Buněčný cyklus Buněčný cyklus * cyklus buněčných procesů začínajících "zrozením" buňky buněčným dělením a končících tvorbou dceřinné buňky nebo smrtí * uspořádání životních procesů buňky do logického sledu tak, aby mohlo dojít k duplikaci chromozomů a rozdělení buňky * podmínka tvorby vícebuněčných struktur * rychlost buněčného cyklu určuje rychlost proliferace podle vnitřních potřeb a vnějších stimulů (poruchy kontroly cyklu: riziko rakoviny) * řízení replikace a segregace chromozomů je obdobné ve všech eukaryotických buňkách Periodické proměny buněk byly nejdříve zaznamenány světelnou mikroskopií * mitóza (rozdělení chromozomů) * cytokineze (rozdělení cytoplazmy) * interfáze (dekondenzované chromozomy) Fáze M (mitóza + cytokineze) * buňka je zaměřena na funkce související s buněčným dělením * metabolická aktivita slabá * rozpad jaderné membrány (do ER) * tvorba mitotického vřeténka * kondenzace chromozomů * sestavení kinetochorů * separace chromatid * rozpad vřeténka, * dekondenzace chromozomů * obnovení jaderné membrány (spojení s ER zůstává) Interfáze S fáze * část interfáze, při které dochází k replikaci DNA Fáze G1 a G2 * části interfáze, při kterých buňka monitoruje vnitřní a vnější prostředí a zjišťuje tak, zda je situace vhodná pro zahájení S fáze nebo mitózy Časové odlišnosti buněčného cyklu Existují * buňky s výraznou strukturní a funkční specializací, které nemají schopnost dělení (nervové buňky, svalové buňky, červené krvinky) * buňky, které se normálně nedělí, ale za určitých okolností se dělit mohou (jaterní buňky, lymfocyty) * buňky, které se přirozeně dělí velmi rychle (epiteliální buňky, krevní kmenové buňky) Časové nároky buněčného cyklu velmi variabilní, podle typu tkáně * méně než 30 minut u některých embryí (obojživelníci) * kvasinky 1,5 - 3 hod. * buňky střevního epitelu 12 hod. * savčí fibroblasty v kultuře 20 hod. * savčí játra cca 1 rok * typická rychle rostoucí lidská buňka má 24. hod. cyklus (G1/11 hod., S/8 hod., G2/4 hod., M/1 hod.) Variabilita fází buněčného cyklu * nejvíce variabilní je fáze G1 * většina buněk, které se přestanou dělit zůstává ve fázi G0 (speciální klidová část G1) * buňka obvykle musí registrovat určitý signál, aby mohla postoupit z G1 do S, pak obvykle postupuje i do mitózy Syntéza makromolekul během buněčného cyklu * během interfáze je syntéza RNA a proteinů relativně konstantní * během mitózy klesá syntéza proteinů a zastavuje se syntéza RNA * všechny druhy proteinů s výjimkou histonů se tvoří průběžně během interfáze * histony se tvoří výlučně ve fázi S Syntéza histonů je spojena se syntézou DNA * inhibice syntézy DNA zastavuje syntézu histonů * po dokončení replikace jsou histonové mRNA selektivně degradovány Řízení buněčného cyklu Proč? * reakce na velikost buněk a mimobuněčné signály (živiny, růstové faktory, stresové faktory, poškození DNA) * koordinace návaznosti fází (M fáze nesmí začít před dokončením replikace, replikace DNA se nesmí opakovat dokud buňka neprojde M fází) Principy řízení cyklu * poškozená DNA se nesmí replikovat * mitóza nesmí začít před dokončením replikace * poškozená DNA nesmí být předána do dceřinných buněk * chybně spárované chromozomy nesmí dokončit mitózu