Struktura lidského genomu Historický úvod Základní poznatky o struktuře lidského genomu (DNA, nukleosomy, chromatinové vlákno) Metodické přístupy Chromosomy (stavba, členění, teritoria - CT) Globální struktura genomu (stavba CT, radiální vs angulární distribuce, pohyblivost molekul a CT) Jádro buňky (Robert Brown, 1831) Buňky a jejich jádra i' 1 £ fM J Jádro předává dědičnou informaci (Haeckel 1866) V jádře je obsažena kyselá látka - nuklein (DNA) (Miescher 1869) Nukleová kyselina vs protein (Miescher 1874) Dělení buněk (Walther Flemming, 1882) Buňka před dělením Mitotické chromosomy Chromosom Interfázní buňka Centro mera Walther Flemminq: zkoumal dělení buněk, první pozoroval üfjjrüf/Jü^üffjyj ^sIVbĺJJpojB/fj mitóza a chromatin El První představy o struktuře genomu Dlouhou dobu se vědci domnívali, že nukleová kyselina v jádře buňky je rozprostřena náhodně všude se stejnou pravděpodobností. Pozorování mitotických chromosomů však vedlo již koncem 19. století některé badatele k závěru, že také v interfázi si mohou chromosomy uchovat svou identitu (genetickou a strukturální) (Rabi 1885, Boveri 1888). Theodor Boveri: dědičnost je vázána na chromosomy (1887), po znovuobjevení Mendlových zákonů Hugo de Vriesem (1900) pokračuje ve výzkumu dědičnosti Základní poznatky o struktuře genomu Primární a sekundární struktura DNA Nukleosom a chromatinové vlákno Chromosomy a génom Primární a sekundární struktura DNA Řetězec fosfát-cukr Dvojice baží Watson a Crick, 1953 Nukleosom DNÄ^HHIhiston^B ^^^||^^g^« ^1 6 nm Nukleosomove jádro (oktamerní komplex histonů) Roger Kornberg, 1974 Chromatinové vlákno 30 nm 6-8 nukleos. 11 nm Histon H1 6 nm Nukleosom Spojovací DNA Nukleosomove jadro DNA, nukleosomy, chromatin, Chromosom a genom Chromosom Genom v jádře Buňka Chromati nové vlákno Nukleosomy DNA Metodická část Techniky používané pro studium struktury lidského genomu Buňky a jejich fixace FISH a 3D-FISH In vivo techniky (SRL, GFP) Kombinované značení Konfokální mikroskopie Analýza obrazu luorescen •um situ H Chromosomova DNA A T C G T A G C A T T A ÍÄ~| De natu race DNA próba (sonda) Hybridizace ž Druhy sond pro FISH a b Chromosomy obarvené FISH technikou 3D-FISH a konfokalni mikroskopie Maximální obraz Všech řezů Galerie optických řezů 3D reconstrukce CT Weierich et al., (2003) in press Značení buněk metodou SRL (scratch replication labeling užitím nukleotidů konjugovaných s fluorochromem ■ * $ * (SRL on neuroblastoma cells witl - fixed 30 after labelling) Schermelleh et a. (2001) Chromosome Res. 9:77-80 Vizualizace vazebných míst proteinu )NA in vivo pomocí GF Do buňky se vloží plasmid kódující daný protein konjugovaný s GFP Chromosomová DNA Syntéza konjugo-vaného proteinu 3 rote i n se váže na cílová místa v DNA, Která potom zeleně fluoreskují c T G A [r G A C T A A C T G A T T G A C T A SRL pomocí Cy3-dUTP a segregace chromosomových teritorií u jader HeLa buněk s histonem H2B konjugovaným s GFP (zelená) 1st cycle 3rd cycle after at least 6 cycles Sekvenční vizualizace užitím imunochemických a FISH technik MR:000G:000B:050X:448 H ^''l'l'IJ'l'l'lil'l'l't!