Rakovina Terminologie: * název rakovina ("cancer") je odvozen od latinského slova označujícího kraba, protože tohoto živočicha starým Řekům připomínaly výběžky šedé hmoty nádoru (řecky: karkinos = rak, onkos = krab) * rakovina - choroba způsobenou maligním nádorem * nádor ("tumor") - neoplazma, novotvar - patologický útvar vytvořený v tkáni mnohobuněčného organismu, jehož růst se vymkl kontrole. Dělení buněk není omezováno žádným regulačním mechanismem. Nádor X Hyperplazie X Metaplazie Rozlišujeme nádory benigní a maligní Benigní - pomalý růst - podobnost s původní tkání (dobrá organizace buněk, vysoký stupeň diferenciace) - ohraničenost - většinou neohrožují život Maligní - vysoká proliferace (velká jádra, jadérka - tvorba ribozomů, polyzomy - tvorba proteinů potřebných pro buněčné dělení) - změny v morfologii, velikosti a tvaru buněk - nižší stupeň diferenciace - metastáze Benigní nádory jsou poměrně časté, ale jsou relativně málo nebezpečné, protože jsou ohraničené a malé I benigní nádory mohou být smrtelné! - nádor žlaznatých buněk: nadprodukce důležitých biologicky aktivních molekul Příklad: Langerhansovy ostrůvky - přílišná sekrece inzulinu - hypoglykemie - smrt - poloha nádoru narušuje nějakou životní funkci Příklad: mozkové výstelka - narušení funkce vitálních center mozku - smrt Maligní nádory obsazují okolní tkáně a rozšiřují se do celého těla Klasifikace a nomenklatura nádorů * název odráží původní tkáň, kde nádor vznikl * přípona určuje, zda se jedná o benigní nebo maligní nádor - om (benigní) - karcinom (maligní epiteliální tkáň) - sarkom (maligní konektivní tkáň nebo sval) - blastom (skupina maligních nádorů dětí) Karcinogeny jsou mutageny * Clunet 1908 -- rentgenové záření u krys způsobuje rakovinu kůže * Yamagiwa and Ishikawa 1915 -- tér způsobuje rakovinu kůže u králíků * Muller 1928 -- rentgenové záření způsobuje mutace u octomilek * Miller and Miller 1960s -- metabolická konverze nemutagenních látek na mutagenní Stadia karcinogeneze: * iniciace * latence * promoce * progrese Iniciace * interakce karcinogenu s DNA * rychlý proces * nevratná (genetická) změna buňky * iniciované buňky se nevyvíjejí do podoby nádorů, pokud není přítomen vnější faktor s funkcí promotoru Latence * období mezi aplikací karcinogenu a objevením se nádoru Promoce * tvorba pre-rakovinných výrůstků vyvolaná působením nádorových promotorů * negenetické změny * stimulace signálních drah indukujících růst * krátkodobé působení promotoru je reverzibilní Progrese * následek dlouhodobého působení promotorů * nádory ztrácí závislost na přítomnosti promotoru * genetické změny Metastáze * šíření primárního (maligního) nádoru do nových tělních lokalizací * sekundární nádory mohou metastázovat dále * typický znak maligních nádorů x zdravé buňky mají vymezený anatomický prostor, který neopouštějí Model tvorby karcinomů kůže u myši Iniciace nádoru - tvorba abnormálních buněk působením tzv. iniciátorů - chemických činidel (nitrosoguanidin, dimetyl benzantracen) - důsledek genetických změn (iniciátory nádorů jsou mutageny) - bezprostřední účinky iniciátorů nejsou zřetelné, kůže zůstává normální Model tvorby karcinomů kůže u myši Model tvorby karcinomů kůže u myši Přeměna zdravé střevní buňky na nádorovou je postupná Nádor tlustého střeva -- signální dráha Wnt Nádor tlustého střeva -- signální dráha Wnt Signální dráha Wnt/b-katenin: cílové geny Shrnutí * proces vzniku rakoviny je zahájen v okamžiku, kdy jedna mutovaná buňky začne abnormálně proliferovat * nádorotvorné procesy jsou urychleny dalšími mutacemi a následnou selekcí rychle rostoucích buněk Existuje více než 100 typů rakoviny * Kolik regulačních okruhů musí být porušeno, aby se buňka zvrhla na nádorovou? * Jsou tyto regulační okruhy univerzální? * Které z těchto okruhů jsou autonomní a které jsou závislé na určitých signálech z okolí? * Je možné, že početné geny spřažené s rakovinou se uplatňují u malého počtu regulačních okruhů? Odpovědi * většina nebo všechny typy rakoviny během svého