Molekulární patologie K. Kaňková Program o I. část: n definice molekulární patologie n funkční klasifikace mutací n rozdělení a charakteristika efektů o II. část -- příklady: n genetická analýza imunoglobulinového receptoru n molekulární patogeneze přetížení železem Patologie (=klasická patologie, patologická anatomie) o obor studující patogenezi nemocí a jejich etiologii n patogeneze nemoci = soubor dějů, které provází vznik nemoci a vývoj chorobného stavu, soubor morfologických a funkčních změn n morfologické a funkční změny nelze striktně oddělit (patologická anatomie vs. patologická fyziologie) o diagnostický obor zabývající se diagnostikou nemocí a příčin úmrtí na makro- a mikroskopické úrovni n na úrovni organismu, orgánů, tkání a buněk Metody klasické patologie Molekulární patologie o studium patogeneze (a diagnostika) nemocí na molekulární úrovni n nukleové kyseliny n proteiny o objasnění proč a jakým mechanismem vede změna sekvence DNA ke konkrétním patologickým projevům Lékařská genetika o obor zabývající se většinou monogenními (mendelisticky děděnými), vrozenými nemocemi n geny velkého účinku (1 gen = 1 nemoc) o ale např. CF cca 500 mutací!!!!!! o náplň oboru: n patogeneze n diagnostika a predikce n poradenství n screening Metody molekulární patologie Lokalizace mutací / pozice v genu o 5' UTR (promotor) n kvantitativní efekt? o exon n kvalitativní, kvantitativní efekt? o intron n kvalitativní, kvantitativní efekt? o 3' UTR n stabilita mRNA? Klasifikace mutací - strukturní o delece (1bp -- MB) o inzerce (+ duplikace) o záměny bází (ev. SNP) n missense (záměna AK) n nonsense (stop kodon) n splice site (exon/intron splicing site) o všechny typy mohou vést k posunu čtecího rámce (frameshift) Klasifikace mutací - funkční o ztráta funkce (loss-of-function) n produkt genu je nefunkční či je jeho funkce nedostatečná o získání nové funkce (gain-of-function) n produkt genu má abnormální funkci o gene dosage effect n odstupňovaný efekt podle množství produktu "Loss-of-function" mutace o recesivní fenotyp n 50% množství produktu stačí n většina vrozených chorob metabolismu o nemocní/přenašeči o celá řada DNA změn může vést k loss-of-function efektu Mechanismy vzniku "loss-of-function" efektu o delece celého genu o delece části genu o porušení struktury n translokace n inverze o inzerce do genu o porucha transkripce o promotorová mutace snižující mRNA o pokles stability mRNA o inaktivace místa sestřihu o vytvoření alternativního místa sestřihu o frameshift translace o nonsense mutace o missense mutace o porucha posttranslační modifikace o porucha celulární lokalizace o porucha parenterálního imprintingu a metylace "Gain-of-function" mutace o změna DNA, která vede k vytvoření nějaké nové kvality o dominantní fenotyp n typicky během maligní trasnformace (mutace onkogenů vs. supresorů) o dominantně negativní n nejen ztráta funkce produktu jedné alely, ale navíc blokáda funkce produktu normálního Mechanismy vzniku "gain-of-function" efektu o změna afinity k substrátu, event. vazba jiného substrátu o overexprese genu o receptor nedegradován, trvale obsazen o iontový kanál neustále otevřen [o ] expanze trinukleotidového repeatu (CAG)[n ]o strukturální abnormalita multimerických proteinů o vznik chimerického genu o neznámý "Gene dosage" mutace o týká se většinou genu, jehož produkt: n je součástí signálních nebo metabolických kaskád n soutěží s jinými během embryonálního vývoje a v metabolismu n funguje ve stochiometrickém poměru s jinými o na X-chromozom vázané nemoci n např. hemofilie o chromozmální numerické aberace Důsledky numerických aberací chromozomů o polyploidie n triploidie (69, XXX, XXY, XYY) o cca 2% početí, časný potrat o aneuploidie n gonozomální o XXX, XXY, XYY n normální očekávaná délka života, poruchy fertility o 45, X n 99% letální, jinak poruchy fertility a fyzické změny n autozomální o nulisomie (chybění páru chromozomů) n preimplantačně letální o monosomie (chybění 1 chromozomu) n embryonalně letální o trisomie (1 chromozom navíc) n až na výjimky většinou embryonálně či fetálně letální § trisomie 13 (Patauův syndrom) - časné poporodní úmrtí § trisomie 18 (Edwardův syndrom) - časné poporodní úmrtí § trisomie 21 (Downův syndrom) -- dožití cca 40 let Vztah mezi mutacemi a syndromy o klinicky jednotný syndrom: n heterogenita lokusů n alelická heterogenita Syndrom diabetes mellitus vs. jeho genetická dispozice -- příklad 1 Experimentální molekulární patologie -- příklad 2 o gen pro imunoglobulinový receptor n vazba ligandu, který je zvýšeně přítomen u nemocných n aktivace signální kaskády n kooperace s jinými receptory a enzymy SNP mapa genu pro receptor o genotyp / haplotyp n = souhrn alel na jednom chromozomu o složení heterozygoti n výsledný efekt všech záměn v cis / trans pozici?????? Co z toho vyplývá ??? o výsledky n různá frekvence mutací u nemocných a zdravých n různé frekvence kombinací genotypů (resp. haplotypů) u nemocných a zdravých o interpretace výsledků n rizikovost jednotlivých alel a celých haplotypů n rozdílné přežívání nemocných (= prognostické využití) n jiná odpověď na terapii (= farmakogenomika) Molekulární patologie přetížení železem -- příklad 3 o plynulá distrubuce hladin železa v populaci n polygenní znak o osoby s hereditární hemochroma-tózou n monogenní nemoc Regulace příjmu železa a mechanismus střevní absorpce Mutace v HFE genu Mutace / polymorfismy v kandidátních genech o souhrn všech variant vytváří polygenní kvantitativní znak = plynulou distribuci hladin železa v organizmu o homozygotní mutace C282Y v HFE genu charakteru "loss-of-function" vede k monogenní chorobě -- hereditární hemochromatóze Diagnostické využití molekulární patologie o onkologie n detekce zbytkové choroby po chemoterapii (MRD) a relapsu n zpřesnění klasifikace tumorů o chromosomální translokace, mutace onkogenů, supresorových a reparačních genů n RT-PCR detekce bcr-abl mRNA (t(9;22)) n mozaicismus po allogenní BMT o hematologie n familiarní trombofilie o Factor V Leiden, protrombin 20210A, C677T MTHFR, o mikrobiologie n detekce virů o EBV, CMV, HIV, HVB, C, ...... n detekce bakteriálních patogenů o Helicobacter pylori, Mycoplasma tuberculosis, ... o metabolismus a kardiologie n I/D ACE, MTHFR, apo(a), apoB, LDL receptor, .......... o diabetologie n HLA DB, DQ