* -inlxll protilátek) Topoisomeráza alfa 2.značení užitím hvbridizace IjaiRiOOO G:000 B:000 X:40 Y:39 Tentorium HSA17 Cytometrie s vysokým rozlišením (automatizovaná konfokální mikroskopie) ZEISS A100+ CARV LEICA + CSU-10a m oftware pro snímání obrazu a jeho analýzu Umožňuje nastavení řady uživatelských parametrů pro snímání (pozice na sklíčku, meandrovité snímání, počet řezů, krok vertikálního posunu, počet a druh fluorochromů, rozsah intenzit apod.) Analýza se provádí buď manuálně nebo automaticky. Při automatické analýze lze obvykle zadat řadu parametrů pro segmentaci obrazu a 3D analýzu signálů Automatická analýza obrazu Automatická an; Signal attributes: Hybridization #1 Probe #2 Signal type: Gene X\ 693.21 V: 570.92 Z: 45.00 dX\ 4.83 dY: 6.61 dZ: -24.20 %R: 24 Intensity: 63 Height: 51 Size: 38 FWHMx: 0 FWHMy: 0 FWHMz: 0 Intensity criterion: 2 of 2 Height criterion: 2 of 2 Size criterion: 2 of 2 Do you want to delete this signal? Ano [f Ne j Chromosomy Uvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomu (klasika, FISH) Významné elementy chromosomu CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Klasické barvení chromosomu A \ 3 ; • t čaša ^ Chromosom barvený Giemsou Lidské chromosomy obarvené pomocí multicolor FISH (I u II li It IIU ^ -r ii A -i.i ii i -T H ll tt « *•» ti M M M X Y Významné sekvence na chromosomech INTERPHASE l-ulomiFpí — rtpllcacton — origin csnlrumtiru — II 1 JWilO£l£ I--------------------1 INTERPiiA^r *yy* acrt tni ul m^Dticfipindlfr djplL-atcd CllttjriLLtWiri#4 >n sepsíBta celhs m Chromosomová teritoria (CT) První experimenty, které vedly k závěru, že chromosomy se nacházejí v jádře v podobě ohraničených domén, byly pokusy T. Cremera v létech 1982-1984. Zavedení FISH podstatně urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze, tak v interfázi. ľb 10 jj-m d ^__ /i Xa é* y 10 jam 1------■------1 1--------------1 Funkční uspořádání genomu v jádře Jadérko 'J i J y^-- I / Chromatinov vlákna ^UTM1 X > Chromosom Prot komplex Jaderne pory Transkripce Chromosomy Uvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomu (klasika, FISH) Významné elementy chromosomu CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Struktura CT - CT je tvořeno subdoménami Amir r► cjr=35 20 40 60 80 0.14 i IGH 0.12 HL-60 0.10 0.08 0.06 / 9 % 0.04 0.02 0.00 / s =2.28 \ R0=60 \ Gr=30 20 40 60 80 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 \ 0.02 0.00 c-MYC HL-60 s =1.22 R0=72 cjr=28 ABL I Go-lymphocytes 100 0 20 40 60 80 IGH B-lymphocytes Gr=36 100 0 20 40 60 80 c-MYC Go-lymphocytí 20 40 60 80 100 0 Radial distance [%] 100 100 20 40 60 80 100 Radial distance [%] Radiální uspořádání chromosomů v jádře (genově bohaté a časně se replikující oblasti ( a genově chudé a pozdě replikující oblasti (zeleně) Two color replication labeling of SH-EP N14 cells with and FITC-dUTP Schermelleh et a. (2001) Chromosome Res. 9:77-80 Uspořádání chromatinu homologního k lidským chromosomům #18 a #19 se u lymfoidních buněk zachovalo v průběhu evoluce vyšších primátů 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Marmoset (CJA) 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 Human (HSA) i n = 31 - 1 : i -I..........\.........\--j/\;.........j-^xf".......ly^s \ T--^-------------i--------------1--------------1--------------1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 n = = 38 J— .........*:..........-i.....-yf i..........\........