Regulace exprese lidského genomu Üvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Genetický kód a tok genetické informace Gene expression -f DNA T Template-s L rand C m m C ■■nr n n c hDO- C U-ÖJ íc T >3Í mRIMA I_",_m-o irt^rtnjín* í uir uuu Tir irju u Y Coden Protein {ammo acid chařn) Methionine Proline Leucine Alanine Arginlne Skladba lidského genomu Mitochondriální (MCH) genom (Anderson 1981) 14.5 kb, 0.5% celého genomu, dědí se výhradně od matky, při dělení buňky MCH DNA segreguje náhodně, - syntéza na MCH ribosomech (vlastní rRNA a tRNA); MCH genom je kompaktní - kódující Jaderný genom 24 různých molekul, 22 autosomů, 2 pohlavní ehr., velikost 50-250 Mb, 70% tvoří sekvence mající určitý vztah ke kódující DNA (včetně intronů a regulačních oblastí) 10% tvoří repetice (např. AI u sekvence) 10% tvoří transpozony Počty genů u různých organismů Mycoplasma (600) Escherichia coli (4000) k£3h "'"".'Trŕ": ;:;;" "■ ľ1,".'Tri.': ;:i;" "■ ľ"".":";!.": ;:i;~ "■'""."Tri-": ;:;;* "■ ': " ":v.:, !'!," ■""■".": ■■ ■ .-r. .....:- .......-r. .....:- .......-r. .....í"........-r. " VíľT.- '' :'^:'~ ""ľ :!:ľT.' n':~~':'.' "."' "..-T.- n":""':'" v v '•".■ h .":-. ' ' i;':.'' •' *Mm ' VÍ':./ ..'-:Í. člověk + vyssi organismy (35 000) ■. . HÜ -!•: :.■ * :; ' : -!•::. *":!;""::- =:! *■"■■ :'!t; ' - :-;r-' -"■■ :'Tt ! ' - :-í-' --"■■ -"rr! - -J„.":.:"" .'-': :ľs'J^.':.:,,M: .>-:: :ľ"J^.':. ■""■ :.-...::-: :-■-■ ...::-;-.■ ' -.--.-■ ..::ľ;\-... ■ . ■ .. . :;,= :^ «"!' '" !**" %-#' "*■';.■!" "" i"**'! ~m-r~ "*■';■■!■ *" :,,,■ ...... --•■■■ ,-r, ,."-•-• *..... -fM ........ ... .. . _.y _ ........ ... .. . _.y _ ........ ------ ,-r, ,........ ";:■!!■.":::■::,. ■:■■ ::■!:■,;-:-:: ■■::. t ■:■■ ::■!:■,;-:-:: ■■::. t ■:■';:■!:■.":::■■::,. ■:■' ;:■::■. ":::•::. - v ::■;:■," ■■..*■ . : :.rí ľa ■■■..*■ . ::/;.■- ■■■..*■ . : :.r: i;: ■■■..*■ . ::.'i;;; ■■■..■■ . : :.r;;™ ■■■..■■ . : : l:== =::=;::::™*Sf;,:»:: qs;-p:ř|.^;,:»:: qs;-p:ř|.^;,:»:: e;::;.;:;-:;,-!::.;:,: ■",■;•;-;. :■■;.-. e " :!: r. ■:■..—■:, ::!^t ■ :■. v v :, ::':.-:;..-■■ :;.-:e. .:>""".!/":*," I: .:>""".!/"í\" ľ: .:*""".?/":"," ľ: .:.-'." "As +l\' ".: .:"■'." K1 ••*'.' '.: .:"■"" ". ĺ ::j .? ' ľ.j I -""". ĺ ::j .? ''.: ' J"". L ::j .? ''.: ' J"". ĺ ;:j .? ''.: ' '"'. l ;:j .?'".: ' -"". . :1 . ...... ------ ,-r, .....--• -- ■■ ■ ;;, ,-—.-. --- -- . ,-y, , - ...... --- -- . ,.y , ........ ......^t., ,........ :|: " :;^;j" ■ 'r|: " : :^iÜ;J"" '^ " ' :^iÜ;J"" '^ " ''"Üsiäj" '■ ' v|i -"'' "UiäH. ■" '■ ^^ •• izr7r..:iľ-.i-::< * ■:■■ sTľ.;::-:!"". * ■:■■ i;-::'.;;:-:t-":, ♦ ■:■■ i;-::'.;;:-^^* »■■:■■ srs:.:::-^:^* » ■:-::::■." ■v." . ::.'i.