Endoplazmatické retikulum * cytoplazmatický systém membránově uzavřených tubulů a váčků, který je odvozen od jaderné membrány * největší organela většiny eukaryotických buněk (10% celkového objemu) * tvoří přibližně polovinu všech buněčných membrán Hladké ER * není spojeno s ribozomy, účast v metabolizmu lipidů a uhlovodíkových řetězců * detoxifikační reakce * katabolismus glykogenu * zásobárna Ca Hrubé ER * na vnějším povrchu pokryto ribozomy, které syntetizují sekreční proteiny a proteiny pro lysozomy, ER, Golgiho aparát a plazmatickou membránu ER se podílí na struktuře proteinů a lipidů * skládání proteinů * tvorba disulfidických vazeb * tvorba vícepodjednotkových proteinů * prvotní místo, ve kterém se k proteinům připojují uhlovodíkové řetězce * místo syntézy membránových lipidů Sekvence AA vznikajícího proteinu rozhoduje o vazbě ribozomu na ER * volné a membránově vázané ribozomy jsou funkčně nerozlišitelné * syntéza všech proteinů je zahájena na volných ribozomech * signální sekvence na N-konci vznikajícího polypeptidu přitahuje ribozom na ER * signální sekvenci reprezentuje krátký úsek hydrofobních AA, který se odštěpuje během přenosu polypeptidu do lumen ER Mechanismus transportu proteinů do ER * při translaci na ribozomu vzniká polypeptidový řetězec se signální sekvencí na N-konci * signální sekvence je rozeznána a navázána SRP * vazba SRP dočasně zastaví pokračování translace Mechanismus transportu proteinů do ER * SRP zajistí přenos komplexu SRP/ribozom/polypeptidový řetězec na SRP-receptor a tím jej dopraví k hrubému ER * ribozom je vázán k translokačnímu komplexu na membráně ER * signální sekvence se začlení do membránového kanálku (nutný GTP) Mechanismus transportu proteinů do ER * SRP se uvolní z komplexu a translace může pokračovat, rostoucí řetězec prochází membránou do ER * signální sekvence je odštěpena signální peptidázou, peptid se uvolní do lumen ER Začlenění proteinů do membrány ER * probíhá u membránových proteinů ER, Golgiho aparátu, lysozomů a plazmatické membrány * proteiny jsou v membránách ukotveny hydrofobními oblastmi, které prostupují fosfolipidovou dvouvrstvou v podobě šroubovice o velikosti 20 -- 25 AA * šroubovice je stabilizována vodíkovými můstky mezi peptidovými vazbami a interakcemi hydrofobních AA zbytků s membránovými fosfolipidy * membránové proteiny mohou procházet membránou v různých orientacích a vícenásobně Orientace proteinů v membráně ER vytvořená během jejich syntézy se udržuje při jejich transportu do membrán Golgiho aparátu, lysozomů a plazmatické membrány Syntéza transmembránových proteinů s C-konci orientovanými do cytozolu * N-koncová signální sekvence odštěpena signální peptidázou během translokace do ER * upevnění v membráně zajistí transmembránová šroubovice ve středové části proteinu (sekvence zastavující přenos), která brání pokračování translokace do ER * uvolnění ribozomu z translokačního aparátu * dokončení syntézy C-koncové části polypeptidového řetězce v cytozolu Syntéza transmembránových proteinů s C-konci orientovanými do cytozolu Vnitřní signální sekvence * ukotvují proteiny v membráně ER * nejsou štěpeny signální peptidázou * jsou rozeznány SRP, proto mohou zajistit přenos membránou * jejich orientace určuje, zda membránou bude přecházet N- nebo C-konec proteinu Vznik proteinů, které procházejí membránou několikrát důsledek střídání vnitřních signálních sekvencí a sekvencí zastavujících přenos Hladké ER a syntéza lipidů * ER je hlavní místo syntézy membránových lipidů * chemická povaha lipidů vyžaduje, aby