^^r..\ V" xT v-......\.........í-H- i------------i------------ŕ^^~~* i Wk 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ------- HSA #19 homologous chromatin — HSA #18 homologous chromatin DNA-counterstain Tanabe et al. (2002), PNAS 99: 4424-9 Distribuce časně se replikujícího chromatinu microchromosomu a pozdně se replikujícího chromatinu makrochromosomu v interfazi kuřecích buněk a embryonálních fibroblastu a neuronů V) O macro- medium microchromosomes 2,5 2 1,5 Ä 1 o o 1 Q 1 ■♦3 ■2 2! 0,5 0 n s :28 T T r\ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 relative radius Habermann et al. (2001) Chromosome Res. 9:569-84 Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře pro různé typy buněk a různé živočišné druhy (radiální distribuce) Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů - výpočet a porovnání s experimentem Vazba genetických elementů (CT) mezi sebou Genom se příliš nehýbe Uhlové distribuce Rozdělení úhlů mezi spojnicemi střed jádra - gen pro homologní dvojice genů. Jeden z genů dvojice leží na ose x, druhý je v ploše obrázku. / ■; ■ i \ \ \ / / >c A m fTf < 5 ľ li I ABL E 3. (D \ * ^nlM O C *v • \ ^ wW^^ (0 *V\\ \ ^ i"t "W Jíl Wnf éípKI^"J/MyS 9ĚP -1—» (/) TD xx ^*^\\^x§^^^ 4~/}y "ČÔ O^o^^E^Ä i_ ^^Cx^^^^^^^^^^^wí^^^^^^^^^^^^S^^^^^ (D ^^x^&xnSÄ ^^^^^MiSay^^^^^s^SS^^^^^^* -i—» (0 L"^%!^^^^^^^^^^^^^ _l ^^^^^^^^^^^^^^HtJfiy^S^^^^^^^^S^x^3 5^-3-2-1012345 Distance from the center of nucleus [^m] Rozdělení úhlů aen-stred-aen 1.5 Geny ABL, c-MYC, BCR, centromera C1 v buňkác Go-lymfocytů äH t,ů. * 0.5 tfl (Ľ 0.0 J = 1.0 03 0.5 0.0 ľ ABL 0 60 120 0 60 120 180 Angle Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře pro různé typy buněk a různé živočišné druhy (radiální distribuce) Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů - výpočet a porovnání s experimentem Vazba genetických elementů (CT) mezi sebou Genom se příliš nehýbe Vzdálenosti mezi homologními a heterologními genetickými elementy CM 3.0 2.0 1 .0 * 0.0 5 2.0 ŕ 1.0 ABL-AB L lym ABL-RARot. lym MYC-MYC lym RARo^ML lym BCR-BCR lym BCR-PML lym EWS-EWS lym ABL-BCR lym TP53-RARa lym Dys-Dys 0.0 0 40 80 120160 0 40 80 120160 0 40 80 120160 0 40 80 120160 0 40 80 120160 200 Distance in %of radius Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře pro různé typy buněk a různé živočišné druhy (radiální distribuce) Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů - výpočet a porovnání s experimentem Vazba genetických elementů (CT) mezi sebou Genom se příliš nehýbe Polohy dvou genů na chromosomech 9 a 22 Vzdálenosti dvou genů na heterologních chromosomech Chromosomy 8 a 22 Chromosomy 9 a 22 O Go-lymfocyty Go-lymfocyty o C ■Q o "O "O > (0 i_ Q_ 0.03 -0.02 -0.01 - ř 1 v\ C .Q O ■u O Q. ■u > L. Q. 0.03 : 0.02 -0.01 : 0 00 - • T V / \ / •••».. l l l l l l l ifl l l l l l l l l l l l l l l l l l l lTl l MIH í 0.00 —111111111111111111 f 1111111111111111111111111111111 0.0 0.5 1.0 1.512.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5. 0 VbVV i 1*1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.0 0.511.