Degradace buněčných proteinů * vedle ovlivňování účinnosti tvorby - hlavní způsob regulace hladiny proteinů v buňce * komplexní a přísně regulovaný proces, který významně ovlivňuje řadu buněčných procesů * zajištěna kaskádou enzymatických reakcí (substrátová specifita) Význam degradace proteinů Regulace mnoha životně důležitých procesů: - buněčný cyklus a růst - diferenciace a vývoj - odpověď na stresové a mimobuněčné faktory - povrchových receptorů, iontových kanálků - DNA reparace - imunitní a zánětlivé rekce - biogeneze organel - apoptóza Buněčná proteolýza probíhá ve dvou kompartmentech 1) lysozomální proteolýza: * 10 % celkové proteolytické aktivity buňky * substráty jsou většinou membránové nebo extracelulární proteiny přijaté endocytózou * hlavním degradačním prvkem jsou kyselé proteázy (katepsiny) 2) cytozolická proteolýza * substráty jsou zejména cytozolické regulační proteiny (cykliny, nádorové supresory, nově potvrzeno též pro membránové a extracelulární proteiny, které jsou dopraveny do cytozolu) * hlavními degradačními prvky jsou kalpainy, Ca-dependentní proteázy a hlavně proteazom * proteazom je konečným článkem ubiquitinační dráhy Významné cíle proteazomové degradace * regulátory buněčného cyklu a růstu * složky buněčných signálních kaskád * enzymy, které napomáhají udržovat životní funkce buňky ("house-keeping genes") * enzymy zapojené do metabolických reakcí * varianty proteinů vytvořené v důsledku mutace nebo defektní proteosyntézy * antigeny hlavního histokompatibilitního komplexu třídy I Ubiquitin * 76 aminokyselinových zbytků * evoluční konzervativnost * vyskytuje se ve všech tkáních všech eukaryotických organismů * v buňce buď volná molekula nebo kovalentně připojená k jiným proteinům Ubiquitin * má funkci markeru, který označuje cytozolické nebo jaderné proteiny určené k rychlé proteolýze * váže se k aminoskupině lyzinu cílového proteinu * vazbou dalších molekul ubiquitinu vzniká polyubiquitinový řetězec * proteiny označené polyubiquitinem jsou rozeznány a degradovány proteazomem Ubiquitin má široké spektrum cílových molekul * poškozené a chybně složené proteiny * transkripční faktory * regulátory růstu * přenašeče signálů * regulátory buněčného cyklu * nádorové supresory a onkoproteiny * enzymy * virové proteiny * membránové receptory Ubiquitinační dráha - princip * specifické vyhledání proteinu v závislosti na buněčném cyklu, diferenciačním stadiu buňky, atd. * označení tohoto substrátu kovalentním připojením několika molekul ubiquitinu * degradace tohoto substrátu proteazomem 26S * uvolnění ubiquitinu a jeho využití při dalším degradačním cyklu Připojení ubiquitinu k cílové molekule probíhá ve třech krocích * aktivace Ub připojením ubiquitin aktivujícího enzymu E1 * přenos Ub z E1 na ubiquitinovou protein ligázu E3 prostřednictvím některého z přenašečů (Ub-konjugujících enzymů) E2 * k E3 se specificky váže substrátový protein * E3 katalyzuje kovalentní připojení Ub k substrátu (obvykle ke zbytku lysinu izopeptidovou vazbou) * v dalších reakcích se k modifikovanému substrátu ve stejném místě vážou další molekuly Ub: vzniká polyubiquitinový řetězec Proteiny s navázaným Ub podléhají degradaci na proteazomu * vazba poly-Ub substrátu k Ub-receptorové podjednotce proteazomu a degradace substrátu * recyklování Ub prostřednictvím izopeptidáz Ubiquitinace "step-by-step" Podstata vysoké přesnosti degradace * substráty jsou rozeznávány různými E3 * substráty musí být určitým způsobem modifikovány, aby mohly být rozeznány E3 (fosforylace, spojení s jinými proteiny, např. chaperony) Proteazom 26S * ATP-dependentní komplex proteáz * katalyzuje rozvolnění a proteolýzu svých substrátů * složen z katalytického komplexu 20S, který je obklopen dvěma regulačními komplexy 19S Kompartmentalizace je důležitá pro správnou funkci proteazomu * vysoká koncentrace aktivních míst zajišťuje velmi účinnou degradaci proteinů * degradace probíhá jen ve vymezeném prostoru Cena za tento luxus: * substráty musí být rozvolněny a translokovány, aby se dostaly k aktivním místům proteazomu (energetické nároky, zajištěno podjednotkami 19S) 3 typy aktivních míst v podjednotce 20S proteazomu - trypsinová - chymotrypsinová - post-glutamyl peptidyl hydrolytická Podjednotky 19S proteazomu Složeny z 15-20 jednotek: * ATPázy (t1-t6) tvoří základnu * Jednotky bez ATPázové aktivity (n1-n12) tvoří poklop Deubiquitinační enzymy * cysteinové proteázy * odstranění Ub z proteinů Patří do jedné ze dvou rodin: * UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase) * UBP (ubiquitin processing protease) Význam: * tvorba volného Ub z polyUb řetězců (recyklace) * odstranění