Genová terapie 26. 11. 2004 Julie Vašků Genová terapie * Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. * Do buněk se transferují: geny nebo jejich části nebo oligonukleotidy. * Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta * In vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus * Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu Genová terapie * Klasická genetická terapie * Je potřeba dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů s cílem: * 1. zajistit produkci látky, která chybí * 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky Genová terapie * Neklasická genová terapie * inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou * Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese * Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. * Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací. Genová terapie: typy nemocí * Infekční nemoci * Nádorová onemocnění * Nemoci imunitního systému, zejména enzymové deficience * Metabolická onemocnění Genová terapie a jiné terapeutické molekulárně genetické přístupy * Rekombinantní proteiny a "genetically engineered" vakcíny * Expresní klonování - produkty normálního genu (klonované geny) jsou exprimovány v mikroorganismech nebo u transgenních zvířat, které slouží k tvorbě velkých množství medicínsky cenných produktů * Geneticky vytvářené "engineered" protilátky- (geny pro protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické použití * Geneticky vytvářené vakcíny -především proti tumorům a infekčním agens. Všeobecné strategie genové terapie Všeobecné strategie genové terapie Všeobecné strategie genové terapie Všeobecné strategie genové terapie "Genetically engineered" protilátky a vakcíny * Uměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa) a poznají specifické antigeny asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk * Typy nemocí: * Lymfomy, leukémie, infekční nemoci, autoimunitní nemoci. * Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk (vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor). Chimerické a humanizované protilátky * Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí * Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: * chimérické V/C protilátky * CDR (complementarity determining regions) graft protilátky * Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk Plně lidské protilátky * Technologie fágového displaye: protilátky jsou tvořeny in vitro napodobováním selekční strategie imunitního systému * Transgenní myši: Transfer kvasinkových umělých chromozomů s velkými segmenty lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších embryonálních buněk. Narozené myši obsahují velmi pozoruhodnou porci lidských V genetických segmentů a jsou schopny tvořit lidské protilátky Geneticky "engineered" vakcíny * Pomocí rekombinantní technologie: * Vakcíny nukleových kyselin: * bakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor. * "gene gun" - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA Geneticky "engineered" vakcíny * Genetická modifikace antigenu -- např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity * Genetická modifikace virů- virové vektory * Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: * odstranění genů nutných pro patogenezu * expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů Technologie klasické genetické terapie * Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně * Geny mohou inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo * Inzertované geny se mohou integrovat intrachromozomálně extrachromozomálně Technologie klasické genetické terapie * Metody k zacílení nepostižených buněk: * Buněčné zabíjení, způsobené imunitním systémem- jde o podporu imunitní odpovědi namířené proti nádorovým buňkám nebo infekčním agens * Uvolnění genetických produktů z buněk na vzdáleném místě (myoblasty sekretují do krve) Genetický transfer * In vivo * Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů. * Ex vivo * Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) Principy genetického transferu * cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje * A) do chromozomu * gen se bude rozšiřovat do dalších buněk * zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) * náhodná inzerce-různá lokalizace --různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. * B) extrachromozomálně -- nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku Virové vektory * Onkoretrovirové - viry s reverzně transkriptázovou funkcí, schopné syntetizovat cDNA. * Adenovirové - mají přirozený tropismus k respiračnímu epitelu * Adeno-asociované-neobsahují virové geny-bezpečné * Herpes simplex - tropické pro CNS * Lentivirové - komplexní retroviry (HIV), které napadají makrofágy a lymfocyty. Schopné transdukce do nedělících se buněk Lipozomy * Sférické měchýřky složené ze syntetické lipidové dvojvrstvy, která se podobá biologickým membránám. * DNA je zabalena, přežívá a může být endocytózou dopravena do buněk. * Kationtové lipozomy - pozitivní náboj na lipozomech stabilizuje vazbu negativně nabité DNA na povrchy lipozomů * Aniontové lipozomy internalizují DNA * Není omezena velikost transferované DNA * Nízká účinnost transferu * Extrachromozomální inzerce Přímá injekce/ bombardování částicemi ("gene gun") * Přímá injekce do tkáně (sval-DMD). * Gene gun: DNA je navázána na povrch kovové částice a "nastřelena" * Malá účinnost transferu do buňky * Nízká hladina stabilní integrace Endocytóza řízená receptorem * DNA se váže na cílovou molekulu, která se váže na specifický buněčný receptor, což může indukovat endocytózu a transfer DNA do buňky. * Vazba DNA (s negativním nábojem) se uskutečňuje přes polylysin (s pozitivním nábojem) kovalentně vázaný na receptor (např. asialoglykoproteinový receptor na jaterních buňkách). Principy a aplikace terapie založené na inhibici genové exprese a mutační korekce in vivo * Podstata terapie spočívá ve vyřazení exprese specifických genů, která umožňuje bujení nemocných buněk (inhibice onkogenu) * Alelicky specifická inhibice genové exprese * Místně specifická mutageneze in vivo * Blokáda možná na úrovni: * DNA (blokáda transkripce) * RNA (blokáda post transkripčního processing, transportu mRNA nebo účasti mRNA na funkci ribosomů) * Proteinu (blokáda posttranslačních úprav, exportu proteinů nebo dalších kroků k funkci proteinu) Antisense oligodeoxynukleotidy * Transferovány do cytoplasmy pomocí lipozomu, potom mohou migrovat do jádra buněk pasivním transportem přes jadernou membránu. * Vážou se specificky jen na jednovláknovou NK (=antisense) --mRNA a inhibují tak expresi příslušného genu Peptidové nukleové kyseliny (PNAs) * Jsou uměle konstruované- báze NK jsou přichyceny na pseudopeptidovou kostru. Normální fosfodiesterová kostra je nahrazena polyamidovou (peptidovou) složenou z 2-aminoetyl glycinových jednotek. * PNAs jsou ve srovnání s DNA nebo RNA flexibilnější, což umožňuje stabilnější hybridizaci na DNA nebo RNA (pomocí vodíkových můstků). Jsou resistentní vůči endonukleázám. Ribozymy * Některé molekuly RNA jsou schopny snižovat aktivační energii specifických biochemických reakcí a fungují tedy jako enzymy (ribozymy) * Dvě komponenty: * Cílové rozpoznávací sekvence * Katalytická komponenta * Ribonukleáza P Látky navržené k inhibici funkce specifických polypeptidů * Intracelulární protilátky: * Oligonukleotidové aptamery --oligonukleotidy schopné vázat se na specifické místo na proteinu * Mutantní proteiny Pro léčbu mutací typu "gain of function".