Molekulární patologie Kateřina Kaňková Program o I. část: n definice a vymezení molekulární patologie n funkční klasifikace mutací n rozdělení a charakteristika efektů mutací o II. část -- příklady: n diagnostický a terapeutický přínos molekulární patologie o diabetes mellitus typu 1 n prediktivní význam molekulární patologie pro stanovení prognózy a plánování léčby o familiární hypercholesterolemie Definice patologie o obor studující patogenezi a etiologii nemocí n etiologie = příčina vzniku nemoci n patogeneze = soubor dějů provázejících vývoj nemoci o soubor morfologických a funkčních změn, které nelze striktně oddělit (pat. anatomie vs. fyziologie) o v klasickém pojetí rovněž diagnostický obor zabývající se diagnostikou nemocí a příčin úmrtí na makro- a mikroskopické úrovni n na úrovni organismu, orgánů, tkání a buněk Metody klasické patologie Metody molekulární patologie o objasnění proč a jakým mechanismem vede změna sekvence DNA, RNA či proteinu ke konkrétním patologickým projevům o diagnostika na molekulární úrovni n nukleové kyseliny n proteiny o PCR + RFLP, heteroduplexy, SSCP, DGGE, sekvenování o microarrays o hybridizace o RNA/real time PCR o klonovani, transfekce, mutageneze o izolace, separace proteinů, blotting, ...... o detekce apoptózy - DNA fragmentation TUNEL, ...... Lékařská genetika o obor zabývající se většinou monogenními (mendelisticky děděnými), vrozenými nemocemi n geny velkého účinku (1 gen = 1 nemoc) o ale např. CF cca 500 mutací!!!!!! o náplň oboru: n patogeneze n diagnostika a predikce n poradenství n screening Diagnostické využití mol. patologie o Onkologie a hematologie n detekce zbytkové choroby po chemoterapii (MRD) a relapsu n zpřesnění klasifikace tumorů o chromosomální translokace (RT-PCR detekce bcr-abl mRNA, t(9;22) o mutace onkogenů, supresorových a reparačních genů n mozaicismus po allogenní BMT n familiarní trombofilie o Factor V Leiden, protrombin 20210A, C677T MTHFR, o Mikrobiologie n detekce virů (EBV, CMV, HIV, HVB, C, ......) n detekce bakteriálních patogenů (Helicobacter pylori, Mycoplasma tuberculosis, ...) o Metabolismus, diabetologie a kardiologie n I/D ACE, HLA DB, DQ, MTHFR, apo(a), apoB, LDL receptor, .......... o Forenzní patologie n DNA fingerprinting n DNA profiling n paternita Klasifikace mutací - strukturní o podle mechanizmu vzniku n délkové o delece (1bp -- MB) o inzerce + duplikace o inverze o translokace n bodové mutace a SNP o missense (záměna AK) o nonsense (stop kodon) o splice site (exon/intron splicing site) o všechny typy mohou vést k posunu čtecího rámce (frameshift) Vztah lokalizace mutací vs. efekt o podle pozice v genu o 5' UTR (promotor) n kvantitativní efekt? o exony n kvalitativní, kvantitativní efekt? o introny n kvalitativní, kvantitativní efekt? o 3' UTR n stabilita mRNA? Klasifikace mutací - funkční o ztráta funkce (loss-of-function) n produkt genu je nefunkční či je jeho funkce nedostatečná o získání nové funkce (gain-of-function) n produkt genu má abnormální funkci o gene dosage effect n odstupňovaný efekt podle množství produktu "Loss-of-function" mutace o recesivní fenotyp n 50% množství produktu stačí n většina vrozených chorob metabolismu o nemocní/přenašeči o celá řada DNA změn může vést k loss-of-function efektu Mechanismy vzniku "loss-of-function" efektu o delece celého genu o delece části genu o porušení struktury n translokace n inverze o inzerce do genu o porucha transkripce o promotorová mutace snižující mRNA o pokles stability mRNA o inaktivace místa sestřihu o vytvoření alternativního místa