^ —..•■ . ::/:;;; —..-■ . ::.':;^ —..■■ . ::/;;\; —..■■ . : :.rí íh — .'■ . : .■.!••.'.:: ..:.■ -3 - :':.-.i".j.:ľ ..!.■•: - :jľ.-.;".j.rí ..:.■ , - :':.-.L".j.;í ..:.■ ■:,.. :':.-.i".j.:ľ ..:.■ i - j^.-.ľ'.'.íí mwm _; -."":,í;í »«•; =; j".-" ..i ■■- ; .] .-" ■-■■ ■■■-••"•".-rl - • -v1*' '•'■"-• :'"t. ' ■ ":í-ľ -"■■ :'ľ-r. '■ ":í-ľ -"■■ :'!tI ■ r.i . * --. t :'.■ .: ■ r.i . - -. : :'j .: ■ -.: . * -. : :';■ .: ■ r.i- . ■■ ■ .t. .....r.........t- - - "-r.........t. - - "-r.........t . ■ :•■•: -,..- --..-■ ■ :■'■: -,..- -'■..-■ ■ :■■■■ -,..- -•■..■" ■ :■'■: -::■::, < ■;■■ ::::■.":-:;■::, - ■;■■ i;"::-.;;:-:t-::, ♦ ■;■■ ^TT.SÍI-íírTr* » :.r; ;ö —..■■ . : :.". ;;; ■■■..•■ . : r.ri; ;; ...... . -: ^ľ- ľll-•\\\.rmií Eľ=:'*;ľ^ľ:[.*:L:.;|;:: :":'';ľ:'::j.-i:;.J|;:: E":"*;":':^.":'!:^!;:: ■ .':-.- ■:':':?■. I ■■ "TtI - ■ "-í"" ":"- "TtI - - "-í-" j-v- :'!t] - ■ "-í:'" '■"■■ :'TtI ".. ": .--" :■■..".. ": .'-■-" :■■..".. ": .--" :-"i."..:"" ■ÁtV* w ■!" kts::.:::-^:^* . ■:- ií-::'.;;?-:t-::, ♦ ■■- ^Tr.:;:-:::^* . '..". ;;; ■■■..•■ . : :.rí .a —..-■ . : :.i T .. —..■■ . : :.rí ia •—.I-:: ^■'■"r-:-:.-!::.;5 :; -"-•"'■'■".■•i::.;5:; -"•""•J"ľ."i::.;: :: ' ::;:"•:-:;=:':" ^ ■■ ;:-rr.;;;-:f::, « ■:■■::■::■.":■::■::,- ■:■■::■::■.":■::■::,- ■:■■ ::■!:■,;"-:;•::,, ■:■■;:•■::■.;;:-:;■■::,, ■:-::■::■." -yr.^-y^-:.■?■:"- :A".i--,<:r.:.ü-r-. .'\"a,^.:ü-:7.. .\ : .. ■■ : ;t-ti~ .: ĺ * : ;t-ti~ .: . ~ : it ..' -::; ■.-:.■..■ :E^;|. */,.=: ;tti"-;:. ■ .'- : -■•i" -;:.-- '■ z$i--'± " •~.-t\ ■ ■ "-í"" ":"- "TtI - " "-í-" J-V- :'!t] - ■ "-í:'" '■"■■ :'ľ-rľ ■■_ :■■■: -,..- ■■■.......: ■...- ■■.......: ■...- "■..-„ ';. ■""■ 3;;hrrl ■ T :';■'" ^ľíiE^ľ:.- ■ ":*:■■ .!::!::.■ ■ i*:1' ."::-!■. ■arne» . ■■:■■ Hrsľ.yi-srnfr* . ■■:■■ ^T^ľ.:::-:írT7* . ■:■■ Kim.:::-:írT7» . v": ž'," .'." \11 .\.: ::rŤ Y," .'." :'.', .J..: r": z,i; .'.":'.'. .'..: h'? z.-ľ=?.- ■ ":-:-' :lz-A} ■ ■ ":-:-' ":::í. ::- .::::-"f::, 4 -;■■ ;!'!!'.::: ::■::. . ■■■' ;!■!!■, :::■::■■::. . ■■■■ ::'::■,;;:-:;•■::, * :.ri ia ■■■.'■ , ::.-i;;; ■■■..*■ , : r.'i;;; ■■■..*■ . ::/: . ^ .;;;-:í-::i» ■:■■ :rrr:.;::':::T% » ■:■■ inr.;::-s:lf» . ■■: ■ fmSí ,::: ::■■::. . ■■■■ :\,w,:" ::■■::. . ■■■■ ;!'!!'.::: ::■■::, . ■ r.;-. ■■■ ■ h '■ -■■■ ■:■: :í. :- ■ ^-^ ■'■■■■- "'.&:': -^-" Íl ■■ :nn.:::-:::,Tr* > ■:■■ ::-rr.;;:-::-::, , ■:■■ ::-í:-.;;:-:t-::, * ■:■■ ií"::'.;;:-:í":% * ■:■■ tiTT.;;:-:::^* > ■:■■ srr.s ■■.."■ . : :.rí ľa ■■■..*■ . ::/:,■; ■■■..*■ . ::.'i;;; ■■■..*■ . ::.'i;;; ■■■..*■ , : r.-i ;;; ■■■..*■ . : .■.i;'/.::r..;.;,;: :; ;".-.i";;:::r..;.;_;: :: E":'*i!'^:::,,,i:!.;: :: ž": •".'S.ŕ'.■•!:!.r :; i":•'-'.':J.