Ub z cílových proteinů * čištění proteazomu od zbytků peptidů SUMO-1 (sentrin) * protein podobný ubiquitinu (small ubiquitin-related modifier-1) * kovalentně připojen k cílovým proteinům * základní rysy ubiquitinové dráhy platí i pro SUMO-1: - aktivován ATP-dependentním enzymem - aktivovaná varianta SUMO-1 se přenáší na Ubc9 (ekvivalent E2) - SUMO-1-Ubc9 rozeznává substrát: přenos SUMO-1 na lysinový zbytek cílového proteinu Význam modifikace proteinů "sumoylací" ochrana proteinů před ubiquitinací a následnou degradací (např. stabilizace IkB ) NFkB/IkB * NFkB je důležitý transkripční faktor * aktivace NFkB je podmíněna degradací svého inhibitoru IkB * autoregulace: - NFkB indukuje transkripci genu IkB - protein IkB se přechodně hromadí v jádře a tlumí NFkB-dependentní transkripci Funkce IkB: transport komplexu NFkB/ IkB do cytoplazmy (transkripčně aktivační funkce NFkB se v cytoplazmě neuplatní) Hladina IkB v buňce je určena mírou jeho degradace. Aktivace NFkB * signál zachycen na buněčném povrchu - aktivace IkB kináz IKK * fosforylace IkB (Ser 32 a Ser 36) * fosforylovaná molekula IkB je substrátem pro ubiquitinaci * molekula IkB s navázaným polyubiquitinovým řetězcem je degradována proteazomem * molekula NFkB zbavená IkB se translokuje do jádra a indukuje transkripci svých cílových genů * molekula IkB opatřená SUMO-1 nepodléhá modifikaci ubiquitinem a nemůže být proto degradována - transkripce řízená NFkB zastavena p53 * ochrana genomu před poškozením * transkripční faktor, který ovlivňuje buněčnou proliferaci a apoptózu * hladina p53 je řízena ubiquitinovou degradační drahou * v normálních buňkách je p53 konstitutivně ubiquitinován Mdm2 ubiquitin ligázou * stresové signály aktivují p53 tím, že inhibují jeho degradaci AP-1 ("activator protein 1") * transkripční faktor složen z dvojice členů proteinových rodin Fos a Jun * zprostředkovává reakce na vnější signály zajištěním indukce genů zapojených do řízení buněčného cyklu, diferenciace, transformace a apoptózy * hladiny proteinů Fos a Jun v buňce jsou určeny mírou degradace ubiquitinovou dahou * existují onkoproteiny v-Jun a v-Fos, které postrádají domény podléhající modifikaci ubiquitinem - proteiny jsou mnohem stabilnější E2F * transkripční faktor, který hraje klíčovou roli v řízení buněčné proliferace * kontrola exprese genů řídících postup z fáze G1 do S * aktivita E2F je řízena interakcí s dalšími molekulami: cyklinem A, histonovými deacetylázami HADC1, HADC2 a nádorovými supresory p53 a Rb * vazba E2F k Rb vede k inhibici transaktivační potence E2F * vazba E2F k ubiquitin ligáze zajišťuje degradaci E2F Ubiquitinace není vždy spojena s degradací proteinů Monoubiquitinované proteiny se degradují v lysozomech: EGFR a jiné membránové proteiny mohou být označeny mono-Ub: * internalizace * transport do endozomů * transport do lysozomů Neurodegenerativní choroby potenciálně spojené s dysfunkcí ubiquitin-proteazomového systému (UPS) Neobvyklé agregáty různých proteinů byly nalezeny v mozku pacientů postižených neurodegenerativními chorobami Neurodegenerativní choroby potenciálně spojené s dysfunkcí ubiquitin-proteazomového systému (UPS) ALZHEIMEROVA CHOROBA * v mozku pacientů byla zaznamenána exprese mutantní formy ubiquitinu UB1 (pozměněný C-konec) * absence glycinu znemožňuje normální připojení UB1 k substrátu prostřednictvím E3 * UB1 může být podroben normální ubiquitinaci proteinem Ub wt: vznikají formy UB1 nesoucí polyUb, které nepředstavují optimální substráty pro deubiquitinační enzymy: inhibice proteazomu 26S, akumulace UB1 v mozku pacientů HUNTINGTONOVA CHOROBA * důsledek expanze CAG (kodón kódující glutamin) * proteiny obsahující abnormálně dlouhý polyglutaminový úsek jsou náchylné k agregacím * Např. expanze CAG v genu kódujícím ataxin-1: - tvorba agregátů ataxinu 1 -- i když mohou být normálně označeny UB, jejich degradace proteazomem je významně snížena - usmrcení neuronů PARKINSONOVA CHOROBA * neurony v mozku pacientů často obsahují inkluzní -- tzv. Lewyho tělíska * Lewyho tělíska obsahují agregáty proteinu a-synuclein * a-synuclein má zřejmě nějakou funkci v synaptických vezikulech * příčinou akumulace a-synucleinu je zřejmě mutace v genu kódujícím E3 ubiquitin ligázu (tzv. Parkin), která zodpovídá za ubiquitinaci a-synuclein Cystická fibróza (CF) * gen CF kóduje transmembránový regulátor CFTR - kanálek pro chloridové ionty * pouze malá frakce proteinu CFTR zraje a dostává se na buněčný povrch - většina je rozložena ubiquitinovým systémem * nejčastější mutace genu CF, která doprovází cystickou fibrózu, nemění funkci proteinu CFTR, ale zvyšuje úroveň jeho degradace