ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody Ramanova spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy spektroskopie Principy FT Ramanovy spektroskopie Instrumentace Speciální techniky * rezonanční - RR * povrchem zesílený - SERS * rezonanční povrchem zesílený - SERRS * fotoakustický - PARS * hyperRaman * koherentní anti-Stokes - CARS * koherentní Stokes - CSRS Studované materiály VZORKY * anorganické - korozní vrstvy - povrchy pevných disků, křemík - amorfní uhlík, diamanty * organické - supramolekulární systémy - systémy na nosičích * polymery - fotolabilní materiály * biologické - in vitro, in vivo * geologické - minerály, horniny * archeologické - od paleolitu po novověk Studované materiály GEMMORAMAN - 1980 drahokamy FRESCORAMAN - 1980 anorg. barviva ICONORAMAN - 1985 org. barviva PETRORAMAN - 1995 kameny RESINORAMAN - 1995 amorf. org. m. TISSUERAMAN - 1997 tkáně CERAMORAMAN - 1998 keramika METALLORAMAN - 1999 koroze kovů VITRORAMAN - 1999 skelný stav CLIMATORAMAN - 1999 vlivy klimatu na m. Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod Ramanova spektrometrie - ANALÝZA MATERIÁLŮ - polovodiče - kontrola povrchu pevných disků, Seagate 1992 - magnetických hlav - uhlíkové materiály Analýza uhlíkatých materiálů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod Ramanova spektrometrie - ANALÝZA ropných produktů - stanovení oktanového čísla analýza automobilových olejů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod FT Ramanova spektrometrie - ANALÝZA ropných produktů - stanovení oktanového čísla - analýza automobilových olejů - stanovení obsahu alkoholu - kontrola biotechnologií - analýza ve farmaceutickém průmyslu Identifikace drog Identifikace léčiv Fluorescence Fluorescence a fosforescence Fluorescence a fosforescence * FLUORESCENCE * luminiscence s krátkým dosvitem -- spinově dovolený přechod - bez změny orientace elektronového spinu * FOSFORESCENCE * luminiscence s dlouhým dosvitem -- spinově zakázaný přechod - změna orientace elektronového spinu * možný díky spin-orbitální interakci Fluorescence a fosforescence * DOBA ŽIVOTA EXCITOVANÉHO STAVU -- kinetika "zániku" excitovaného stavu * INTENZITA fluorescence a fosforescence -- KVANTOVÝ VÝTĚŽEK * počet vyzářených fotonů vůči počtu absorbovaných - VLIV NEZÁŘIVÝCH PROCESŮ - intra- a inter- molekulárních Fluorescence a fosforescence * STRUKTURA MOLEKULY -- dvojné vazby - aromáty, konjugované C=C -- heteroatomy - C=O, dusíkaté heterocykly -- VLIV SUBSTITUENTŮ - -OH, -NO, -NO[2] ... -- RIGIDITA struktury p-elektronového systému -- CHELÁTY * MEZIMOLEKULOVÉ INTERAKCE -- především zhášení luminiscence -- vliv pH, teploty, viskozity, polarita rozpouštědla Fluorescence a fosforescence * MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER -- spektrofluorimetr MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence Fluorescence a fosforescence * MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER -- spektrofluorimetr * zdroj záření - xenonová výbojka - nízkotlaká rtuťová výbojka * křemenné kyvety * mřížkové monochromátory * detektor - fotonásobič -- excitační a emisní spektra * excitační - změna vlnové délky excitujícího záření konstantní l emisního toku * emisní - fixovaná l excitujícího záření proměnná l emisního toku Fluorescence a fosforescence * STACIONÁRNÍ SPEKTRA -- knihovny spekter * charakteristická spektra polyaromatických uhlovodíků * charakteristická spektra fluorescenčních indikátorů * ČASOVĚ ROZLIŠENÁ SPEKTRA -- měření doby života excitovaných stavů * snazší u fosforescence * obtížnější u fluorescence - studium přenosu energie Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra - pásové spektrum - malý počet širokých pásů - kvantový výtěžek fluorescence - samoabsorpce - zhášení rozpouštědlem či "zhášedly" STANOVENÍ NÍZKÝCH OBSAHŮ PŘEDEVŠÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra PŘÍMÉ METODY - stanovení PAH - stanovení hemoproteinů - stanovení vitamínů - stanovení steroidů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra NEPŘÍMÉ METODY - tvorba chelátů - např. s morinem - stanovení hliníku - stanovení aniontů na principu zhášení fluorescence - stanovení na základě reakce provázené vznikem fluoreskujícího produktu Kvantitativní spektrometrie Klíčový požadavek - vyjádřit VZTAH MEZI KONCENTRACÍ (OBSAHEM) ANALYTU a SPEKTRÁLNÍ VELIČINOU - matematické vyjádření - experimentální kalibrace a validace (externí standardy, metoda standardního přídavku) SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- absorpční metody -- emisní metody -- rozptylové metody -- reflexní metody Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda kalibrační křivky (external standards) -- připravíme sérii kalibračních roztoků stanovovaného analytu, pokrývající zamýšlený koncentrační rozsah -- snažíme se, aby bylo stejné složení matrice jako u vzorku -- předpokládáme, že vliv matrice je zanedbatelný -- (když je rozsah koncentrací analytu omezen, vystačíme třeba i s dvěma standardy - "pod" a "nad" vzorky) Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda standardních přídavků (internal standards) -- použitelná v případě, že je nemožné potlačit interference matrice -- ke změřenému vzorku je přidáno malé množství roztoku standardu a stanovení se opakuje za maximálně možných stejných podmínek -- metoda je mnohem náročnější na množství práce, vhodná pro ověření vlivu matrice Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda vnitřního standardu -- do všech analyzovaných vzorků i kalibračních (validačních) roztoků je přidáno stejné množství vhodné čisté látky odlišné od analytu -- jako kalibrační křivku vynášíme poměr odezvy analyt/standard proti koncentraci analytu ve standardních roztocích -- vnitřní standard by měla být látka podobná analytu, jejíž signál však neinterferuje se signálem analytu Kvantitativní spektrometrie ATOMOVÁ EMISNÍ spek. -- emisní metoda ATOMOVÁ ABSORPČNÍ spek. -- absorpční metoda MOLEKULOVÁ spek. UV, vis -- absorpční metoda, (reflexní metoda) -- luminiscence -- emisní metoda NIR -- absorpce, reflexe MIR, FIR -- absorpce, reflexe Raman -- rozptyl NMR spektrometrie, hmotnostní spektrometrie Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- pro absorpční metody - absorpce fotonů -- závisí na množství excitovatelného analytu DŮLEŽITÉ FAKTORY - vstupní tok záření - tloušťka absorbující vrstvy - absorpční koeficient - napierovský, dekadický - molární absorpční koeficient - - napierovský, dekadický Kvantitativní spektrometrie - vztah k tloušťce vrstvy Kvantitativní spektrometrie - vztah ke koncentraci Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- pro absorpční metody - ABSORBANCE DŮLEŽITÉ FAKTORY - vlnová délka vstupního záření - eliminace jiných optických jevů - rozptyl, odraz, lom, fluorescence ... - eliminace saturačního efektu - směs analytů Kvantitativní spektrometrie ABSORPČNÍ METODY - efekty ovlivňující hodnotu molárního absorpčního koeficientu DŮLEŽITÉ FAKTORY - závislost na vlnové délce vstupního záření - chemické reakce analytu - mezimolekulové interakce s rozpouštědlem - mezimolekulové interakce s jinými analyty - vliv teploty na stabilitu analytu Kvantitativní spektrometrie ABSORPČNÍ METODY - ABSORBANCE - neměříme před a za vzorkem, ale SE VZORKEM a BEZ VZORKU - jednopaprskové a dvoupaprskové uspořádání - pásové spektrum - výška píku - plocha píku - KOREKCE POZADÍ - vlivy matrice, další vlivy Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- emisní metody - emise fotonů -- závisí na množství excitovaného analytu EMITOVANÝ ZÁŘIVÝ TOK úměrný KONCENTRACI analytu - celkové množství analytu ve vzorku - způsob excitace - možnosti nezářivé deexcitace - rušivé emisní procesy - rušivé absorpční procesy (samoabsorpce) - závislost na vlnových délkách Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- reflexní metody - počet odražených fotonů úměrný koncentraci -- závisí na množství ozářeného analytu - celkové množství analytu ve vzorku - reflektivita vzorku a dalších materiálů - absorpce záření během odrazu - lom dopadajícího záření / totální odraz Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA -- rozptylové metody - počet rozptýlených fotonů úměrný koncentraci (Ramanův rozptyl, nefelometrie) - zeslabení transmitovaného toku záření (turbidimetrie) -- závisí na množství excitovaného (ozářeného) analytu - celkové množství analytu ve vzorku - způsob excitace - rušivé emisní procesy - LUMINISCENCE Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ DATA vs. KONCENTRACE - kalibrace, validace, měření neznámých vzorků - zpracování dat - regresní metody - postupy kalibrace - sada nezávislých roztoků - metody standardního přídavku - zpracování kalibračních dat - jeden analyt - více sledovaných analytů Kvantitativní spektrometrie Zpracování kalibračních dat - jeden analyt - více sledovaných analytů - univariátní a multivariační metody - zpracování úseků spekter či celých spekter - analýza složitých směsí Kvantitativní spektrometrie * CLS - classical least squares * ILS - inverse least squares * MLR - multiple linear regression * (PCA - principal component analysis) * PCR - principal component regression * PLS1 - partial least squares 1 * PLS2 - partial least squares 2 Regrese CLS * klasická metoda nejmenších čtverců - "K-matrix" * předpoklad platnosti Lambertova - Beerova zákona při všech vlnových délkách (frekvencích) - absorbance je funkcí koncentrace * chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení absorbancí * použitelná i pro celá spektra * všechny komponenty musí být známy a zahrnuty do kalibrace Regrese ILS * inverzní metoda nejmenších čtverců - "P-matrix" * předpoklad platnosti inverzního Lambertova - Beerova zákona pro všechny koncentrace - koncentrace je funkcí absorbance * chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení koncentrací * použitelná pro omezený počet vlnových délek * komponenty nezávislé, postačuje znalost jedné složky v kalibračních směsích Regrese PLS * ortogonální transformace dat do systému souřadnic označovaného jako hlavní komponenty - PC - redukce počtu potřebných souřadnic