ŕ'.■•!:!.r :: :":"*l";'::i. ^|^-B « - ' aa ' ^"ti!-1 ^ .j ■ / 1B " Bt~ti" b ■■ . * >b ľ_ Bt~ti" b ■■ . t* ib ľ .:::•* ^ _j ■ / ,, " í-"4" B ■; :'.'íľ'. '/.'" '.'~.Ts ".' :'.'i\.'.'. ','.'" '.'•".'■ '. ~~.:'.'.'. '.'.'"' :'.ľ. '. ~~.:'.'.'. '.'.'" '.:',".'■ V "!!! !'" "ľ" ' '■'.'. '.' ".''.'.'. '/.' ■,:■!!'.":::■::,- ■:■'.!■!!■.:::-::■■::.. ■:■'::■::■.":::■::.- ■:■' ::■::■.:::"::■■::, , ■:■- .:■:;■. ":-:í:T% , '■" tírtr!= ■■..■■ - ::.-:;•;. — .•• . .:.•;;•;. ...... . .:.';;•;. ...... . ::/;— ■■■..■• . ::.-:;•;. — ,•• , : í ' - 1 - I J | f l : .T;■...'-:;:. ľ; 'ä |i| . r Skladba genů u pro- a e u ka ryot Genom e u ka ryot obsahuje mezi kódujícími sekvencemi řadu nekódujících oblastí - intronů coding region bacterial gene coding regions (exons) noncoding regions (introns) _ / _\ eucaryotic gene 1995 GňRLAND PUBLISHING Geny: prům. velikost 10-15 kb ale variabilní od stovek bp- Mb (tRNA - Dys); exony činí od 100% až po 0.6% (Dys) Intronyjsou velmi variabilní: 0-118 na gen (u colagenu); délka 0.5 kb pro ß-globin až po 30 kb pro dystrof in Rozdíly v regulaci u pro- a e u kary ot Exprese u prokaryot je typicky regulována v rámci operonu -souboru kontrolních sekvencí v bezprostřední blízkosti protein-kódující sekvence Eukaryotické geny jsou rovněž regulovány souborem kontrolních sekvencí, které se nacházejí poblíž protein-kódující sekvence, ale operony zde neexistují. V eukaryotických buňkách je jádro - regulace je komplexnější (transkripce a translace jsou odděleny). Introny se u bakterií téměř nevyskytují a regulace sestřihem se uplatňuje pouze u eukaryot Existuje krátkodobá a dlouhodobá regulace transkripce. Možnosti regulace exprese u e u ka ryot Jádro DNA RNA transkript mRNA regulace transkripce regulace sestřihu Cytoplasm; mRNA regulace transportu a lokalizace regulace degradace mRNA regulace translace inaktivní mRNA protein regulace degradace a aktivity proteinu Epigenetická regulace exprese Epigenetika zahrnuje jevy související s dědičnou modifikací struktury a transkripce chromatinu jež navazuje zejména na: - modifikace histonů - metylaci DNA - strukturu chromatinu a genomu Patří zde PEV, umlčování genů heterochromatinem, LCR regulace, regulace vývoje a diferenciace Polycom and trithorax proteiny, imprinting a další jevy. Nepatří zde vliv vnějších faktorů na expresi buněk. „Position effect" u kvasinek a Drosophily ADE2 gene at rörmai lotfltľur orichramasamí] whih! n i Inn y f if V&A5Ť ľuMľ m - AQGJ ffcn-c myvcd rtcar idomcre i ::l inir-nynr yeas: ľpIIb with wMie*OCEi?rr wň/fFgenB ^ L nurlTiUl relation hftlŕiriKhrOťflflľin rürc c h ram m o m c wfrtiz gene