DGGE: charakteristika

Charakteristika



-    dĺžka fragmentov 100 - 1000 bp

-    fragment musí obsahovať min. 2 denat. domény

     (neidentifikuje mutácie v doméne s najvyššou stringenciou denat.)

-    detekčná schopnosť je 50 - 70 %

-       "GC-clamp" - umelo priradená doména s vysokou        stringenciou

     na 5´- koniec fragmentu:   detekčná schopnosť cca 95%

-       nedáva informáciu o lokalizácii mutácie



- TGGE - Temperature Gradient Gel Elpho

*               - modifikácia DGGE (zvýšenie stringencie denaturácie                   pomocou
zvyšovania teploty)

                                                DGGE



                            DGGE: gél; gradient denaturantu smerom dolu

                          SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism

    (Orita a spol., 1989)

Teoretické východisko

-        jednovláknová DNA za nedenaturačných        podmienok vytvára terciárnu štruktúru,
stabilizovanú  vnútrovláknovými interakciami

-    mobilta ssDNA je v nedenaturačnom PAGE je funkciou terciárnej štruktúry

-    zámena báz môže viesť k zmene terciálnej štruktúry s následnou zmenou mobility

Princíp

-      separácia na základe rozdielnej terciálnej štruktúry SSDNA

Metodické prevedenie

*       Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ

*       Denaturácia fragmentov: teplota, formamid

*       PAGE (nedenaturačný gél)

                          SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism

                          SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism

*      Charakteristika:

  --   Dĺžka analyzovaných fragmentov: do 400 bp

  --   Detekčná schopnosť: <100%

    *   Fragmenty 200 bp: cca 80%

    *   Fragmenty 300 bp: cca 60%

    *   Dlhšie fragmenty: štiepiť RE

  --   Neinformuje o lokalizácii mutácie

  --   Veľmi jednoduchá, široko využívaná metóda

  --   Občas používaná aj pri diagnostike

  



                                 SSCP: gély; tri exóny jedného génu

                                         SSCP v diagnostike

                                         SSCP v diagnostike

                            REF: Restriction Endonuclease Fingerprinting

*       Teoretické východisko:

     - ide o modifikáciu SSCP

     - analyzovaný fragment sa separátne štiepi 5-6 RE (získa sa 10-12    dsDNA obsahujúcich mutáciu

     - zmenená mobilita môže byť výsledkom:

            - zmenou sekundárnej štruktúry (SSCP komponent)

            - zmenou RM (RFLP komponent)



*       Metodické prevedenie:

     - PCR generujeme fragment

     - fragment separátne štiepime RE

     - zmiešame štiepne produkty

     - SSCP elfo (nedenat. PAGE gél)
- detekčná schopnosť: veľmi vysoká; potrebujeme referenčnú vzorku       (bez mutácie)

                                      RA: Restriction Analysis

*      Teoretické východisko:

  --    RE sú vysoko špecifické

  --    mutácia: a) vytvorí nové RM

                    b) eliminuje existujúce RM

  - CpG dinukleotidy: mutačný "hot spot" (prednostne využívame RE s CpG v cieľovej sekvencii)

*      Metodický prístup:

  --    Southernova hybridizácia

  --    PCR

*      Charakteristika:

  --    dĺžka fragmentov: pri SH neobmedzná, pri PCR limitovaná PCR

  --    detekčná schopnosť pod 50%

  --    používa sa aj ako diagnostická metóda (bežná, historicky prvá)

                            ACRS: Amplification Created Restriction Site

    Rozširuje RE na prípady, keď mutácia nevytvorí ani neeliminuje RM

*      Princíp:

    pomocou PCR zavedieme do nemutovanej alely RM, ktoré je prípadnou mutáciou eliminované

*      Metodický postup:

  --    PCR s jedným upraveným primerom

  --    restrikčné štiepenie

  --    elektroforéza

  --    vizualizácia

                           ARMS: Amplification Refractory Mutation System
                                 ASA: Allele Specific Amplification

*      Princíp: mismatch PCR primeru na 3´konci znemožňuje PCR

*      Metodické prevedenie:

  --    3 primery:

    *    1 spoločný (S) - reverse primer

    *    1 špec. pre normálnu alelu (N) -- forward primer

    *    1 špec. pre mutovanú alelu (M) -- forward primer

    *    plus pár primerov pre kontrolnú PCR reakciu

    

  --    2 PCR reakcie:

                                    N N            N M            M M

    *    1. PCR S-N               +         +         -

    *    2. PCR S-M              -          +         +

                                         ARMS-PCR: princíp



                                       ARMS: populačná štúdia

                                               TaqMan
                          TaqMan špecifická sonda: "reporter" a "quencher"
                       DNA polymeráza pri PCR sondu odbúrava: reportér svieti

                                          TaqMan: priebeh

                                            TaqMan 7700



                            Celera´s sequencing center in Rockville, MD.