Potu Rao a Robert Johnson, 1970 Fúze buňky ve fázi G1 s buňkou ve fázi S: Fúze buňky ve fázi G2 s buňkou ve fázi S Fúze buňky ve fázi M s buňkou ve fázi G1, S nebo G2: v interfázové buňce je zahájena mitóza. MPF je komplex kinázy a cyklinu Principy regulace buněčného cyklu * Posttranslační modifikace - fosforylace - proteolýza II. Řízení buněčného cyklu III. Kontrolní body buněčného cyklu Principy regulace buněčného cyklu * Posttranslační modifikace - fosforylace - proteolýza II. Řízení buněčného cyklu III. Kontrolní body buněčného cyklu Přehled chemických modifikací * kovalentní vazba chemické skupiny k aminokyselině proteinu * typy modifikací: - acetylace (obvykle na 1. aminokyselině) - fosforylace (obvykle spojena s regulacemi) - lipidace (připojení k membráně) - glykosylace (obvykle vně buňky) Modifikace proteinů fosforylací * Fosfátové skupiny jsou připojeny protein kinázami * Fosfátové skupiny jsou odstraněny fosfatázami Proč je fosforylace tak běžným mechanismem regulujícím aktivitu proteinů? * Je reverzibilní * Velké negativní náboje fosfátové skupiny mohou způsobit významné změny ve struktuře proteinů, které vyvolají změny ve funkci Proteinové kinázy * Katalyzují vazbu fosfátových skupin k proteinům (tzv. fosforylaci) * Fosfátové skupiny přenášejí z ATP (za vzniku ADP) * Řídí aktivitu mnoha buněčných proteinů * Proteiny mohou být fosforylovány na mnoha místech * Hlavní regulátory buněčného cyklu a buněčných signalizací Rozklad proteinů * Nepotřebné proteiny se rozkládají proteázami (proteolýzou) na aminokyseliny * Často se využívá proteáz soustředěných do proteazomu * Regulace buněčného cyklu zahrnuje proteolýzu regulačních proteinů, což zajišťuje ireverzibilitu jednotlivých fází Principy regulace buněčného cyklu Bod restrikce (START) * Bod cyklu, který buňky nevratně předurčuje pro dokončení buněčného cyklu - savci: bod restrikce ("restriction point") - kvasinky: START * Lokalizován v pozdní fázi G1 * Po překonání bodu restrikce buněčný cyklus pokračuje bez ovlivnění vnějšími faktory (mohou jej pozastavit jen faktory vnitřní, např. poškození DNA) Bod restrikce/START je v pozdní fázi G1 To divide or not to divide: that is the question Princip buněčného cyklu Komplexy Cdk a cyklinů ("cyclin-dependent kinase") Cykliny Hladina cyklinů v buňce pravidelně kolísá Cyklin-dependentní kinázy Cdk * katalytické podjednotky komplexů Cdk-cyklin * jejich aktivita se zapíná spojením s cykliny * jejich aktivita (nikoliv koncentrace) pravidelně kolísá během cyklu * fosforylují proteiny zodpovědné za průběh a regulaci buněčného cyklu Komplexy Cdk a jednotlivé fáze cyklu * Tři typy: - komplexy Cdk fáze G1 - komplexy Cdk fáze S - mitotické komplexy Cdk (MPF) * Specifita fází cyklu je určena typem cyklinu a v některých buňkách také typem Cdk Typy cyklinů a Cdk Hladina cyklinu B určuje aktivitu MPF * vysoká hladina cyklinu B vysoká aktivita MPF * nízká hladina cyklinu B nízká aktivita MPF * syntéza cyklinu B začíná během interáze (fáze S a G2) Přítomnost cyklinu B není jedinou podmínkou aktivace MPF Podmínky aktivity MPF u kvasinek S. cerevisiae Kontrola ubikvitinace cyklinu B: APC ("anaphase-promoting complex") * APC slouží jako ubikvitin ligáza: připojuje ubikvitin k cyklinu B a dalším proteinům řídících mitózu a tím je předurčuje k degradaci proteazomem * aktivita APC kolísá v průběhu cyklu: zapíná se v pozdní mitóze mitotickým komplexem Cdk (MPF) * substrátem je např. Inhibitor anafáze (sekurin): protein, který inhibuje předčasnou degradaci proteinů, zajišťujících spojení sesterských chromatid (např. kohezinu) - ubikvitinace a rozklad sekurinu uvolňuje chromatidy pro segregaci - ubikvitinace sekurinu je inhibována až do okamžiku připojení kinetochorů všech chromozomů k mikrotubulům vřeténka Cyklin B: regulátor mitotického komplexu Cdk (MPF) - absence cyklinu B inaktivuje MPF a zakončuje mitózu - absence kinázové aktivity MPF umožňuje konstitutivně aktivním fosfatázám odstranit fosfátové skupiny z proteinů, které byly fosforylovány MPF: zakončení mitózy Regulace APC Čtyři úrovně regulací cyklin-dependentních kináz 1. Regulace Cdk interakcí s Cykliny určující je míra syntézy a degradace cyklinů 3. Aktivace Cdk defosforylací * fosforylace Thr 14 a Tyr 15 (zajištěná kinázami Wee1 a Myt1) inaktivuje Cdk 2 * defosforylaci zajišťují fosfatázy rodiny Cdc25 Kontrolní body buněčného cyklu ("cell-cycle checkpoints") Kontrolní body -- molekulární brzdy cyklu Kontrolní bod G1 Průchod závisí na vnějších i vnitřních faktorech * dostupnosti živin * přítomnosti specifických růstových faktorů (mitogenů) * celistvosti DNA Mechanismus řídící buněčný cyklus vnímá vnitřní i vnější buněčné podněty Vnitřní podněty: monitorování stavu DNA a stav připojení chromozomů k dělícímu vřeténku v M-fázi Kinetochory poskytují kontrolnímu bodu ve fázi M informaci o stavu interakcí mezi chromozomy a vřeténkem. Tento kontrolní bod musí získat "potvrzení" o připojení všech chromozomů k mikrotubulům vřeténka, aby umožnil pokračování cyklu do anafáze. Nedostatečná funkce kontrolního bodu v M fázi vede k nerovnoměrné distribuci chromozómů v dceřinných buňkách Mechanismus řídící buněčný cyklus vnímá vnitřní i vnější buněčné podněty Poškození DNA: zastavení cyklu ve fázi G1 a G2 * chemické a fyzikální mutageny poškozující DNA zastavují cyklus ve fázi G1 a G2 * cyklus nemůže pokračovat do S nebo M fáze dokud není poškození opraveno * pozastavení buněčného cyklu (opravitelné poškození DNA) nebo programovaná buněčná smrt (rozsáhlé poškození DNA) je výsledkem aktivace nádorového supresoru p53, který zvýší hladinu inhibitoru Cdk Absence funkčního p53 * nemožnost pozastavení buněčného cyklu * replikace neopravené DNA * hromadění mutací * riziko vzniku rakoviny Mutace v genu p53 se objevují ve více než 50% lidských zhoubných nádorů. Živočišné buňky vyžadují mimobuněčné signály pro dělení, růst a přežití Signální molekuly jsou produkovány jinými buňkami téhož organismu. Klasifikace do tří hlavních skupin: * Mitogeny -- stimulují buněčné dělení tím, že překonávají přirozené brzdící mechanismy buněčného cyklu * Růstové faktory -- stimulují růst buněk vedoucí k navýšení buněčné hmoty tím, že indukují syntézu a inhibují degradaci proteinů a jiných makromolekul * Faktory pro přežívání ("survival factors") -- zvyšují životaschopnost buněk supresí programované buněčné smrti Mitogeny stimulují buněčné dělení * vážou se na povrchové receptory