Vnitrobuněčné oddíly a transport mezi nimi Buněčné kompartmenty Zajištění separace a podíl na organizaci průběhu chemických reakcí dvěma způsoby: - soustředění enzymů ke katalýze určitého sledu reakcí do jednoho proteinového komplexu (např. syntéza DNA, RNA, proteinů) - soustředění metabolických dějů do buněčných oddílů ohraničených membránou Výhody kompartmentalizace * v buňkách probíhá mnoho protichůdných chemických procesů, jejich oddělení zabrání chaosu * vytvoření chemického mikroprostředí, které je vhodné pro daný typ chemických dějů (snížení difúze substrátů, obsah iontů, pH) * oddělení potenciálně nebezpečných rozkladných dějů (hydrolytické enzymy -- lysozomy, oxidativní enzymy -- peroxizomy) * dělba práce mezi organelami Organely mají často monopol na výkon určité funkce * Endoplazmatické retikulum: syntéza složek membrán a lipidů * Lysozomy: degradace proteinů * Mitochondrie: výroba chemické energie Sekreční a endocytické dráhy * buněčné oddíly nejsou autonomní, ale slouží celé buňce: integrace, koordinace * buňka disponuje mechanismy pro transport materiálů mezi oddíly a skrze membránu, která je obklopuje * funkční propojení některých organel probíhá v logickém sledu pochodů (dráha, "pathway") * sekreční (exocytická) dráha koordinuje biosyntézu organel a zajišťuje vylučování molekul do mimobuněčného prostoru * endocytická dráha se podílí na příjmu a zpracování signálů z vnějšího prostředí Vezikulární transport * transport proteinů a lipidů mezi organelami * zajišťuje správné umístění těchto molekul uvnitř nebo vně buňky Na transportu a skládání proteinů do správné konformace se podílejí chaperony * usnadňují skládání nově syntetizovaných nebo denaturovaných proteinů * vážou hydrofobní zbytky polypeptidů, brání agregaci proteinů 2 třídy chaperonů: * Proteiny Hsp70 a jejich regulátory * Válcovité chaperoniny Hsp70 * "heat-shock proteins" * tvořeny buňkou vystavenou stresu * stabilizují částečně složené polypeptidy a napomáhají jejich správnému složení Vážou se na: -- chybně poskládané proteiny -- nově vznikající polypeptidy na ribozomech Působení chaperonů při transportu proteinů Struktura a funkce bakteriálního Hsp70 (DnaK) * N-konec: doména pro vazbu peptidu * C-konec: doména pro vazbu ATP Přítomnost ADP na DnaK napomáhá spojení DnaK s nesloženým peptidem Vazba ATP napomáhá uvolnění složeného peptidu Funkce podpůrných proteinů Hsp40 (DnaJ) a GroE * DnaJ: cytozolický protein, přináší nesložený polypeptid k DnaK a stimuluje jeho vazbu hydrolýzou ATP * GroE: stimuluje uvolnění ADP. Vázaný peptidu a GroE se uvolní po další vazbě ATP Hsp70 u savců * existuje řada proteinů s doménou J podobných DnaJ * vyhledávají specifické substráty * mají vnitřní aktivitu zajišťující výměnu nukleotidů a uvolnění peptidů (není třeba ekvivalent GroE) Hsp90 * podíl na správném skládání důležitých signálních molekul, např. receptorů pro steroidní hormony (SHR) * nejdříve se k receptoru váže Hsp70 a Hsp90 a vzniká "intermediární komplex" * Po vytěsnění Hsp70 vzniká zralý komplex Hsp90 / receptor, který udržuje receptor ve správné "otevřené" konformaci pro vazbu ligandu * navázaný ligand vytěsňuje Hsp90 a umožní translokaci komplexu do jádra Chaperoniny (Hsp60) * válcovité částice zapojené do skládání proteinů * umožňují skládání nově vznikajícím a denaturovaným proteinům tím, že jim poskytují prostor oddělený od cytoplazmy * 85% nově tvořených proteinů se skládá spontánně nebo s pomocí Hsp70, zbytek potřebuje asistenci chaperoninů Hsp70 a Hsp60 se často uplatňují postupně Chaperoniny GroEL/GroES u E. coli * podíl na post-translačním skládání vznikajících proteinů u bakterií * struktura: plášť válce (GroEL) obklopující dutinu a "poklička" (GroES) * GroEL tvoří dva kruhy složené ze sedmi podjednotek (obdobná struktura u mitochondrií -- Hsp60/Hsp10, chloroplastů -- Cpn60/Cpn10, eukaryotických chaperoninů -- TriC) Funkce chaperoninů GroES/GroEL * nesložené polypeptidy se vážou k hydrofobním zbytkům na vnitřní stěně válce GroEL * ATP se váže ke každé