vývoje získávají řadu obdobných vlastností * způsoby, jakými se k těmto novým vlastnostem buňka dostává mohou být rozmanité (mutace různých genů) Kontrola dělení savčích buněk -- rovnováha aktivit protoonkogenů a nádorových supresorů Poruchy kontroly buněčného dělení jsou dvojího typu Onkogeny * Přirozeně se vyskytují v genomech živočichů v nemutované formě jako protoonkogeny plnící fyziologické funkce, obvykle spojené s růstem a proliferací -- např. řízení buněčného cyklu. Mutací nebo aktivací virem se protoonkogeny mění na transformující onkogeny. * Onkoproteiny se zapojují do rozmanitých signálních drah buňky. Jsou to jednak dráhy mitogenní, ale také dráhy spojené s diferenciací nebo apoptózou. * Na úrovni buňky se chovají dominantně, porucha v jedné kopii již vyvolává účinek (účinek jednoho onkogenu ale k vyvolání nádoru většinou nestačí). * Až na malé výjimky (onkoprotein Ret) nejsou poruchy v onkogenech dědičné a nebývají tedy podstatou "dědičné" formy rakoviny * Onkogeny lze detekovat v nádorových virech nebo "klasickým transformačním testem": transfekcí savčích buněk. Protoonkogeny a nádorové supresorové geny kódují proteiny, které se účastní řízení růstu buněk Aktivátory receptorů pro růstové faktory kódované viry mohou fungovat jako onkoproteiny Aktivující mutace nebo silná exprese receptorů pro růstové faktory mohou vyvolat transformaci buňky Monoklonální protilátky specifické pro Her2 jsou pozoruhodně účinné při léčbě určité skupiny nádorů prsu, které vykazují vysokou produkci Her2. Protilátky se injikují do krve a vážou se na Her2 a selektivně zabíjejí nádorové buňky, aniž by ovlivnily okolní zdravou tkáň Onkogeny často kódují konstitutivně aktivní proteiny zapojené do přenosu signálů Transformaci může vyvolat neadekvátní exprese jaderných transkripčních faktorů Chromozomální translokací může vzniknout transformující onkoprotein (proteinová chiméra) Posilující ("gain-of-function") mutace mění protoonkogeny na onkogeny Onkogeny byly původně nalezeny u transformujících retrovirů -- Virus Rousova sarkomu (RSV) obsahuje gen (src), který se uplatňuje při vzniku rakoviny, ale nezajišťuje žádnou virovou funkci -- normální buňky obsahují příbuzný gen, který kóduje tyrosin kinázu -- normální gen (c-src) je protoonkogen, virový gen (v-src) je onkogen, kódující konstitutivně aktivní mutantní formu tyrosin kinázy DNA viry také obsahují onkogeny, ale ty se uplatňují jako přirozené regulátory virové replikace (nemají buněčné protějšky) Inaktivující ("loss-of-function") mutace nádorových supresorových genů jsou onkogenní První nádorový supresorový gen byl nalezen u pacientů s dědičným retinoblastomem Retinoblastom Na obrázku je rodokmen rodiny s dědičnou formou retinobastomu, může se ale vyskytovat i tzv. "sporadicky". Na základě výskytu obou forem tohoto nádoru Knudson došel k závěru, že pro vznik retinoblastomu je potřeba 2 genetických změn. Mutace inaktivující Rb. Člověk, který zdědil mutaci Rb v heterozygotní podobě je predisponován k rakovině (retinoblastom je častý v dětském věku) Ztráta heterozygozity ("loss of heterozygosity", LOH) nádorových supresorových genů často nastává chybnou segregací nebo mitotickou rekombinací chromozomů Fyziologickou funkcí proteinu Rb je blokovat buněčný cyklus inaktivací proteinu E2F Mutace p53 inaktivuje kontrolní bod G[1 ] Mechanismus bloku buněčného cyklu proteinem p53 jako odpovědi na poškození DNA Porucha v jedné kopii genu p53 způsobuje dědičnou predispozici k rakovině Poruchy reparačních systémů DNA napomáhají vzniku mutací a přispívají ke vzniku nádorů Chiméra je specifická pro nádorové buňky, proto tento způsob terapie může být velmi účinný * Gleevec může proniknout do každé buňky, ale pouze buňky obsahující danou translokaci tvoří chimérický enzym, proto pouze tyto buňky mohou být ovlivněny * Gleevec se ukazuje být do určité míry úspěšný i při léčbě jiných nádorů, patrně proto, že jeho aktivita není zcela specifická Vlastnosti nádorových buněk (1. část) Nádorové buňky mají řadu jiných