a aktivují je * aktivované receptory stimulují různé buněčné signální dráhy, které zajistí zvýšenou proliferaci tím, že uvolní nitrobuněčné molekulární "brzdy", které blokují přechod z fáze G1 do fáze S Typickou brzdou buněčného cyklu je protein Rb ("retinoblastoma protein") Protein Rb * původně nalezen při studiu dětského očního nádoru -- retinoblastomu: u postižených dětí protein Rb chybí nebo je defektní * objevuje se ve vysoké míře v jádrech zdravých buněk všech obratlovců * váže se na určité regulační proteiny, které za jeho přítomnosti nemohou aktivovat transkripci genů nutných pro proliferaci buněk Mitogeny uvolňují brzdící účinek Rb * Aktivují signální dráhy, které vedou k tvorbě aktivních komplexů cyklinů a Cdk pro fáze G1 a G1/S. * Tyto kinázy fosforylují protein Rb * Fosforylovaný Rb mění konformaci a uvolňuje regulační proteiny, které pak mohou aktivovat expresi genů nutných pro buněčnou proliferaci Průchod bodem restrikce (G1/S): klíčová úloha proteinu Rb raná až střední fáze G1: * Rb tvoří komplex s transkripčním faktorem E2F a histonovou deacetylázou (HDAC) * aktivní represe transkripce cílových genů E2F Buněčný cyklus je podmíněn souhrou řady molekul Stimulace buněčného cyklu mitogenními signály * jako senzory růstových faktorů se uplatňují cykliny D * 3 formy cyklinu D: D1, D2, D3 (tkáňově specifická exprese) * cykliny D reagují na přítomnost transkripčních faktorů (NFB, c-Myc, AP-1) i mitogenních signálů (kaskáda MAP) * cykliny D tvoří komplexy s Cdk4 nebo Cdk6 -- translokace do jádra -- fosforylace kinázou CAK * komplex Cdk4/cycD fosforyluje pRb -- eliminace jeho protirůstové funkce: uvolnění E2F z Rb/HDAC -- vazba E2F na transkripční faktory -- vstup do fáze S Stimulace buněčného cyklu mitogenními signály * E2F indukuje také expresi genů kódujících cyklin E a cyklin A * cyklin E tvoří komplex s CDK2 a spolupracuje s komplexy CDK4/6-cyklin D na dokončení fosforylace Rb * změna v zajištění fosforylace Rb z původně mitogen- dependentních komplexů CDK4/6-cyklin D na mitogen-independentní komplexy CDK2-cyklin E částečně vysvětluje, proč je po překonání bodu restrikce další průběh cyklu nezávislý na přítomnosti růstových faktorů * po zahájení fáze S je cyklin E degradován a CDK2 tvoří komplexy s cykliny A Inhibitory CDK: rodina INK4 ("inhibitor of CDK4") * p16INK4A * p15INK4B * p18INK4C * p19INK4D p16INK4A (=p16) * schopnost vazby ke komplexu CDK4-cyklin D a inhibice kinázové aktivity CDK4 * inhibice fosforylace CDK4 kinázou CAK * inhibice sestavování komplexů CDK4-cyklin D * inhibitory růstu (např. TGF) stimulují transkripci p16 Negativní zpětná vazba: * uvolnění E2F způsobuje aktivaci exprese p16 Protein ARF ("alternative reading frame product") * zapojen do stimulace apoptózy např. v buňkách infikovaných viry * součást signální dráhy řízené p53 * p53 aktivuje expresi mdm2 * MDM2 zjišťuje export p53 z jádra k cytoplazmatickému proteazomu (rozklad p53) * ARF se váže k MDM2 a imobilizuje tak komplex MDM2/p53 v jádře (zablokování přirozené degradace p53) Univerzální inhibitor CDK: p21 * cílový gen proteinu p53 (přímá aktivace transkripce) * váže a inhibuje komplexy: cyklin E-CDK2 cyklin D-CDK4/6 cyklin A-CDK2 cyklin B-CDK1