskových
rovin
ohnisková rovina
mimoohniskové rovinyčočka
Princip konfokálního mikroskopu

Konfokální mikroskop na bázi Nipkowova kotouče
(internet)
série čoček
série
otvorů
rotace
Nipkowovy
kotouče
světlo
dichroické
zrcátko
CCD
objektiv
objekt

1
2
3
4
řez 1
řez 3
řez 4
řez 2

řez 1 řez 2
řez 3
řez 4

Využití světla pro CLSM
ˇ reflexe - textura a složení povrchů - elektronických
součástek, studium neuronových sítí (pomocí Ag), ...
ˇ difúze
ˇ fluorescence - struktura buňky a tkání, studium
metabolických drah, ...

Výhody CLSM
ˇ odstranění mimoohniskových rovin
ˇ vysoký kontrast obrazu
ˇ neinvazní metoda
ˇ zachování prostorového uspořádání
ˇ schopnost vytvoření prostorové rekonstrukce
ˇ digitální forma výstupu - rotace, perspektiva, ...
ˇ schopnost zobrazení buňky - tkáně - mnohobuněčného
organismu
ˇ současné použití až 3 kanálů - barev

Nevýhody CLSM
ˇ délka zpracování materiálu i snímků =>,,vyhasínání
fluorescence"
ˇ neostré snímky při nízké intenzitě fluorescence
ˇ pořizovací cena (mikroskop, konfokální nástavec,
počítač + program)

snímek z konfokálního mikroskopusnímek z digitálního fotoaparátu

(Lacey, 1999)
Srovnání 3 metodu
žívaných ve fluorescenční mikroskopii
fluorescenční konfokální 2-fotonová
laserlaserrtuťová výbojka
optický řez
(0,5-2m)
excitační světlo
pozorovaná oblast
oblast excitace
( ,,vyhasínání")

(Olympus)

Dvoufotonová mikroskopie
ˇ absorbce 2 fotonů fluorochromem ve stejném okamžiku =>
záření s dvojnásobnou vlnovou délkou (poloviční energie) =>
excitační záření 700 nm (červená) => emitované záření 900 nm

Výhody
ˇ se zvyšující se intenzitou záření zdroje se zvyšuje
pravděpodobnost absorpce 2 fotonů fluorochromem
ˇ excitace fluorochromu jen v zaostřené rovině => odpadá nutnost
konfokální clonky => maximum světla
ˇ velká vlnová délka (700 nm) => pomalejší ,,vyhasínání"
menší rozptyl světla ve vzorku
větší penetrace světla ve vzorku
malá fototoxicita (x UV záření)
Nevýhody
ˇ cena Ti Sapphire laseru
ˇ ohřev vzorku => užití laserových pulsů než plynulé ozáření

Srovnání konfokální a 2-fotonové mikroskopie
konfokální 2-fotonové
oblast excitace
pozorovaná oblast
(internet)

Konfokální mikroskopy
Leica, Nikon, Zeiss, ...
FV 300
FV 500

Olympus Fluoview
ˇ optické řezy v rovinách XYZ , XZY
ˇ schopnost zaznamenat změny i v časové rovině
ˇ současné snímání obrazu v procházejícím a fluorescenčním
světle
ˇ použití dvou kanálů - barev zároveň
ˇ volitelnost rychlosti rastrování => kvalita snímku
ˇ kompenzace šumu, zesíleni signálu

Metodika přípravy materiálu
(vazba F-aktin-faloidin)
ˇ fixace - 4% paraformaldehyd (PFA) ve fosfátovém pufru (PBS)
ˇ promývání - antibody diluent (AbD)
ˇ inkubace - faloidin značený fluorescein isothiokyanátem (FITC)
- faloidin značený tetrametylrhodamin isothiokyanátem
(TRITC)
ˇ promývání - antibody diluent (AbD)
ˇ příprava dočasného mikroskopického preparátu

Metoda přímé fluorescence
faloidin
+
FITC fluorochrom TRITC
F-aktin

vazba aktin-faloidin (FITC)
vazba DNA-DAPI

vazba aktin-faloidin (FITC)
vazba DNA-DAPI
vazba mitochondrie-mitotracker red
neuron, vazba mikrotubulové proteiny-
protilátka (Texas-RED)

http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/confocal/index.html
http://www.olympusmicro.com/primer/java/confocal/index.html
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/multiphoton/excitationbleaching/index.html
http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html
http://www.lob.polytechnique.fr/themes/imagerie_fonctionnelle/Anim_cell1_small.gif
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/index.html
Internetové odkazy
http://137.120.28.214/cslm/lpath.mpg