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Minimální vzalenost lokusůl Minimální vzdálenost lokusu pro pro chromosomy 8 a 22 chrorposomy 9a 22____________ Typické pro řadu dvojic genů a buněčných typů ABL a BCR geny v Go-lymfocytech Vazba r Geny RET a H4 v buňkách štítné žlázy nezi genetickými lokusy Vazba mezi geny iH Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze Oh:00 ' 14h:00 nuclear volume: 1200 |jm3 0h:30 1780 |jm3 12h:30 Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 160:685 o o s (O 14 -I 12 10 8 6 4 2 J 0 normalized distances Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 160:685 0:00 T------------1----- 2:00 4:00 6:00 8:00 10:00 12:00 time [h] A(max-mir 'CT1-CN 0.91 CT2-CN 1.19 CT3-CN 0.73 •CT4-CN 0.57 mean ± SD 0.85 ± 0.27 A(max-min )[M m] CT1 ■ ■CT2 1.11 CT3- -CT1 1.04 CT3- -CT 2 1.54 mean ± SD CT 4- -CT1 1.48 1.37 ±0.25 CT 4 -CT 2 1.66 CT4- -CT 3 1.37 5793 HeLa buňky stabilně exprimující H2B-GFP Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 160:685 Jak se bude chovat nevysvicený chromatin v průběhu cyklu ? Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze Změny genomu: diferenciace, reparace, apoptóza, transformace Globální struktura u nádorových buněk Změny struktury genomu v průběhu diferenciace (Bártová et al., 2000, 2001, 2002) granulocytes Změny struktury genoi (Bártová 0.030 -i A HL60 cells RA/DMSO, 6 hours 0.025 - ...0... Q_ 0.020 - ^~ RA/DMSO, 7 days -i—> 0.015 - =/&'''*■ J2 o Q_ 0.010 - As* 0.005 - ^u / 4-i mC ^ ^y> 0.000 - ' i ' -i i i i i i i i -i i i i i i 20 40 60 80 100 Center-to-gene fractional distance, r [%] o_ >i !5 co -Q o 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 -j 0.000 HL-60 control RA/DMSO, 6 hours RA/DMSO, 7 days _dd1 i—i—i—|—i—i—i—|—i—i—i—|—i—i—i—|—i—i—i 0 20 40 60 80 100 Center-to-domain distance, r [% of radius] U.UUilU B I I HL-60 control 0.0020 - I I RA/DMSO, 6 hours ü- ^m RA/DMSO, 7 days ž* 0.0015 - !5 | 0.0010 - I Fl n Q_ li n 0.0005 - ■ h 0.0000 - JJ u lil I ll LkJ- ll t_ klU Změny struktury genomu po indukci fúzního proteinu PML/RARa (Falk M. et al., 2003) n I * 1 p 1 1 1 w.m: *ť * - - 1 Ví v';> \ * ■ 1 ■ * * i.. ä,- * 1 "'p "1 •h .■ bi 1 4 J 1 mm+*. ď \ # - 1 ^p p ■ +- -tf 1 * 1 •í ."Ví" 1 ■ protein PML (nuclear bodies) fusion protein PML/RARa (microspeckles) 0.030 0.025 0.020 -| 0.015 0.010 0.005 0.000 Centromere 6 Nuclear center-to-centromere distances Centromere 6 Centromere-to-centromere distances 0.030 -i Centromere 9 0.025 Nuclear center-to-centromere distances Centromere 9 0.025 -| Centromere-to-centromere distances 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 Centromere 17 Nuclear center-to-centromere distances ii \h 0.030 n Centromere 17 0.025 -| Centromere-to-centromere distances 0.030 n TP53 gene 0.025 0.020 0.015 H 0.010 0.005 0.000 Nuclear center-to-gene distances M rii ňL 0 20 40 60 80 100 Distance in % of radius 0.030 n TP53 gene 0.025 -j Gene-to-gene distances 0.020 ] 0.015 \ 0 50 100 150 2 Distance in % of radius 75 73 71 | 69 67 | 65 ML-1 Centromere 6 70 t 68 66 64 62 ML-1 Centromere 9 105 -i 102 -| 99 -96 -93 -90 - ML-1 Centromere 6 99 -i 96 -| 93 90 87 84 ML-1 Centromere 9 Time after irradiation (h) B 72 i 70 68 66 64 62 J U937 Centromere 8 U937 Centromere 9 102 -99 -96 -j 93 -] 90 -| 87 U937 Centromere 8 105 102 99 -j 96 -J 93 -| 90 U937 Centromere 9 Time after irradiation (h) Změny struktury genomu v průběhu apoptózy Fragmentace CT 11 (zobrazeno CT, centromera a překryv obou obrazů) Apoptická tělíska a rozpad CT 21 Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze Změny genomu: diferenciace, reparace, apoptóza, transformace Globální struktura u nádorových buněk Radiální rozdělení genetických lokusů v buňkách HL-60 a v buňkách střevní tkáně Spatial distributions of the BCR, ABL and c-MYC genes in HL-60 Spatial distributions of the BCR, ABL, and c-MYC genes in colon cells Střevní tkáň SS!!