Detekcia mutácií v ľudskom genóme Vladimír Ferák Katedra molekulárnej biológie Prírodovedecká fakulta Univerzita Komenského Bratislava DGGE DGGE: charakteristika Charakteristika - dĺžka fragmentov 100 - 1000 bp - fragment musí obsahovať min. 2 denat. domény (neidentifikuje mutácie v doméne s najvyššou stringenciou denat.) - detekčná schopnosť je 50 - 70 % - "GC-clamp" - umelo priradená doména s vysokou stringenciou na 5´- koniec fragmentu: detekčná schopnosť cca 95% - nedáva informáciu o lokalizácii mutácie - TGGE - Temperature Gradient Gel Elpho - modifikácia DGGE (zvýšenie stringencie denaturácie pomocou zvyšovania teploty) SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism (Orita a spol., 1989) Teoretické východisko - jednovláknová DNA za nedenaturačných podmienok vytvára terciárnu štruktúru, stabilizovanú vnútrovláknovými interakciami - mobilta ssDNA v nedenaturačnom PAGE je funkciou terciárnej štruktúry - zámena báz môže viesť k zmene terciálnej štruktúry s následnou zmenou mobility Princíp - separácia na základe rozdielnej terciálnej štruktúry SSDNA Metodické prevedenie * Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ * Denaturácia fragmentov: teplota, formamid * PAGE (nedenaturačný gél) SSCP SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism * Charakteristika: -- Dĺžka analyzovaných fragmentov: do 400 bp -- Detekčná schopnosť: <100% * Fragmenty 200 bp: cca 80% * Fragmenty 300 bp: cca 60% * Dlhšie fragmenty: štiepiť RE -- Neinformuje o lokalizácii mutácie -- Veľmi jednoduchá, široko využívaná metóda -- Občas používaná aj pri diagnostike SSCP v diagnostike SSCP v diagnostike REF: Restriction Endonuclease Fingerprinting * Teoretické východisko: - ide o modifikáciu SSCP - analyzovaný fragment sa separátne štiepi 5-6 RE (získa sa 10-12 dsDNA obsahujúcich mutáciu - zmenená mobilita môže byť výsledkom: - zmenou sekundárnej štruktúry (SSCP komponent) - zmenou RM (RFLP komponent) * Metodické prevedenie: - PCR generujeme fragment - fragment separátne štiepime RE - zmiešame štiepne produkty - SSCP elfo (nedenat. PAGE gél) - detekčná schopnosť: veľmi vysoká; potrebujeme referenčnú vzorku (bez mutácie) Metódy založené na analýze heteroduplexných NK heteroduplex -- dvojvláknová NK, ktorá nevykazuje úplnú komplementaritu báz Heteroduplexová analýza * heteroduplexy majú zníženú pohyblivosť v nedenaturačných géloch * HA analýza mutácie G152fs v HGO géne DHPLC: Denaturing High-Performance Liquid Chromatography Oefnar a Underhill 1998 Princíp: detekcia prítomnosti heteroduplexov na základe ich kratšej retencie na chromatografickom nosiči za čiastočne denaturačných podmienok * nosič je pozitívne nabitý; DNA negatívne * retencia dsDNA je funkciou elektrostatickej interakcie (retencia je závislá na dĺžke fragmentu) * interakcia heteroduplexov je menej stabilná ako homoduplexov * parciálna denaturácia heteroduplexov spôsobuje významný posun v ich retencii na nosiči DHPLC -- pokr. Charakteristika DHPLC * dĺžka fragmentov do 1,5 kb * senzibilita a špecifita > 95 % * detegovateľné mutácie: substitúcie, inzercie a delécie * rýchlosť: 3 -- 5 min. na jeden fragment * získanie fragmentov: bežná PCR reakcia * odhalí prítomnosť mismatchu > samotnú mutáciu treba určiť sekvenovaním DHPLC -- pokr. DHPLC ... čo potrebujeme: Diagnostické metódy RA: Restriction Analysis * Teoretické východisko: -- RE sú vysoko špecifické -- mutácia: a) vytvorí nové RM b) eliminuje existujúce RM - CpG dinukleotidy: mutačný "hot spot" (prednostne využívame RE s CpG v cieľovej sekvencii) * Metodický prístup: -- Southernova hybridizácia -- PCR * Charakteristika: -- dĺžka fragmentov: pri SH neobmedzná, pri PCR limitovaná PCR -- detekčná schopnosť pod 50% -- používa sa aj ako diagnostická metóda (bežná, historicky prvá) ACRS: Amplification Created Restriction Site Rozširuje RA na prípady, keď mutácia nevytvorí ani neeliminuje RM * Princíp: pomocou PCR zavedieme do nemutovanej alely RM, ktoré je prípadnou mutáciou eliminované * Metodický postup: -- PCR s jedným upraveným primerom -- restrikčné štiepenie -- elektroforéza -- vizualizácia ACRS: detekcia mutácií v géne HGO ASO: Allele Specific Oligonucleotides SSO: Sequence Specific Oligonucleotides Princíp: pre každý oligonukleotid sa dajú určiť podmienky denaturácie, pri ktorých len úplná komplementarita zabezpečuje stabilitu dvojvláknovej štruktúry. Metodický postup: -- PCR testovaného úseku -- dot/slot blot hybridizácia na membráne * analýza jednej mutácie -- zakotvenie testovaného fragmentu * analýza viac mutácií -- zakotvenie panelu oligonukleotidov ARMS: Amplification Refractory Mutation System ASA: Allele Specific Amplification * Princíp: mismatch PCR primeru na 3´konci znemožňuje PCR * Metodické prevedenie: -- 3 primery: * 1 špec. pre normálnu alelu (N) -- forward primer * 1 špec. pre mutovanú alelu (M) -- forward primer * 1 spoločný (S) - reverse primer * plus pár primerov pre kontrolnú PCR reakciu -- 2 PCR reakcie: N N N M M M * 1. PCR S-N + + - * 2. PCR S-M - + + ARMS-PCR: princíp ARMS: populačná štúdia TaqMan (Real-time PCR) TaqMan špecifická sonda: "reporter" a "quencher" DNA polymeráza pri PCR sondu odbúrava: reportér svieti TaqMan: priebeh TaqMan 7700 Celera´s sequencing center in Rockville, MD. PTT -- Protein Truncation Test Metóda na identifikáciu mutácií skracujúcich príslušný polypeptid (non-sense mutácie, splicingové mutácie, frame shift, ..) Metodický postup: * PCR generácia templátu -- súčasne sa pridáva promótorová sekvencia T7 bakteriofága a eukaryotický iniciačný signál translácie * simultánna in vitro transkripcia a translácia -- v systéme lyzátu králičích retikulocytov s použitím značených aminokyselín * elfo v SDS-PAGE * autorádiografia -- mutácia sa prejaví ako prítomnosť skráteného polypeptidu * výhoda: detekcia viac mutácií v príslušnom géne (napr. mutácie zapríčiňujúce familiárnu adenomatóznu polypózu, FAP)