SLEDOVÁNÍ LÁTKOVÉ PŘEMĚNY A FUNKCE ORGÁNŮ POMOCÍ RA IZOTOPŮ I ALTERNATIVNÍCH METOD PROF. RNDr Richard PETRÁSEK, CSc. Přírodovědecká fakulta MU Brno 2006 I. ÚVOD Sledování přeměny látkové, její úrovně a jejích změn pod vli- vem nejrůznějších fyziologických (věk, pohlaví, teplota, výživa, a pod.) i patofyziologických (např. různá onemocnění) podmínek představuje jednu z nejdůležitějších otázek srovnávací fyziologie. Pokud chceme sledovat funkci orgánů a v nich probíhající přeměnu látkovou, stojí před námi poměrně složitý úkol, vyžadující většinou porušení integrity organismu. Pro sledování přeměny látkové můžeme předně použít výsled- ného, celkového ukazatele - např. přibývání množství bílkovin, stej- ně množství glykogénu či tuku v těle a pod. Uvedený přístup je v experimentu možný tím způsobem, že po určité době či v určitých časových intervalech sledujeme hladinu určité látky. Tato metoda je omezena možnostmi stanovení - vážkovým stanovením, fotomet- rickým stanovením a podobně. Pokrok představuje stanovování určitých výchozích látek resp. konečných produktů v jednom oddíle těla, který je přístupný i opa- kovaným odběrům, tj. v krvi. Tímto způsobem je možné nejen na zví- řecích modelech, ale i u člověka, stanovovat hladinu různých látek - např. glukózy, bílkovin a jejich frakcí, podobně různých lipidových látek. Stále však zůstáváme na úrovni sledování výsledků, ale niko- liv jednotlivých kroků těchto přeměn, většinou v omezené míře mů- žeme sledovat skutečně dynamiku dějů. Tento přístup má však stá- le svoji důležitost, např. dusíková bilance, tj. analýza přívodu du- síku a jeho vylučování. Dalším rozvojem fyziologických a biochemických metodik se mů- žeme od úrovně celého organizmu dostávat na úroveň orgánovou (studium izolovaných orgánů), buněčnou (tkáňové kultury) až sub- buněčnou, tj. až ke studiu reakcí v buněčných orgánech a jednotli- vých enzymových systémech. Stále však setrváváme ve stadiu, kdy sice známe vstup a výstup, neznáme ale celý děj. Nemáme možnost se podívat, bez porušení integrity organismu, pod povrch - podívat se na činnost jednotlivých orgánů a na průběh jednotlivých přeměnných pochodů v nich. Proto bylo vždy cílem vědců označit si nějakým způsobem urči- tý metabolický děj a potom, podle tohoto značkovače, sledovat dal- ší osud této látky, sledovat v dynamice i činnost a celkový stav jed- notlivých orgánů a pod. Tento požadavek dokonale splnily neradio- aktivní a zejména radioaktivní izotopy prvků, které se účastní v me- tabolických pochodech a sloučeniny těmito izotopy označené. Stejného principu lze použít i pro sledování velikosti a funkce or- gánů. V našich skriptech chceme podat informaci o užití zejména radio- aktivně značených látek pro sledování přeměny látkové a její dyna- miky, pro metabolismus důležitých látek či pro činnost jednotlivých orgánů. Užití radioaktivních či stabilních izotopů však není jedinou možností volby pro tyto účely, proto vždy uvádíme i hlavní alterna- tivní metodiky. Vzhledem k tomu, že specialisté ve srovnávací fyziologii často pracují i ve zdravotnických zařízeních, jsou uváděny v různých čá- stech skript i pasáže týkající se možnosti stanovování různých pa- rametrů látkové přeměny u člověka. Předpokládáme alespoň bazální znalosti o radiochemii, proto jsou příslušné teoretické pasáže krátké a někdy úmyslně zjednodu- šené. Stejně tak skripta předpokládají určité znalosti z biochemie a fyziologie resp. patofyziologie. Ve skriptech si postupně probereme: - základy o stavbě atomů - izotopy stabilní a radioaktivní - druhy a podstata jednotlivých typů radioaktivního záření, - přirozené a umělé jaderné přeměny - principy metod se stabilními a radioaktivními izotopy a malá hi- storie jejich vývoje - základní podmínky pro užití RA izotopů - (výroba těchto izotopů a příprava značených sloučenin) - možnosti měření rozpadu RA izotopů (hlavní typy přístrojů pro měření RA izotopů včetně vyhodnocovacích postupů) - v dalších částech skript si v kostce probereme možnosti metodik využívajících RA izotopy pro sledování činnosti jednotlivých důle- žitých orgánů a funkcí v organismu a to přístupy in vitro a in vivo - podrobněji