Polymorfizmus ľudskej DNA Vladimír Ferák Katedra molekulárnej biológie Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského Bratislava Polymorfizmus ľudskej DNA * Definícia genetického polymorfizmu * Typy polymorfizmu DNA (SNP, RFLP, VNTR, STR, indel ...) a rozloženie po genóme * Metódy detekcie * Mechanizmy vzniku a mutačné početnosti * Polymorfizmus mtDNA a Y-chrom. DNA * Polymorfné haplotypy a haplotypové bloky * Praktické využitie Genetický polymorfizmus * Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej dvomi diskontinuitnými variantmi v jednej populácii, pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako 1% (arbitrálne číslo) * Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitnú variabilitu, polytypizmy, zriedkavé znaky (dedičné choroby) * Typy polymorfizmu: -- morofologický -- funkčný -- serologický -- biochemický -- DNA: je najčastejší, lebo väčšina polymorfizmov DNA nemá fenotypový prejav Typy DNA polymorfizmov * Bodový polymorfizmus (substitúcie jednotlivých báz; SNP) * Variabilný počet tandem. repetícií -- mikrosatelity (STR) -- minisatelity (VNTR) -- makrosatelity * Prítomnosť/neprítomnosť sekvencie (Alu, L1 a i.) na špecifickom mieste (indel) Bodový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) vMspI vMspI vMspI 5´-... A C C G G T A C A ... A T C C G G T T A G C C G G T A ...-3´ v MspI X v MspI 5´- ...A C C G G T A T A ... A T C A G G T T A G C C G G T A ...-3´ I...~1000 bp ... I * Početnosť odlišností: cca 1 : 1000 bp; v genóme cca 30 mil. SNP, t.č. registrovaných vyše 10 mil. (2004), ale len časť je definitívne potvrdených; * Výskyt: intróny, nekódujúce oblasti (väčšinou žiadny fenotyp); len asi 50 000 v kódujúcich sekvenciách génov * Vznik: mutácia + genetický drift (niekedy selekcia); nepoznáme pôvodný stav, len nepriamo (zo sekvencie u primátov); * u = 10^-7 až 10^-9 (najčastejšie v dinukl. CpG) * Možný dôsledok: prítomnosť/neprítomnosť restrikč. miesta (ak v rozpozn. sekvencii RE, asi 20%): vznik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Detekcia SNP polymorfizmu * RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) - restrikčné štiepenie genomickej DNA s následným Southern blottingom (dni) - PCR amplifikácia s následným restrikčným štiepením (deň) * DNA array (čipy) analýza až 100 tisíc SNP v jednej analýze Polymorfizmus variabilného počtu tandemových opakovaní (VNTR, STR) ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)....... ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)......... Detekcia PCR amplifikáciou repetitívneho úseku a separáciou v géli: VNTR (minisatelity) -- variabilita v populácii Polymorfizmus variabilného počtu tandemových repetícií Minisatelity (VNTR) * Dĺžka základnej repetície >6bp * Počet opakovaní repetície 10 -- 100 (1000) * Výskyt preferenčne v telomérických oblastiach (najmä bohaté na GC páry) ^* Odhadovaný počet: cca 10^4 * Jednoduchá detekcia: Southern, PCR * Vznik nových alel: nehomologický crossover ^* Mutačná frekvencia: vysoká, až 10^-3 * Využitie: obmedzené; individuálna identifikácia * Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA * Špec. prípad: minisatelit (TTAGGG)n - teloméry Typy mikrosatelitov Typy: * Perfektné (jednoduché) (CA)[n ]* Imperfektné (CA)[n] TTT (CA)[m * ] Zložené (CA)[n] AAA (AT)[m ]V genóme: (CA)[n] - 0,5% (najmenej 50 000) (TC)[n] -- 0,2% ostatné dinukl. -- takmer 0% tri- a tetra: zriedkavé, ale najčastejšie používané v praxi Inzerčno-delečný polymorfizmus (indel) Využitie polymorfizmov DNA Ukazovatele variability: * Počet známych alel (pri SNP dve, pri VNTR až 10^2) ^* Index heterozygozity H = S2 p[i] p[j] = 1 -- Sp[i]^2 * Pravd. identity PI = 1 - Sp[i]^4 -- S4 p[i]^2 p[j]^2 * Polym. information content PIC = 1 - S p[i]^2 - S2 p[i]^2 p[j]^2 Praktické využitie: * Identifikácia osôb/vzoriek DNA (A. Jeffreys 1985) * Určovanie paternity (VNTR, STR) * Nepriama dg. monogénnych ochorení (vysoký PIC) * Triangulácia génovej mapy (od RFLP až k STR) * Hľadanie nových génov (pozičné klonovanie génov) * SNP a multifaktoriálne ochorenia? Individuálna identifikácia "DNA fingerprint" * Alec Jeffreys, 1984 * Restrikčné štiepenie genomickej DNA -> elektroforetická separácia -> Southernov blotting s VNTR sondou (GGGCAGGAXG) PCR amplifikácia VNTR polymorfizmu Multiplex PCR * Amplifikácia viacerých lokusov v jednej PCR reakcii Mikrosatelity: variabilita v populácii Identifikácia osôb * Multiplex PCR 16 fluorescenčne značných mikrosatelitových polymorfizmov * Pravdepodobnosť identity dvoch náhodných jedincov 10^-17 Polymorfizmus mtDNA Polymorfizmy mtDNA: * Mimo D-kľučky 10x častejšie ako v gDNA * V rámci D-kľučky až 100x častejšie ako v gDNA * Žiadna rekombinácia: haplotypy; haploskupiny * Matrilineárna dedičnosť * Heteroplazmia * Využitie: štúdium evolúcie ľudských populácií Prenos mtDNA, Y-chromozálnej DNA a autozomálnej DNA Koalescencia línií mtDNA a Y-DNA "mitochondriálna Eva" * Možno nájsť spoločného predka pre členov populácie, pretože * v každej generácii dôjde k zániku a naopak k zmnoženiu niektorých línií, * a po čase v rovnovážnej populácii prevládne mt/Y DNA odvodené od jedného spoločného predka Polymorfné haplotypy * Haplotyp: súbor alel na jednom chromozóme, ktoré sa len zriedka oddelia rekombináciou * Haplotypové bloky v ľudskom genóme: rekombinačné "cold spots" * Využitie: štúdium "veku" mutácií