vlastností než normální buňky: O/ Klonální původ -- nádory jsou odvozeny od jediné deregulované neoplastické buňky O/ Neregulovaný růst -- nádorové buňky nereagují na normální regulační mechanismy ovlivňující růst, ale neomezeně proliferují O/ Změněná tkáňově specifická afinita -- nádorové buňky prorůstají za hranice původní tkáně -- metastázy Vlastnosti nádorových buněk (2. část) O/ Změněné biochemické vlastnosti, které zvyšují růstový potenciál: - zvýšená glykolytická aktivita umožňující růst i za snížených koncentrací kyslíku - sekrece hydrolytických enzymů umožňujících degradaci bazálních membrán a dalších struktur mimobuněčné matrix - tvorba angiogenních faktorů O/ Pozměněný cytoskelet -- chybná organizace cytoskeletu a změněná buněčná morfologie O/ Chromozomální abnormality -- změny v počtu chromozomů, časté delece, translokace a genové duplikace O/ Neomezený růst v tkáňové kultuře -- nádorové buňky jsou obvykle nesmrtelné a mohou být neomezeně kultivovány in vitro 1. Nezávislost na růstových faktorech * zdravé buňky nemohou proliferovat za nepřítomnosti růstových signálů * mnohé onkogeny v buňkách stimulují signální dráhy, které jsou ve zdravých buňkách aktivní pouze za přítomnosti růstových faktorů * snížená závislost na růstových faktorech je zřejmá i u nádorových buněk pěstovaných in vitro Tři molekulární strategie pro získání nezávislosti na růstových faktorech * změna charakteru růstových faktorů nebo způsobu jejich tvorby * změna transmembránových přenašečů signálu * změna nitrobuněčných signálních drah A. změna charakteru růstových faktorů nebo způsobu jejich tvorby * zdravé buňky obvykle produkují růstové faktory pro jiné buňky (heterotypická signalizace) * nádorové buňky získávají schopnost syntetizovat růstové faktory, na které jsou citlivé (autokrinní stimulace) např. PDGF - produkován glioblastomy TGFa - produkován sarkomy B. změna transmembránových přenašečů signálu deregulace povrchových receptorů je běžná při vzniku rakoviny: * zvýšená exprese genů kódujících povrchové receptory pro růstové faktory: zvýšení citlivosti buňky k běžným koncentracím růstových faktorů (např. exprese EGF receptoru je zvýšena u nádorů žaludku, mozku a prsu) * změna struktury receptoru: konstitutivní aktivita i za nepřítomnosti ligandu C. změna nitrobuněčných signálních drah * hlavní úlohu má kaskáda Ras-Raf-MAPK * proteiny Ras jsou pozměněny u 25% lidských nádorů * je pravděpodobné, že růstové signální dráhy jsou deregulovány u všech lidských nádorů 2. Necitlivost na protirůstové signály Zdravá buňka * ve zdravé tkáni fungují protirůstové signály v podobě rozpustných faktorů a inhibitorů imobilizovaných v matrix a na povrchu buněk * na protirůstové signály buňka reaguje stejně jako na růstové faktory (prostřednictvím receptorů a nitrobuněčných signálních kaskád) * na molekulární úrovni protirůstové signály využívají protein Rb, který v nefosforylovaném stavu neumožní expresi genů nutných pro přechod z G1 do S * protirůstovým signálem je např. TGFb, který brání fosforylaci Rb a expresi genu c-myc Abnormální proliferaci a vzniku nádoru napomáhá ztráta signalizace TGFb Nádorová buňka může ztratit citlivost na TGFb různými způsoby: * snížením exprese receptorů TGFb * mutací ve genu kódujícím receptor TGFb * mutací v genu kódujícím některý z dalších nitrobuněčných přenašečů (proteiny SMAD) 3. Průnik do tkání - metastáze * přechod z primárního nádoru do nové tělní lokalizace, ve které je alespoň zpočátku dostatek prostoru a výživy * umožněno změnami dvou typů proteinů: - proteinů, které zajišťují upevnění buněk k okolním buňkám (CAM) a matrix (integriny) - mimobuněčných proteáz (zvýšená exprese genů kódujících proteázy, snížená exprese genů kódující inhibitory proteáz) Šíření nádorů Adhezivní molekuly a receptory určují správnou lokalizaci buněk ve tkáních Adheze buněk a metastáze Peptid RGD může zabránit metastázi Metastatická kaskáda * rozrušení basální membrány * oddělení buněk * pohyb buněk * invaze * penetrace vaskulárního