jejich syntéza probíhala ve spojení s již existujícími membránami Tři hlavní typy membránových lipidů * fosfolipidy * glykolipidy * cholesterol Fosfolipidy * hlavní strukturní složky membrán * syntéza probíhá na cytozolické straně membrány ER * odvozeny z glycerolu a mastných kyselin nesených koenzymem A * vzniklá kyselina fosfatidová se začleňuje svými řetězci mastných kyselin do membrány * enzymy na cytozolické straně membrány ER zajistí další konverze fosfatidové kyseliny Translokace fosfolipidů přes membránu ER * nové fosfolipidy se začleňují jen do cytozolické poloviny membrány ER * pro zajištění stability membrány musí dojít k přesunu některých fosfolipidů do druhé poloviny membrány ER směřující k lumenu * transport je energeticky nevýhodný (nutný přechod polárních hlaviček membránou), neprobíhá spontánně * účast speciálních enzymů (flipázy) Translokace nových fosfolipidů membránou ER Vezikulární transport z ER * do Golgiho aparátu, lysozomů, plazmatické membrány, mimo buňku * probíhá nepřetržitě pučením a fúzí transportních váčků, které nesou přepravované proteiny nebo lipidy * komunikace s vnějším prostředím * přepravované proteiny a lipidy jsou chemicky upravovány (glykosylace, vytváření disulfidových můstků) Transport proteinů z ER do Golgiho aparátu Existují ale také proteiny, které jsou specifické pro ER (chaperony, signální peptidáza, atd.) * opouštějí sekreční dráhu na 1. křižovatce * na C-konci nesou adresovou sekvenci Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) pro lumen ER * odstranění sekvence KDEL způsobí, že protein pokračuje sekreční drahou do Golgiho aparátu a posléze je vyloučen z buňky Proteiny ER se dočasně objevují v Golgiho aparátu * adresová sekvence KDEL nezabrání transportu proteinů z ER do Golgiho aparátu * označené proteiny z Golgiho aparátu putují zpět do ER Golgiho aparát * organela, ve které se zpracovávají, třídí a modifikují proteiny přijaté z ER * glykosylace proteinů (tj. přidání uhlovodíkových řetězců) * syntéza glykolipidů a sfingomyelinu * u rostlinných buněk místo syntézy polysacharidů buněčné stěny Transport z Golgiho aparátu * zajištěn systémem pučení váčků * označené proteiny směřují přes lysozomy ven z buňky nebo se vracejí do ER * proteiny Golgiho aparátu jej krátce opouštějí a zpět se do něj vracejí Řízená sekrece z buňky * zajišťuje uvolnění přenášené molekuly z buňky jen pro přijetí určitého signálu * transportní váčky se mění na větší sekreční váčky, obsahující přenášenou molekulu * přijetí signálu vyvolá exocytózu * běžné u žlaznatých buněk * konstitutivní sekrece probíhá průběžně (bez závislosti na signálu) Principy specifického vezikulárního transportu - váček musí nakládat jen proteiny určené pro příslušnou cílovou stanici - váček musí fúzovat jen s vhodnou cílovou membránou - existence různých typů transportních váčků pro transport specifického nákladu, které vykonávají kyvadlovou dopravu mezi organelami Proteinový obal váčků napomáhá pučení * váčky, které pučí z membrány, mají na své cytozolové straně často specifický proteinový plásť (opláštěné váčky) * po ukončení pučení je plášť odstraněn (membrána váčku může fúzovat s cílovou membránou) * existuje několik druhů opláštěných váčků s typickými proteinovými obaly Funkce proteinového obalu váčků Selektivní transport klathrinovými váčky * z membrány se váček začíná oddělovat jako jamka s klathrinovým pláštěm * vazbu klathrinu k membráně zajišťují adaptiny * adaptiny spolu s receptory zodpovídají za typ molekul, které mají být do váčků začleněny Selektivní