Po ozáření se u Drosophily objevila mutace při niž se červené facety očí změnily zčásti na bílé. Cytogenetická analýza ukázala, že došlo k inverzi chromosomu, kdy se gen označeny jako „white" přesunul do blízkosti heterochromatinu. Jev bylo možno potlačit nebo naopak zesílit. Časem bylo nalezeno 50 genů modifikujících tento fenomén - Su(var) nebo E(var). Nejlépe charakterizovaným modifikatorem je HP1 protein. HP1 obsahuje evolučně stálou chromo doménu, která se vyskytuje také u vývojového regulátoru Polycom (PC) proteinu. Dalším je pak SUV39H1, který je příbuzný trithorax (TRX) proteinům a zajišťuje metylaci H3-K9. Úloha heterochromatinu při řízení exprese Heterochromatin - tmavě zbarvená část chromatinu, - kondensovaná po dobu buněčného cyklu - nachází se hlavně v centromerických a telomerických oblastech -je genově chudý, - obsahuje repetitivní sekvence - nachází se většinou na okraji jádra - DNA v heterochromatinu je špatně přístupná pro transkripční faktory, - histonyjsou málo acetylovany a hodně metylovany na H3-K9 - obsahuje HP1 protein vázaný na metylovany H3-K9 Úloha heterochromatinu při řízení exprese Dvoustupňová regulace exprese (Francastel et al., 1999) B 0,5 í 0.4 E 0.3 o 0.2 H Ü c * 0.1 t* O p = 0.1 p<0.001p<0,001 r-------------ir^^------1 y /* ,^v • * $ lActive, open ISilent, open ISilent, closed Měřena vzdálenost genu od nejbližší oblasti heterochromatinu pro 3 typy buněk T-MEL - exprese umlčená gen je blízko heterochrom atinu Struktura se může otevřít - dole a k expresi ještě nemusí dojít N-MEL - struktura je otevřená, gen je aktivní Úloha heterochromatinu při řízení exprese Vzdálenost Rb genů k chromocentrum (Bártová et al.,2000) Buňky iranulocyty Metylace DNA - Existují enzymy metylující de novo (DNMT3a a DNMT3b) - Existují enzymy, které DNA podle prvního („maintenance methylaes") - ty jsou odpovědné za - Existuje demetyláza, která odstraní metylaci z DNA. - Metylace DNA nastává nejčastěji v symetrických CG sekvencích (CpG islands), které se nacházejí u poloviny lidských genů H H \ / N H H \ / N i 3 1 ŕ" DNA methylase •"A ^x CH3 0^ ^H CH3 V XNX H Deoxyribose (methyl group) 1 Deoxyribose Cyt osine (in DNA) 5 -Metl íylcytosir té (5mC) transfer metylové skupiny S-adenosylmethioninu na 5-tou pozici cytosinu Zachování metylace při replikaci „udržovací metylázou" CH3 CH3 CH3 ACGTATCGT Replikace ■ "■■■■■■"" 5 Metylace DNMT1 TGCATAGCA ACGTATCGT CH3 ACGTATCGT TGCATAGCA TGCATAGCA CH3 CH3 Metylace DNA je důležitá - Metylace DNA se nachází hojně u zhoubných nádorů (jak u onkogenu tak i u tumor supresorových genů) - Poškození metyláz (mutací) vede k