systému * cirkulace rakovinných buněk * opuštění krevního řečiště Složky bazální membrány Inhibice kolagenolytické aktivity snižuje metastatickou aktivitu nádorů * inhibitory metaloproteináz snížují metastatický potenciál nádoru plic Oddělení buněk ("cell detachment") * snížená vzájemná přilnavost (koheze) nádorových buněk * normální buňky téhož typu se od sebe v tkáni neoddělují * redukce exprese genů pro adhezivní povrchové molekuly (kadheriny, kateniny) * transfekce invazivních buněk cDNA kódující kadherin E snižuje jejich invazivitu Pohyb buněk ("cell motility") * buňky odvozené z nádoru vykazují zvětšenou pohyblivost (lze kvantifikovat) * existují enzymy, jejichž přítomnost koreluje s pohyblivostí a a metastatickým potenciálem buněk (např. glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza) * cytokin AMF ("autocrine motility factor") stimuluje pohyb buněk: - produkován nádorovými liniemi - indukuje tvorbu pseudopódií Invaze * průnik konektivní tkání ke kapilárám * obdoba překonání bazální membrány * syntéza kolagenázy I * nádory se liší mírou produkce kolagenázy I, klinický význam nejasný Penetrace vaskulárního systému * nádorové buňky se šíří krevními nebo lymfatickými kapilárami * tlusté stěny kapilár se překonávají obtížně, zřejmě využívány drobné strukturní poruchy v nově tvořených kapilárách * narušení celistvosti stěn kapilár napomáhá kolegenáza IV * drobnými mezerami se buňky dostávají do kapiláry (diapedeza) Cirkulace a opuštění krevního řečiště * nádorové buňky nasedají na sebe navzájem, na lymfocyty a krevní destičky * vzniklý komplex ("embolus") může adherovat na vnitřní povrch kapilár * stabilizace embolu fibrinem * rostoucí embolus může ucpat kapiláru * stabilizované nádorové buňky interagují s endoteliálními buňkami kapilár - průnik * slabá účinnost - mnohé nádorové buňky zůstávají uvnitř kapilár a jsou časem rozloženy Antikoagulační terapie * rozpuštění komplexů nádorových buněk, které mají tendenci ucpat kapiláry - prodloužení pobytu nádorových buněk v krevním řečišti - vyšší pravděpodobnost jejich přirozeného rozložení * prodloužení doby přežití u pacientů s karcinomem plic * slabý účinek na jiné nádory Geny řídící tvorbu metastáz * některé druhy rakoviny mají vysokou tendenci k tvorbě metastáz x rakovina vaječníku metastázuje v minimální míře * snaha najít geny, které o metastázování rozhodují (poznání principu - potenciální cíl terapie) * metastázovaní je složitý proces - řízeno patrně řadou genů, koordinace Gen CD44 * kóduje povrchový glykoprotein, který se účastní mezibuněčné adheze * podléhá alternativnímu sestřihu * lze rozlišit metastázující nádory prsu nebo střeva od nemetastázujících podle nadprodukce transkriptu určitého typu * alternativně sestřihované transkripty jsou potenciálními markery nádorových buněk Gen KAI1 ("kang ai" = čínsky "protinádorový") * na krátkém raménku lidského chromozomu 11 * zapojen do suprese metastázování rakoviny prostaty Ewing (1916): "Metastasis is the most convincing evidence of cancer". Frost and Levin (1992): "There is nothing that a metastatic cell can do that is not a routine task for normal cells". - např. granulocytů, lymfocytů, monocytů a makrofágů, myogenních kmenových buněk somitů, primordiálních zárodečných buněk Růst a metastáze metastáz * aktivní migrace nádorových buněk mezi endoteliálními buňkami a děravou bazální membránou do mezibuněčné matrix konektivní tkáně * proliferace nádorových buněk nastává buď okamžitě nebo po různě dlouhém období dormance * rozhoduje přístup ke krvi (angiogeneze) 4. Podpora angiogeneze * angiogeneze = růst nových krevních vlásečnic * život všech buněk je závislý na přísunu živin a kyslíku * tvorba kapilár závisí na rovnováze mezi induktory angiogeneze (např. FGF, VEGF) a inhibitory angiogeneze (např. trombospondin-1) * růst nádoru je omezen stupněm prokrvení. Za nepřítomnosti živin a kyslíku nádor nemůže dosáhnout větší velikosti než průměru 0,5-1 mm (nekróza buněk ve středu kolonie nádorových buněk) * nádorové buňky