transport klathrinovými váčky Začlenění specifických proteinů do klathrinových váčků * proteiny určené pro transport z Golgiho aparátu do lysozomů jsou označeny přítomností manoso-6P * prostřednictvím manoso--6P se tyto proteiny vážou k receptorům pro manoso-6P, které procházejí membránou v oblasti trans Golgiho aparátu * k receptorům pro manoso-6P se vážou cytozolické adaptiny, ke kterým se váže klathrin * klathriny se skládají ze 3 polypetidových řetězců * spojením těchto řetězců vzniká síť, která narušuje membránu a zahajuje pučení Váčky COP * COP = "coat protein" * zapojeny do přepravy molekul mezi ER a Golgiho aparátem a mezi jednotlivými částmi Golgiho aparátu * pro pučení nutná účast proteinu ARF ARF * ADP-ribosylation factor * váže GTP nebo GDP * komplex ARF-GTP se spojuje s membránou Golgiho aparátu, je nutný pro vazbu COP a podílí se na tvorbě váčků * komplex ARF-GDP způsobuje rozložení COP po dokončení pučení a před fúzí s cílovou membránou Fúze váčků * transportní váčky mají na svém povrchu molekulární značky, které svědčí o původu váčku a jeho nákladu * tyto značky musí být rozeznány receptory na cílových membránách * specifita navádění váčků k cílům závisí na proteinech SNARE Proteiny SNARE * Soluble N-ethylmaleimid-sensitive fusion-protein attachment-protein receptor * SNARE proteiny na povrchu váčků (v-SNARE) jsou specificky rozeznány proteiny SNARE na povrchu cílových membrán (t-SNARE) * každá organela a každý typ transportních váčků nese unikátní proteiny SNARE * interakce mezi komplementárními proteiny SNARE zajišťují specifickou vazbu váčků s cílovými membránami * za vlastní fúzi zodpovídá interakce proteinů NSF a SNAP Lysozomy * organely, které obsahují enzymy schopné rozložit všechny typy biologických makromolekul (proteiny, nukleové kyseliny, uhlovodíky, lipidy) * fungují jako buněčný trávicí systém * rozkládají materiál přijatý z vnějšího prostředí i vlastní nitrobuněčné struktury určené k rozkladu * velká variabilita ve velikosti (důsledek přítomnosti různorodého tráveného materiálu) Lysozomální enzymy * asi 50 různých enzymů, které fungujíjako kyselé hydrolázy s optimem pH cca 5 * kyselé pH uvnitř lysozomu zajišťují ATP-dependentní H^+ pumpy * produkty rozkladu jsou přenášeny do cytozolu * je známo více než 30 různých genetických chorob člověka, které jsou důsledkem mutací v genech lysozomálních enzymů: nerozložený materiál se v lysozomech hromadí Gaucherova nemoc * důsledek mutace v genu kódujícím lysozomální enzym, který je nutný pro rozklad glykolipidů (glukocerebrosidáza) * zvětšení velikosti a počtu lysozomů s nedegradovaným materiálem * terapie je založena na podávání chybějícího enzymu * kandidát pro genovou terapii (začlenění cDNA kódující daný enzym do kostní dřeně) Gaucherova nemoc - projevy Typ I: * není zasažen nervový systém * zvětšení sleziny, jater, poruchy struktury kostí * neohrožuje život člověka Typ II: * nervový systém je zasažen, poruchy jsou zřejmé od raného dětství, pacienti umírají velmi brzy Typ III: * nervový systém je zasažen (demence), poruchy se začnou projevovat přibližně od 10. roku věku Tvorba lysozomů * fúzí transportních váčků vzniklých pučením z Golgiho aparátu s pozdními endozomy, tj. váčky vzniklé endocytózou plazmatické membrány * enzymy jsou syntetizovány ribozomy hrubého ER a do lysozomů se přenášejí přes Golgiho aparát * lysozomy představují křižovatku mezi sekreční drahou a endocytickou drahou Zrání lysozomů * endocytózou vzniká váček, který fúzuje s raným endozomem * recyklace složek plazmatické membrány * raný endozom zraje do podoby pozdního endozomu * fúzí pozdního endozomu s transportními váčky z Golgiho aparátu (nesou kyselé hydrolázy) vzniká aktivní lysozom * při zrání lysozomu dochází k snižování pH až na úroveň 5,5 Všechny lysozomální enzymy jsou kyselé hydrolázy * jsou aktivní jen při kyselém pH (v lysozomech) a ne při neutrálních podmínkách (zbytek cytoplazmy) -- ochrana před nežádoucím rozkladem vlastních struktur * kyselé pH v lysozomech udržují membránové protonové ATPázy, které do lysozomu přenášejí protony z cytozolu za spotřeby energie ATP * většina proteinů lysozomální membrány je značně glykosylována: ochrana před natrávením lysozomálními proteázami Endocytické dráhy * způsob příjmu kapaliny spolu s molekulami z vnějšího prostředí * pro malé molekuly využívají všechny eukaryotické buňky * příjem velkých částic nebo celých buněk zajišťují specializované fagocytické buňky Průběh endocytózy * obklopení pohlcovaného materiálu plazmatickou membránou * pučení membrány dovnitř buňky spolu s pohlcovaným materiálem * odškrcení membrány a vznik vnitrobuněčného endocytického váčku * předání pohlceného materiálu lysozomům, kde je stráven Dvy typy endocytózy * Pinocytóza (buněčné pití): pohlcování kapaliny a molekul prostřednictvím malých váčků (max. průměr 150 nm) * Fagocytóza (buněčné pojídání): trávení velkých částic, např. mikroorganismů a zbytků buněk prostřednictvím velkých váčků zvaných fagozomy (průměr obvykle větší než 250 nm) Průběh fagocytózy * vazba cizorodé částice k povrchu fagocytické buňky * aktivace povrchového receptoru * vytváření listovitých výběžků plazmatické membrány -- pseudopodia (účast aktinových složek cytoskeletu) * výběžky částici obklopí a fúzí koncových částí membrán vzniká fagozom * uvnitř buňky fagozom fúzuje s lysozomem za vzniku fagolysozomu, ve kterých je pohlcený materiál rozložen kyselými lysozomálními hydrolázami Autofagie * postupný rozklad vlastních složek buňky * patrná v hladovějících buňkách (zoufalý pokus získat energii potřebnou pro zbytek buňky) * částice určená k rozkladu je nejdříve uzavřena v membráně vychlípené z ER -- vzniká autofagozom * autofagozom fúzuje s lysozomem a částice je rozložena Pinocytóza * průběžné pohlcování části plazmatické membrány * tvorba pinocytotických váčků, které jsou později vráceny k buněčnému povrchu * makrofág pohlcuje 3% své plazmatické membrány každou minutu (celou během půl hodiny) * využívá klathrinových jamek a váčků, které fúzují s endozomy * je neutrální, nerozlišuje přijímané materiály Endocytóza zprostředkovaná receptory * mechanismus pro selektivní zvyšování koncentrace určitých látek v buňce * přijímané molekuly se vážou k příslušným receptorům na buněčném povrchu * komplexy molekula/receptor vstupují do buňky v klathrinových váčcích * příkladem je příjem cholesterolu Endocytóza cholesterolu Cholesterol * nutný pro tvorbu membrán * nerozpustný ve vodě, v krevním řečišti je přenášen proteinovými nosiči (lipoproteiny s nízkou hustotou, LDL) * LDL se vážou na receptory umístěné na povrchu buněk * komplexy LDL s receptory jsou pohlceny klathrinovou endocytózou a dodány endozomům * v kyselém prostřední se LDL uvolní z receptoru * receptory jsou transportními váčky dodány zpět do plazmatické membrány Poruchy příjmu cholesterolu * důsledek poruchy struktury LDL-receptoru * buňky nepřijímají cholesterol * cholesterol se hromadí v krvi a předurčuje postižené jedince k vývinu atherosklerózy * většina pacientů umírá v raném věku na srdeční záchvat (důsledek ucpání tepen zásobujících srdce)