těžkým onemocněním (bez methyltransferáz se embryo nevyvine) Úloha metylace při řízení transkripce - Transkripcne aktivní geny obsahují podstatně menší hladinu metylované DNA ve srovnání s inaktivními geny, - Inaktivní chromatin je obvykle metylován (např. inaktivní X-chromosom nebo inaktivované supresorové geny u nádorů) - Chromatin v místě metylace DNA je kondensovanější a brání přístupu TF - Promotory, které nemají CpG ostrůvky, mohou být citlivé na methylaci jednotlivých cytosinů - TF mohou být metylačně závislé (např. AP-2), existují však proteiny, které se vážou pouze na metylovanou DNA Mechanismus jak metylace DNA vede ke kondensovanému chromatinu Induction of silent chromatin by DNA methylation signals i DNA metylace usnadňuje vazbu HDAC komplexů (přes MBP - methyl binding proteins) a histon metylázy (HMT). Tyto enzymy odstráni Ac skupinu a přidají M skupinu na H3-K9, která je rozpoznána HP1 proteinem. Tento stav je dále šířen vazbou histon metyltransferázy na HP1. Umlčení exprese genu metylací de novo gene regulatory ^Sroteins ^ L general transcription factors LOSS OF GENE REGULATORY PROTEINS NEW DNA METHYLATION fffj+yo9P ?99 i66 X mw4 BINDING OF PROTEINS THAT RECOGNfZE METHYL C ._ GENE - ON ._ GENE OFF - - BUT LEAKY BINDING AND ACTIVITY OF CHROMATIN REMODELING COMPLEXES AND HISTONE DEACETYLASES tmt? srna GENE ľ! COMPLETELY OFF Umlčení genu probíhá v následujících krocích: 1) Odstranění regulačních proteinů 2) Metylace DNA 3) Vazba metylačně závislých proteinů 4) Deacetylázy a histon-metylázy 5) HP1 se váže na met. H3-K9 a posílí kondenzaci chromatinu Insulator - hraniční element Vzhledem k působení aktivátorů na velkou vzdálenost, musí být jejich vliv oddělen (aby si nepřekážely). To zprostředkovávaní insulatory - elementy jež vážou proteiny, které 1) chrání geny před šířením heterochromatinu (jejich přenos společně s genem do blízkosti heterochromatinu vyloučí PEV) 2) blokují funkci enhancerů (pokud se nacházejí mezi enhancerem a cílovým genem) >ulator heterochromatin gen A není ovlivněn blízkým heterochromatinem gen A insulator enhancer gen B gen A není ovlivněn enhancerem, zatímco gen B je Úloha Polycomb group proteinů (PcG) a trithorax group proteinů (trxG) při řízení vývoje Ontogeneze je kontrolována důmyslnou kaskádou genů, jež zahrnují transkripční faktory nejprve rozdělující embryo do větších domén a následně do jemnějších podjednotek. Identita jednotlivých částí těla je dána určitým TF. U Drosophily tyto TF tvoři tzv. HOM-C komplex, u obratlovců je to Hox komplex. Stabilní expresi těchto TF zajišťují PcG proteiny (udržují geny v reprimovaném