* N s i 5 I « § i 11 1 f Vzdálenost signál u od střed u jádra [ %] *~ Vzdálenost signálu od středu jádra [%] Mean values of radial distributions: 45.0±2.2% (ABL), 42.3±2.6% (BCR), 60.8±0.7% (c-MYC), 56.9±1.3% (cenl), 61.5±1.4% (cen 8) a 65.8±1.0% (cen 9). The parameters do not differ significantly for HL-60, HT-29 and colon tissue cells. Radiální distribuce fúzního genu BCR/ABL ABL-BCR distances in control and leukemic cells 0.04 Healthy donor i 0 20 40 60 80 100 Minimal ABL-BCR distance 0.10 0.09 & 0.08 CM L patient 100 Minimal ABL-BCR distance Spatial distributions of BCR, ABL, and BCR/ABL C -Q 05 -Q O 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 í D BCR D ABL D BCR/ABL nH —i-----------------1-----------------1-----------------1— 0 20 40 60 80 1001 Centre-to-gene distance [%] Radiální distribuce fúzních genů v buňkách Ewingova sarkomu Radial 3D distributions of EWS and FLI genes in human lymphocytes Radial 2D distributions of EWS, FLI and both fusion loci in Ewing sarcoma cells C/) c Q) "O CO _Q O 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 CN -to- EWS distances mean = 56.8 + 0.7 % CN -to- FLI-1 distances mean = 68.2 + 1.7 % n n 100 n 20 40 60 80 100 Centre-to-gene distance CO c % \ň CO O 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 i 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Chromosome 11 CN -to- FLI-1 distances mean = 62.2 + 1.4 % 20 40 60 80 CN -to- fusion gene distances mean = 54.3 + 1.3 % 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 100 0 Chromosome 22 CN -to- EWS distances mean = 45.4 + 1.2% i-Li i U U U L nn ■ IIIIII i^ 0 20 40 60 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 L^ o.o 80 100 0 20 40 Centre-to-gene distance 20 40 60 80 100 CN -to- fusion gene distances mean = 54.4 + 1.2% 60 80 100 Struktura lidského genomu ěry: Genetické elementy v jádrech lidských buněčných linií jsou lokalizovány přednostně v radiálních vzdálenostech jež jsou specifické pro daný element; chromosomová teritoria tudíž vykazují radiálně závislou vnitřní strukturu Nenáhodné radiální uspořádání je podobné u různých typů buněk zachovalo průběhu vývoje vyšších primátů pravděpodobně i v průběhu delší evoluce 3) Genetické elementy různých chromosomu jsou lokalizovány nezávisle na sobě, a proto jsou chromosomová teritoria v jádrech buněk lokalizována nezávisle (tj náhodně) jedno na druhém 4) Genetické elementy a tím i CT mohou být vázány k sobě; frakce buněk s vázánými elementy se může lišit v závislosti na typu buněk 5) Chromatin je v interfázi málo pohyblivý (vazba k matrici?, málo prostoru), CT nemění vzájemné polohy, ty se mohou měnit v mitóze. 6) Při diferenciaci", po ozáření při apoptóze a po indukci fúzního proteinu dochází ke změnám struktury. 7) V nádorových buňkách je globální struktura podobná avšak v něčem se může lišit.