Význam apoptózy Nežádoucí procesy spojené s apoptózou * přílišná apoptóza poškozuje tkáně (degenerativní procesy) * nedostatečná apoptóza buňky predisponuje k hromadění genetických poruch a tvorbě nádorů Apoptóza -- charakteristika * obvyklá při organogenezi a nedostatku růstových faktorů * fyziologické odstranění nežádoucích buněk (např. buňky poškozené nebo infikované) bez rizika pro buňky sousední * opak nekrózy (následek poranění, kdy buňky prasknou, vylijí svůj obsah do okolí a způsobí tak zánět) Fragmentace chromatinu Detekce apoptózy * barvení kondenzovaných jader fluorescenčními barvivy (např. Hoechst. DAPI) * barvení fosfatidyl-serinu, který apoptotické buňky vystavují na svém povrchu, anexinem V * detekce fragmentované DNA technikou TUNEL nebo elektroforézou * měření potenciálu mitochondriální membrány Návaznost procesů spojených v buňce s apoptózou Dvě hlavní nitrobuněčné dráhy indukující apoptózu Hlavní složky apoptotické dráhy * BCL-2 * Apaf-1 * kaspázy V apoptotické signalizaci se uplatňují tři skupiny proteinů: Ced u C. elegans * geny ced ("cell death defective genes") * mutace genů ced ovlivňují osud 131 buněk, které by normálně měly zemřít * hlavní kategorie genů ced: -- geny s regulační funkcí (ced 3, ced 9, ced 4) -- geny efektorové (výkonná funkce) (ostatní ceds) Kaspázy Kaspázy -- skupina 1 Kaspázy -- skupina 2 Regulátory apoptózy -- Apaf-1 * "apoptotic protease activating factor" * spolu s cytochromem c a za přítomnosti ATP zodpovídá za zpracování a dozrávání pro-kaspázy 9 Regulátory apoptózy -- rodina BCL-2 * skupina proteinů s pro- nebo anti-apoptotickou funkcí * rovnováha opačně působících faktorů rozhoduje o osudu buňky při reakci na stres nebo poškození DNA * evoluční konzervativnost * pro-apoptotické členy rodiny BCL-2 zvyšují nitrobuněčnou hladinu cytochromu c * spojeny s membránami, především mitochondriálními * 18 členů, strukturní příbuznost (obsahují alespoň 1 ze čtyř známých šroubovicových domén BH (BCL-homology, BH1-BH4) * domény BH umožňují tvorbu homodimerů / heterodimerů a vzájemnou regulaci [* ] pro-apoptotické proteiny BAX, BAD, BID, BIK a BIM obsahují šroubovicovou doménu smrti ("death domain"), která zapadá do hydrofóbní kapsy ve struktuře anti-apoptotických proteinů BCL-2 a BCL-X[L] . Cytochrom c * spolu s Apaf-1 a dATP nutný faktor pro aktivaci kaspáz * jakmile se cytochrom c objeví v cytozolu (řízeno Bcl-2), váže se na Apaf-1 (homolog Ced-4) * Apaf mění konformaci a oligomerizuje * za přítomnosti dATP komplex cytochrom c/Apaf-1 váže a aktivuje prokaspázu 9 ("apoptozom") * aktivovaná kaspáza 9 aktivuje další kaspázy zodpovídající za apoptotickou smrt buňky (kaspázy 3 nebo 7) Faktory řídící aktivitu BCL-2 * cytozolické proteiny * během apoptózy translokují do mitochondrií * vážou a ovlivňují aktivitu BCL2 nebo přímo řídí uvolňování cytochromu c Bid * pro-apoptotický protein, štěpen kaspázou 8 * C-koncový fragment tBid přechází do mitochondrií, kde aktivuje pro-apoptotiký Bax: uvolnění cytochromu c Bad * za přítomnosti růstových faktorů se Bad fosforyluje kinázami Akt, MAPK, PKA, MAPKK (RsKs) nebo p21-activated kinase 1 (PAK) * fosforylovaný Bad váže 14-3-3, který zajistí jeho lokalizaci v cytozolu (apoptóza nenastává) [* ] při nedostatku růstových faktorů je Bad defosforylován Ca^2+-senzitivní fosfatázou (kalcineurin) nebo protein fosfatázou 1 a, přechází do mitochondrií, kde váže BCL-X[L * ] Bad vytěsňuje BCL-X[L] z heterodimerů Bax-BCL-X[L]: vznikají homodimery Bax, které zajistí uvolnění cytochromu c: apoptóza Bax * přijetí signálu smrti: pro-apoptotický Bax přechází z cytozolu do mitochondrie * změna konformace Bax: oligomerizace a začlenění do vnější mitochondriální membrány * rychle následuje uvolnění cytochromu c [* ] tyto děje jsou podporovány Bid (tBid) a inhibovány BCL-2/BCL-X[L ] Apoptóza zprostředkovaná proteinem p53 * p53 řídí buněčnou proliferaci a apoptózu * poškození DNA, nedostatek růstových faktorů, exprese myc nebo E1A mohou indukovat apoptózu zprostředkovanou p53 * protein p53 se podílí na uvolnění cytochromu c z mitochondrií a následnou aktivaci kaspáz 9 a 3 Apoptóza vyvolaná perforinem a granzymem B * oba proteiny jsou uvolňovány cytotoxickými T buňkami * Perforin: tvorba transmembránových pórů, průnik granzymu do buňky * Granzym B: - štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3) -- - štěpení inhibitoru ICAD DNázy CAD Rakovinné buňky se neřídí regulačními signály pro buněčnou smrt * zdravé buňky mohou žít jen za přítomnosti růstových faktorů, jinak odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i bez růstových faktorů * zdravé buňky s poškozenou DNA odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i s poškozenou DNA * rezistence k apoptóze je jedním z důvodů prodloužené životaschopnosti nádorových buněk Apoptóza a nádory