ve zvýšené míře tvoří induktory angiogeneze a méně inhibitory angiogeneze Při růstu cév se uplatňují 2 mechanismy: -- angiogeneze -- růst nových cév ze starých - vaskulogeneze -- objevení se cév "z ničeho" -- tj. sestavením a diferenciací endoteliálních prekurzorů u embrya. * kyslík ve tkáních difunduje do vzdálenosti 100 mikronů (0,1 mm) * tvorba cév -je řízena metabolickými potřebami * VEGF -- byl objeven jako první. Nyní známe VEGF-A,B,C,D,E; (3 receptory VEGFR nebo-li FL1-3) * Angiopoietiny 1-4; (receptory TIE1 a 2) * Ephriny (nervový systém); (receptorové tyrosinové kinázy) * Geny Notch * PDGF * Fibroblastové růstové faktory * TGFb Nádorové buňky mohou spouštět angiogenezi Ovlivňováním angiogeneze lze s nádorem manipulovat * angiogeneze je výsledkem dynamické rovnováhy mezi pro- a antiangiogenními faktory. Pro boj s nádory by bylo možno odstranit proangiogenní faktory a přidat antiangiogenní. * Cévy v nádorech jsou podobné jako cévy jinde, jen jsou trochu neorganizované, mění se jejich průměr, mají heterogenní vzhled. * U různých nádorů vypadají cévy různě, protože vznikly působením různých kombinací pro a antiangiogenních faktorů. 5. Neomezený replikační potenciál * buňky pěstované v kultuře procházejí omezeným počtem dělení, pak se dělit přestávají, stárnou a odumírají * inaktivací proteinů Rb a p53 buňky získávají schopnost dělení po další generace až do nástupu "krize" * buňky ve stadiu "krize" jsou charakterizovány častými zaměnami karyotypu (vznik fúzních chromozomů) a masivně odumírají * vzácně dojde k vzniku nesmrtelné buňky (frekvence 1:10^7) * většinu nádorových buněk lze úspěšně pěstovat in vitro Imortalizace a telomery Telomery: * zajišťují počítání dělení buněk * konce chromozomů složené z několika tisíců opakování sekvence 6 pb * během každého buněčného cyklu dochází ke ztrátě 50-100 pb z konce každého chromozomu * postupná eroze telomer vede ke ztrátě schopnosti chránit konce chromozomální DNA před chromozomálními fúzemi, které ve zdravém těle nejsou tolerovány a vedou k smrti buňky * udržování telomer je běžné u všech typů maligních buněk (následek vysoké exprese telomerázy) * zvýšení exprese telomerázy v buňkách in vitro prodlužuje počet pasáží, kterými buňka může projít 6. Únik apoptóze Apoptóza = programovaná buněčná smrt * obvyklá při organogenezi a nedostatku růstových faktorů * fyziologické odstranění nežádoucích buněk bez rizika pro buňky sousední * opak nekrózy (následek poranění, kdy buňky prasknou, vylijí svůj obsah do okolí a způsobí tak zánětlivou reakci) Projevy apoptózy: * odbourání cytoskeletu * rozklad jaderné membrány * fragmentace jaderné DNA * buněčný povrch je změněn tak, aby byl způsobil okamžitou fagocytózu Rakovinné buňky se neřídí regulačními signály pro buněčnou smrt * zdravé buňky mohou žít jen za přítomnosti růstových faktorů, jinak odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i bez růstových faktorů * zdravé buňky s poškozenou DNA odumírají apoptózou x nádorové buňky nikoliv * rezistence k apoptóze je jedním z důvodů prodloužené životaschopnosti nádorových buněk Vlastnosti nádorových buněk pěstovaných v kultuře 1. absence přirozené inhibice růstu po dosažení určité hustoty buněk 2. absence kontaktní inhibice růstu a pohybu buněk 3. Snížená adheze, větší pohyblivost 4. Produkce a sekrece proteáz, které in vivo rozkládají složky extracelulární matrix Transformace buněk pěstovaných v kultuře * nezbytná pro výzkum mechanismu indukce nádoru "focus assay": * test pro sledování transformace in vitro * založen na detekci morfologicky distinktních plaků transformovaných buněk na pozadí buněk netransformovaných * transformované buňky přerůstají netransformované * buňky transformované in vitro mohou po injekci do laboratorních živočichů vyvolat tvorbu nádorů Transfekčními technikami se potvrdila hypotéza, že onkogeny při transformaci spolupracují Páry spolupracujících onkogenů Spolupráce onkogenů při transformaci Epidemiologie nádorů -- nádor je výsledkem 4-6 genetických změn