podjednotce jednoho z kruhů, který obklopuje polypeptid * změna konformace vedoucí k zvětšení vnitřního prostoru a k vazbě GroES * hydrolýza ATP na kruhu obklopujícím polypeptid+ vazba ATP a GroES na spodní kruh způsobí disociaci horního GroES a otevření dutiny * složený polypeptid dutinu opouští, zatímco neúplně složené intermediáty mohou znovu vázat GroEL a proces skládání opakovat U mitochondrií a chloroplastů se uplatňují systémy obdobné GroEL/ GroES Nové polypeptidy se po translokaci do organely nejprve asociují s Hsp40 a Hsp70: - schopnost skládání je zachována - zajištění přenosu polypeptidu do chaperoninového komplexu pro dokončení procesu skládání Odlišnosti ve využití systémů skládání polypeptidů u prokaryot a eukaryot Eukaryotické buňky: * tvoří větší proteiny, obsahující různé domény oddělené spojovacími oblastmi ("hinge-regions") * využívají především ko-translačního způsobu skládání proteinů s využitím systémů Hsp70/Hsp40 (dominantní úloha posttranslačních mechanismů u prokaryot) Třídění proteinů * organely se v eukaryotické buňce zvětšují a dělí * růst organel je důsledkem přidávání nových molekul lipidů a proteinů (membránových i rozpustných) * proteiny a lipidy se do organel dostávají buď přímo z cytozolu (mitochondrie, chloroplasty, peroxisomy, vnitřek jádra) nebo nepřímo přes ER (Golgiho aparát, lysozomy, endozomy, jaderná membrána) Přímý vstup proteinů do membránových organel z cytosolu * syntéza proteinů na ribozomech v cytosolu (pouze malý počet proteinů je syntetizován na ribozomech mitochondrií a chloroplastů) * import do organel je určen přítomností adresové sekvence * adresová sekvence je pořadí aminokyselin uvnitř proteinu, která určuje do jaké organely se protein má dopravit * absence adresové sekvence znamená, že protein má zůstat v cytosolu Tři mechanismy importu proteinů do membránových organel * membrána není pro hydrofilní molekuly propustná * nutný přísun energie * použití jaderných pórů (transport přes jadernou membránu) * použití proteinových translokátorů (transport do ER, mitochondrií, chloroplastů, peroxisomů) * použití transportních váčků (transport z ER) Transport jadernými póry * pór prostupuje vnější i vnitřní jadernou membránou * funguje jako selektivní branka, která aktivně přenáší specifické makromolekuly a zároveň umožňuje volnou difúzi menších molekul * transport póry je obousměrný: - z cytozolu přicházejí proteiny určené jádru - z jádra cestují molekuly RNA a ribozomální podjednotky skládané v jádře * molekuly mRNA, které nedokončily sestřih nejsou exportovány (kontrola kvality) Transport do jádra probíhá ve dvou krocích 1. krok: * nevyžaduje ATP/GTP * proteiny obsahující jadernou adresovou sekvenci se vážou k jadernému póru, ale neprocházejí jím * adresová sekvence je rozeznána cytosolickým receptorem (prototypový receptor - importin), který se váže k jadernému póru Importin má 2 podjednotky: - a importin váže jadernou adresovou sekvenci - b importin zajišťuje spojení s komplexem póru Transport do jádra probíhá ve dvou krocích 2. krok: * vyžaduje ATP nebo GTP * vlastní translokace jaderným pórem * importin a je translokován společně se substrátem * importin b se v průběhu translokace odděluje Regulace importu do jádra * jeden ze způsobů řízení aktivity jaderných proteinů * transkripční faktory fungují jen v jádře, zabránění importu jim nedovolí vykonávat svou funkci Jeden z mechanismů: * v cytoplazmě se tyto faktory spojují s regulačními proteiny, které jim pokryjí jadernou adresovou sekvenci * protein zůstává v cytoplazmě, dokud není regulační protein odstraněn Regulace NFkB * transkripční faktor * aktivuje transkripci genů pro lehké řetězce k imunoglobulinů v B lymfocytech * v nestimulovaných buňkách je NFkB vázán v komplexu s inhibičním IkB, v této formě nemůže být translokován (zamaskování adresové sekvence) * ve stimulovaných buňkách se IkB fosforyluje a následně degraduje proteolýzou (ubiquitin/proteazom), NFkB je translokován do jádra, aktivace transkripce Regulace SWI5 * transkripční faktor u kvasinek * translokace je přímo řízena fosforylací * SWI5 je translokován do jádra jen v určité fázi cyklu, kdy je defosforylován * po zbytek cyklu zůstává v cytoplazmě ve fosforylované formě * fosforylace nastává na aminokyselinových zbytcích v těsné blízkosti adresové sekvence Export RNA z jádra * rRNA, tRNA, mRNA vzniká v jádře, ale pro expresi genetické informace je nutná jejich přítomnost cytoplazmě * využívá jaderných pórů * translokace membránou probíhá v komplexu s proteiny * nutná energie Export RNA z jádra * pre-mRNA a mRNA se spojuje s alespoň dvaceti proteiny (vzniká hnRNP) * alespoň 1 z těchto proteinů obsahuje adresovou sekvenci pro export z jádra * v jadérku vytváří rRNA spolu s ribozomálními proteiny komplexy * do cytoplazmy jsou transportovány intaktní ribozomální podjednotky Transport snRNA * funguje v jádře * účast na sestřihu * transport z jádra do cytoplazmy * spojení s příslušnými proteiny (vznik funkčních komplexů) * návrat do jádra Transport snRNA Proteinové translokátory * umístěny v membráně, kde slouží pro přenos proteinů * přenášený protein se musí rozvinout, aby se mohl protáhnout membránou * fungují i u bakterií Import proteinů do mitochondrií * nutný, protože mitochondriální genom nekóduje proteiny pro replikaci DNA, transkripci nebo translaci ani pro oxidativní fosforylaci * tyto proteiny se dostávají do mitochondrií jako úplné polypeptidové řetězce * probíhá buď přes jednu membránu do mezimembránového prostoru nebo do mitochondriální matrix přes obě membrány Transport do mitochondriální matrix * protein je nasměrován do mitochondrií N-koncovou sekvencí 15 - 35 AA (presekvence) * presekvence se proteolyticky odstraňuje po dokončení transportu do mitochondrie Průběh translokace do mitochondrií 1. rozeznání adresových sekvencí (presekvencí) receptory, které proteiny nasměrují k povrchu mitochondrií 2. začlenění presekvencí do proteinového komplexu, který řídí translokaci vnější membránou 3. alespoň částečné rozbalení proteinů (účast cytosolických chaperonů rodiny Hsp70) 4. rozbalené řetězce procházejí vnější i vnitřní membránou v místech jejich těsného kontaktu 5. translokace vnitřní membránou vyžaduje přítomnost elektrochemického gradientu 6. odštěpení adresové sekvence (presekvence) matrixovou proteázou 7. mitochondriální Hsp70 váže translokující řetězec na vnitřní straně membrány a napomáhá dokončení translokace 8. mitochondriáloní Hsp60 napomáhá složení polypeptidového řetězce uvnitř mitochondrie 9. Průchod vnější i vnitřní membránou vyžaduje ATP Translokace do mezimembránového prostoru (konzervativní model) * proteiny obsahují pozitivně nabitou adresovou sekvenci následovanou hydrofobní signální sekvencí * adresová sekvence směruje protein do matrix * odstranění adresové sekvence v matrix obnaží hydrofobní signální sekvenci * protein směřuje zpět přes vnitřní membránu * hydrofobní signální sekvence je průběhu translokace odstraněna Translokace do mezimembránového prostoru (nekonzervativní modely) Nedochází k importu do matrix 3 možné mechanismy: * Přímá translokace vnější membránou do mezimembránového prostoru (cytochrom c) * Přímá translokace vnější membránou následovaná začleněním proteinu do vnitřní membrány * Prostřednictvím sekvence zastavující přenos ("stop-transfer sequence") je translokace vnitřní membránou zastavena a protein je odštěpen do mezimembránového prostoru Transport do chloroplastů * většina chloroplastových proteinů je syntetizována v cytoplazmě a následně transportována do chloroplastů v podobě hotových polypeptidů * adresovou sekvenci tvoří 30-100 AA na N-konci, které jsou odštěpeny po dokončení translokace * požadavek rozvinutí peptidů (účast chaperonů na obou stranách membrány a energie) * adresové sekvence nejsou positivně nabité * není požadován elektrický potenciál napříč membránou Import proteinů do lumenu thylakoidů 1. import do stromatu 2. odštěpení adresové sekvence: obnažení hydrofobní signální sekvence 3.translokace přes thylakoidní membránu