Polymorfizmus ľudskej DNA

*      Definícia genetického polymorfizmu

*      Typy polymorfizmu DNA (SNP, RFLP, VNTR, STR, indel ...) a rozloženie po genóme

*      Metódy detekcie 

*      Mechanizmy vzniku a mutačné početnosti

*      Polymorfizmus mtDNA a Y-chrom. DNA

*      Polymorfné haplotypy a haplotypové bloky

*      Praktické využitie

                                      Genetický polymorfizmus

*      Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej dvomi diskontinuitnými variantmi v
jednej populácii, pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako 1% (arbitrálne číslo)



*      Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitnú variabilitu, polytypizmy, zriedkavé znaky (dedičné
choroby)



*      Typy polymorfizmu:

  --    morofologický

  --    funkčný

  --    serologický

  --    biochemický

  --    DNA: je najčastejší, lebo väčšina polymorfizmov DNA nemá fenotypový prejav



                                       Typy DNA polymorfizmov

*      Bodový polymorfizmus (substitúcie jednotlivých báz; SNP)

*      Variabilný počet tandem. repetícií

  --  mikrosatelity (STR)

  --  minisatelity (VNTR)

  --  makrosatelity

*      Prítomnosť/neprítomnosť sekvencie (Alu, L1 a i.) na špecifickom mieste (indel)

                     Bodový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)

                 *ĄMspI                              *ĄMspI                             *ĄMspI

5´-... A C C G G T A C A ... A T C C G G T T A G C C G G T A ...-3´

                 *Ą MspI                                           X                          *Ą
MspI

5´- ...A C C G G T A T A ... A T C  A G G T T A G C C G G T A ...-3´

                                  I....1200 bp ... I



*       Početnosť odlišností: 1 : 1200 bp; čiže v genóme cca 3 mil., t.č. registrovaných vyše 9 mil.
(1993), ale len časť je potvrdených;

*       Výskyt: intróny, nekódujúce oblasti (väčšinou žiadny fenotyp); len asi 50 000 v kódujúcich
sekvenciách génov

*       Vznik: mutácia + genetický drift; nepoznáme pôvodný stav, len nepriamo (zo sekvencie u
primátov);

*       u = 10^-7 až 10^-9 (najčastejšie v dinukl. CpG)

*       Možný dôsledok: prítomnosť/neprítomnosť restrikč. miesta (ak v rozpozn. sekvencii RE, asi
20%): vznik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)



                          Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

                              Restriction Fragment Length Polymorphism

                                   Detekcia RFLP pomocou PCR + RE

                                      Polymorfizmus typu VNTR
                                           - minisatelity

                                        VNTR -- minisatelity
                                      variabilita v populácii

                           VNTR (minisatelity) -- variabilita v populácii

                                            Minisatelity

*      Dĺžka základnej repetície >6bp

*      Počet opakovaní repetície 10 -- 100 (1000)

*      Výskyt preferenčne v telomérických oblastiach (najmä bohaté na GC páry)

^*       Odhadovaný počet: rádovo 10^3

*      Jednoduchá detekcia: Southern, PCR

*      Vznik nových alel: nehomologický c-o

^*       Mutačná frekvencia: vysoká, až 10^-2

*      Využitie: obmedzené; individuálna identifikácia

*      Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA

*      Špec. prípad: minisatelit (TTAGGG)[n] - teloméry

                                           Mikrosatelity
                                     STR: Short Tandem Repeats
                                     SSR: Short Simple Repeats

*      Dĺžka základnej repetície <6bp

*      Počet opakovaní repetície 1 -- 100

*      Výskyt rovnomerne po genóme

^*       Odhadovaný počet rádovo 10^5

*      Jednoduchá detekcia: PCR

*      Vznik nových alel: nehomologický c-o

^*       Mutačná frekvencia: nižšia ako u minisatelitov, cca 10^-3

*      Využitie: rozsiahle; individuálna identifikácia, nepriama DNA diagnostika, triangulácia
génovej mapy

*      Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA

*      Výnimka: expanzie trinukleotidov u niektorých ochorení

*      Najčastejší: "CA-repeat" (asi 50 000 x v genóme)



                                      Mikrosatelity (STR, SSR)

                                        Typy mikrosatelitov

Typy:

*      Perfektné (jednoduché)              (CA)[n

]*      Imperfektné                (CA)[n] TTT (CA)[m

*      ] Zložené                        (CA)[n] AAA (AT)[m



]V genóme:         (CA)[n] - 0,5% (najmenej 50 000)

                         (TC)[n] -- 0,2%

                         ostatné dinukl. -- takmer 0%

                         tri- a tetra: zriedkavé, ale                            najčastejšie
používané v praxi

                        

          Mikrosatelity: súčasné vyšetrenie viacerých systémov na jednom géli (multiplex)

                 Mikrosatelity: princíp detekcie pomocou kapilárovej elektroforézy 

                               Inzerčno-delečný polymorfizmus (indel)

*      Indel od 1 bp po niekoľko Mb

*      Časté: inzercie Alu, L1 -- retrotranspozícia

*      Veľmi zriedkavý jav: unikátne udalosti

*      Poznáme pôvodný stav (bez inzercie)

*      Inzercie (Alu, L1) aj do kódujúcich sekvencií: patológia

                       Typizácia Alu-inzerčného polymorfizmu na Y-chromozóme

                                        Polymorfizmus mtDNA

Polymorfizmy mtDNA:

*      Mimo D-kľučky 10x častejšie ako v gDNA

*      V rámci D-kľučky až 100x častejšie ako v gDNA

*      Žiadna rekombinácia: haplotypy; haploskupiny

*      Matrilineárna dedičnosť

*      Heteroplazmia

*      Využitie: štúdium evolúcie ľudských populácií

                                        Polymorfné haplotypy

*      Haplotyp: súbor alel na jednom chromozóme, ktoré sa len zriedka oddelia rekombináciou

*      Haplotypové bloky v ľudskom genóme: rekombinačné "cold spots"

*      Využitie: štúdium "veku" mutácií

                                     Využitie polymorfizmov DNA

Ukazovatele variability:

*      Počet známych alel (pri RFLP dve, pri VNTR až 10^2)

^*       Index heterozygozity H = Ó2 p[i] p[j] = 1 --  Óp[i]^2

*      Pravd. identity PI = 1 - Óp[i]^4 -- Ó4 p[i]^2 p[j]^2

*      Polym. information content PIC = 1 - Ó p[i]^2   - Ó2 p[i]^2 p[j]^2

Praktické využitie:

*      Identifikácia osôb/vzoriek DNA (A. Jeffreys 1985)

*      Nepriama dg. monogénnych ochorení (vysoký PIC)

*      Určovanie paternity (VNTR, STR)

*      Triangulácia génovej mapy (od RFLP až k STR)

*      SNP a multifaktoriálne ochorenia?

                                  Prenos mtDNA, Y-chromozálnej DNA
                                         a autozomálnej DNA