stavu) a trxG proteiny (udržují aktivní stav). Mechanismus, kterým se tak děje zahrnuje modulaci struktury chromatinu. Existují významné paralely mezi regulací vývoje a umlčováním genů prostřednictvím modifikace chromatinu. Některé PcG proteiny mají HDAC aktivitu a naopak trxG proteiny mají HAT aktivitu. Úloha PcG a trxG proteinů při řízení vývoje Egg Anterior Posterior Cellular blastoderm Para segments Embryo at 10 hours Ípúa;pap/^ap Compartments Segments Molekulární gradienty v anterior-posteriorálním a dorso-ventrálním směru vedou k formování parasegmentů a poté segmentů u embrya i dospělého jedince V každém segmentu je exprimován jiný řídící protein Thoracic Abdominal Segmentace u embrya a dospělého jedince Úloha PcG a trx inu pn nzeni vývoje REGULAČNÍ PROTEIN C3J prekursorova buňka REGULAČNÍ PROTEIN U buněčné dělení REGULAČNÍ PROTEIN ( 3 REGULAČNÍ PROTEIN C3J REGULAČNÍ PROTEIN C 3. buňka A buňka B buňka C buňka D buňka E buňka F buňka G buňka H Regulace exprese lidského genomu Üvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Transkripční mapa genomu (Caronetal., 2001) 6 8 10 12 13 c 15 16 17 18 19 20 21 22 Lymphocytes 10 Average expression [tags/105 tags] Umístění genetických elementů HSA 17 vzhledem ke středu jádra a jejich umístění na transkripční mapě TP53 cenl7 0.030 0.035 0.025 nn 0.030 )bability o o Ö Ö Ux O li. 0.025 0.020 0.015 II ■ £ 0.010 n n 0.010 .....II 1 0.005 Jllllllllln 0.005 0.000 ( 1 ) 20 40 60 80 100 1 ) 20 40 60 80 100 Distance in % of radius Distance in % of radius RARA 0.025 -i 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 J 0 20 40 60 Distance in % of radius Iso-p 0.045 0.040 0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 „,^n,nn,l 0 20 40 60 80 100 Distance in % of radius Iso-q Distance in % of radius TP53 ISO-p centromere RARA pl3.1 pll.2 ISO-q ql2-q22.1 q21.3-q32 Umístění genetických elementů HSA 17 a HSA 12 na transkripčních mapách chromosomu TP^^ / | ' r°° | IJIIIInn. W f/\ 'F I v 1 ^K L r í Iso p | Cen17 | | RARa ] l-á.l Iso q BLiilI LJ-----------------------_------------■ 17 Lukášova et al., 2002 12 77,71,156 LllL C12,185 108,140,190 LJL 73, 103, 189, 197 206,97, 116 Okumura et al., 2000 Vliv genové exprese na strukturu chromosomových teritorií Volpietal., JCS, 2000 Schéma interfázního chromosomu Chromosome backbone Active subdom Chromosomy jsou polární s aktivní (dekondensovanou) doménou uvnitř a neaktivní (kondensovanou) doménou na okraji jádra. Toto uspořádání se v zásadě vytvoří v telofázi/G1 fázi a zůstává v průběhu cyklu neměnné. Tím se nastaví expresní profil buňky. Je dáno metylací DNA???