sestřihu o frameshift translace o nonsense mutace o missense mutace o porucha posttranslační modifikace o porucha celulární lokalizace o porucha parenterálního imprintingu a metylace "Gain-of-function" mutace o změna DNA, která vede k vytvoření nějaké nové kvality o dominantní fenotyp n typicky během maligní transformace (mutace onkogenů vs. supresorů) o dominantně negativní n nejen ztráta funkce produktu jedné alely, ale navíc blokáda funkce produktu normální alely Mechanismy vzniku "gain-of-function" efektu o změna afinity k substrátu, popř. vazba jiného substrátu o overexprese genu o receptor není degradován, trvale obsazen o iontový kanál neustále otevřen [o ] expanze trinukleotidového repeatu (CAG)[n ]o strukturální abnormalita multimerických proteinů o vznik chimerického genu o neznámý "Gene dosage" mutace o týká se většinou genů, jejichž produkty: n jsou součástí signálních nebo metabolických kaskád n soutěží s jinými během embryonálního vývoje a v metabolismu n fungují ve stochiometrickém poměru s jinými o na X-chromozom vázané nemoci n např. hemofilie o chromozmální numerické aberace Numerické aberace chromozomů o polyploidie n triploidie (69 XXX, XXY, XYY) o cca 2% všech početí, časný potrat o aneuploidie n gonozomální o XXX, XXY, XYY n normální očekávaná délka života, poruchy fertility o 45, X n 99% letální, jinak poruchy fertility a fyzické změny n autozomální o nulisomie (chybění páru chromozomů) n preimplantačně letální o monosomie (chybění 1 chromozomu) n embryonalně letální o trisomie (1 chromozom navíc) n až na výjimky většinou embryonálně či fetálně letální § trisomie 13 (Patauův syndrom) - časné poporodní úmrtí § trisomie 18 (Edwardův syndrom) - časné poporodní úmrtí § trisomie 21 (Downův syndrom) -- dožití cca 40 let Molekulární patologie T1DM -- příklad 1 o onemocnění je důsledkem absolutního deficitu inzulinu o v důsledku zničení b-buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní o destrukce je způsobena autoimunitním procesem u geneticky predisponovaných osob za významné spoluúčasti faktorů zevního prostředí o autoimunitní proces je vysoce specifický a zasahuje pouze b-buňky Etiopatogeneze T1DM n hyperglykémie, ketoacidóza, event. koma n porušená glukózová tolerance n virová infekce, dieta, stres n autoimunitní proces -- pozitivita protilátek GADA, ICA, IAA n Th1-zprostředkovaná cytotoxicita n familiární výskyt, konkordance u dvojčat - genetická dispozice Genetická dispozice o IDDM1 n chromozom 6p21 -- oblast MHC o cca 3.5MB, cca 200 genů o II. třída (HLA-D) n rizikové haplotypy DR3-DQ2 a DR4-DQ8 o nejvyšší riziko heterozygotní genotyp DR3-DQ2/DR4-DQ8 n protektivní haplotyp DQ6.2 o IDDM2 n chromozomu 11p15 - gen pro inzulin n minisatelitní polymorfizmus (VNTR -- variabilní počet tandemových 14-15 bp repeticí) v promotoru genu o 20 -- 63 repetic n rizikový !! o 64 -- 139 repetic o 140 -- 210 repetic n protektivní Role haplotypů DR3-DQ2 a DR4-DQ8 v etiopatogenezi T1DM Hyperlipoproteinemie -- příklad 2 o plynulá distribuce hladin cholesterolu v populaci n kvantitativní znak o osoby s FH n monogenní nemoc Familiární hypercholesterolemie o způsobena mutacemi v genu pro LDL receptor o popsáno více než 700 různých mutací o heterozygoti se vyskytují s frekvencí 1:500, homozygoti 1:1 mil. o z funkčního hlediska - "gene-dosage" efekt: n úplná ztráta receptoru (17% případů) n porucha transportu do pl. membrány (54%) n porucha vazby LDL n porucha internalizace receptoru po vazbě LDL n porucha uvolnění z endozomu po internalizaci a návratu do plazmatické membrány (22%)