Molekulárna genetika človeka Metódy identifikácie a izolácie ľudských génov Vladimír Ferák Metódy identifikácie a izolácie nových génov * Funkčné klonovanie ("priama genetika") -- proteín -> AA sekvencia -> oligosondy -> skríning knižníc -- proteín -> protilátka -> imunoprecipitácia na polyzómoch -- proteín -> protilátka -> skríning cDNA knižníc * Pozičné klonovanie ("obrátená genetika") -- určenie pozície génu v mape -- kráčanie po chromozóme -- konštrukcia kontigu -- hľadanie klonov s kódujúcimi sekvenciami -- identifikácia klonu s hľadaným génom -- klonovanie hľadaného génu, jeho charakterizovanie -- overenie (pacienti) * Kandidátne gény -- vyhľadávanie v databázach (bioinformatický prístup) -- využitie zvieracieho modelu (myš) Funkčné klonovanie ("priama genetika") * Východisko: génový produkt (proteín) alebo protilátka k nemu * Štandardný postup: -- sekvencia AA proteínu -- preklad z AA do sekvencie DNA (pozor: degenerácia kódu!) -- syntéza degenerovaných DNA oligo-sond -- skríning cDNA knižníc -- pozitívne klony použiť ako sondy pri skríningu genómovej knižnice -- pozitívne klony v DNA knižnici: overiť na pacientoch * Iná možnosť: imunoprecipitácia na polyzómoch -- na polyzómoch: mRNA a polypeptid na jednom mieste -- historicky úspešná (1980-90), už sa však nepoužíva Funkčné klonovanie: príprava DNA oligo-sond AA sekvencia: . .- Ala -- Glu -- Val -- Val -- Ser -- Ala - ... . . .GCA GAA GUA GUA AGC GCA . . .GCC GAG GUC GUC AGU GCC . . .GCG GUG GUG UCA GCG . . .GCU GUU GUU UCC GCU . . . UCG . . . UCU 4 x 2 x 4 x 4 x 6 x 4 = 3072 x degen. oligo (zmiešané sondy) 6 - 7 AA -> 18 -- 21 bp postačujúca špecifickosť Sondami skrínujeme cDNA knižnice (z tkanív, kde sa gén exprimuje) Príklad génu identifikovaného funkčným klonovaním: gén pre faktor FVIII -- hemofília A (Gitschier et al. 1984) purifikácia FVIII z krvi terapeutický FVIII DNA-diagnostika sekvenovanie proteínu (15 AA) expresia v bunkách mutácie degenerované oligo-sondy (45 bp) cDNA kontig gén (9kb) (186 kb, 26 E) skríning cDNA knižníc cDNA klony skríning g-knižnice Pozičné klonovanie: určenie lokalizácie génu * Chromozómové prestavby (delécie, translokácie) -- hľadať pacientov s monogénnym ochorením a s chrom. deléciou (občas súčasne viac monogénnych ochorení u jedného pacienta) -- monogénne ochorenie plus chrom. translokácia -- metóda klonovania deletovaného génu: subtraktívna hybridizácia * Strata heterozygotnosti (LOH) pri TSG -- len pri hľadaní tumor-supresívnych génov -- porovnávať STR v DNA z nádoru a z norm. tkaniva (tí istí pacienti) -- hľadať STR v ktorom v DNA z nádoru nastala LOH * Väzba s lokalizovanými polymorfizmami -- zhromaždiť väzbovo-informatívne rodiny -- stanoviť lod-skóre s jednotlivými STR (prípadne VNTR alebo SNP) -- nájsť tesne viazané STR (VNTR, SNP) pred aj za génom -- "chromosome walking" medzi týmito STR: zostaviť kontig (knižnicu usporiadaných klonov) Klonovanie DNA fragmentov z chromozómovej delécie: "subtraktívna hybridizácia" Normálna DNA: štiepená RE (napr. MboI) -- klonovateľné fragmenty DNA pacienta s deléciou: fragment. mechanicky (ultrazvuk) -- neklonovateľné Subchromozomálna lokalizácia pomocou hybridných buniek s chrom. deléciami Hlavné kroky pozičného klonovania Hľadanie viazaných STR: väzbová analýza Grafické znázornenie lod-skóre Autozygótne mapovanie Autozygotné mapovanie: rodokmeň z genetického izolátu (Rómovia) s AR ochorením (RP) Autozygotné mapovanie: genotypizácia postihnutých Pozitívny výsledok autozygotného mapovania: D14S63 a AR retinitis pigmentosa Kontig: súbor prekrývajúcich sa klonov z genómovej knižnice Vektory: YAC -- yeast artificial chromosomes BAC -- bacterial artificial chromosomes YAC: yeast artificial chromosome BAC: bacterial artificial chromosome Chromosome walking: "kráčanie po chromozóme" "Chromosome walking": kráčanie po chromozóme Konštrukcia kontigu Kontig prúžku 8q23 (20 cM) Hľadanie génu na kontigu * Ako identifikovať inzert s génom: -- "Zoo-blotting" -- identifikácia CpG ostrovčekov -- klonovanie pomocou CpG ostrovčekov -- skríning cDNA knižníc -- "exon trapping" -- sekvenovanie * Ako identifikovať na tomto inzerte hľadaný gén: -- kandidátne gény (bioinformatika, databázy...) -- homológia s myším modelom -- skríning mutácií u pacientov (SSCP, DGGE...) "Zoo-blotting": hybridizácia inzertu s DNA rôznych živočíchov * Použitie: skríningové vyhľadávanie klonov (z knižnice), obsahujúcich kódujúcu sekvenciu (gén alebo jeho časť) * Princíp: kódujúce sekvencie sú obyčajne evolučne konzervované * Ak nevznikne hybridizačný signál: inzert asi neobsahuje kódujúcu sekvenciu Identifikácia klonov s CpG ostrovčekmi Klonovanie / PCR CpG ostrovčekov Amplifikácia exónu: "exon trapping" Príklad pozičného klonovania: gén CFTR -- cystická fibróza polymorfizmus cM COL1A1 19 DOCR1 15 PON 5 metD <1 metH <1 CF gén (CFTR) 79A <1 7c22 4.5 TCRB 10 Cystická fibróza: kontig, obsahujúci CFTR gén CFTR gén, jeho produkt, mutácie a CF Prvých 10 rokov pozičného klonovania (vybrané ochorenia) rok ochorenie lokalizácia gén chrom. abnorm * Duchenne sval.dystr. Xp21.3 DMD delX(p21.3) retinoblastóm 13q14 RB del(13)(q13.1-q14.5) 1989 cystická fibróza 7q31.2 CFTR žiadna 1990 neurofibromatóza 17q11.2 NF1 translokácie 17 Wilmsov tumor 11p13 WT1 del(11)(p14p13) 1991 fam. polyposis coli 5q21 APC del(5)(q15q22) syndróm frag. X Xq27.3 FMR1 fragilné miesto myotonická dystrofia 19q13.3 DMPK žiadna 1993 Hutingtonova chorea 4p16 HD žiadna tuberózna skleróza 16p13 TSC2 žiadna * achondroplázia 4p16 RGFR3 žiadna karcinóm prsníka 17q21 BRCA1 žiadna 1995 spinálna sval. dystrófia 5q13 SMN1 žiadna