si pak řekneme o RIA metodikách a o hlavních meto- dách ke sledování metabolismu - nakonec si probereme příklady toho, jak lze pomocí značených lá- tek sledovat určité problémy přeměny látkové II. ZÁKLADY PRÁCE S IZOTOPY - RADIOAKTIVNÍMI I STABILNÍMI Dříve, než si podrobněji uvedeme jednotlivé možnosti sledová- ní funkce orgánů a přeměny látkové, je třeba si krátce zopakovat některé údaje o stavbě atomů, stabilních i radioaktivních izotopech a o jaderných přeměnách. Pak si můžeme již říci o principech pří- pravy takových látek, které nám umožní sledovat, a to v průběhu času (v určité časové dynamice) sledovat pochody látkové pře- měny resp. funkce jednotlivých orgánů. Nakonec pak zbývá pro- brání možností měření pochodů, které to stanovení umožňují. Nezbytné je rovněž říci si něco o hygienických problémech, spjatých zejména s užitím radioaktivních (RA) izotopů. II.1. Základní údaje o stavbě atomů a jaderných přeměnách II.I.1. Základní pojmy Úvodem si probereme či zopakujeme některé základní pojmy: MOLEKULY - nejmenší částice látky, které zachovávají její složení a chemické vlastnosti. ATOMY - částice, z nichž se skládají molekuly. Původně se předpo- kládalo, že jsou dále nedělitelné, postupně se prokázalo, že mají řadu dalších částic. Pro začátek - pro pochopení látky, kterou budeme probírat, stačí 3 základní (zájemci o podrobnější a také správnější údaje o stavbě atomů odkazuji na speciální skripta či učebnice, např. Navrátil (1988). Zjednodušenou představu o stavbě atomu viz obr. č. 1. Množství elektronů = množství protonů = protonové číslo - Z (dříve atomové číslo). Množství protonů + neutronů = hmotnostní číslo - A (dříve atomová váha). Příklady: vodík 1H1 1 P + 1 E helium 4He2 2 P(+ 2 N) + 2 E lithium 7Li3 3 P(+ 4 N) + 3 E P.... proton, E.... elektron, N.... neutron Chemické vlastnosti neurčuje hmotnostní číslo, ale protonové číslo. Stejné chemické vlastnosti mají tedy i atomy se stejným počtem elektronů (a tedy i protonů), ale odlišným počtem neutronů. Atomy, které mají rozdílné hmotnostní číslo, ale stejné protono- vé číslo, nazýváme - izotopy. Příklady: vodík se vyskytuje ve 3 izotopech: 1H1 2H1 3H1 deuterium tricium podobně uhlík - 12C6, 13C6, 14C6 Uvidíme později, jak se tyto izotopy dále dělí podle toho, zda podléhají radioaktivnímu rozpadu či nikoliv, tj. zda jsou stabilní či radioaktivní (tj. takové, v jejichž jádře dochází k přeměnám). Velice brzy po sobě byly koncem 19.tého století učiněny dva velké objevy: v r. 1895 byly objeveny tzv. Rontgenovy paprsky, v r. 1896 pak Becquerelem radioaktivita. Becquerel zjistil, že uranové soli vyzařují zvláštní paprsky, pronikající černým papírem chránícím fotografickou desku před světlem. Učení o radioaktiv- ních prvcích bylo dálo rozpracováno slavnou Marií Curie ­ Sklo- dowskou a jejím manželem, Pierrem Curie, kteří izolovali z urano- vých solí dva nové prvky - radium a polonium. Při studiu nového záření si položili otázku : je toto záření jed- notné a jaká je jeho povaha - viz obr. č. 2. Pronikavost jednotlivých typů záření: alfa - záření : zachyceno papírem beta - záření : olovem o síle 1 mm či hliníkem o síle 4 mm zachy- ceno gama - záření : proniká dále přes tuto překážku Povaha jednotlivých typů záření: alfa - záření : jsou to částice mající protonové číslo 2 a hmot- nostní číslo 4 (jádra helia) - potvrzeno Rutherfordem beta - záření : jsou to elektrony (záporný náboj 1, hmota 1840 krát menší než jádro vodíku) gama - záření : jsou to elektromagnetické vlny, fotony (atomy zářivé energie, liší se navzájem obsahem energie) II.1.2 Přirozené jaderné přeměny Přirozené jaderné přeměny patří do přeměn, kterým podlé- hají jádra atomů. Jádro podléhající přeměně může být radioak- tivní buďpřirozeně nebo uměle. Jako přirozenou radioaktivitu bereme jaderné reakce, které se odehrávají bez zásahu člověka. Pro jednotlivé základní typy jaderných přeměn uvádíme násle- dující příklady : a) alfa - rozpad Radium, uzavřené v hermetické nádobě tam vytvářelo dva prv- ky, a to částice helia a radonu. Jde tedy o alfa - rozpad, který lze zapsat následujícím způsobem: 226 4 222 Ra --- He + Rn 88 2 86 Můžeme udělat závěr, že při alfa - rozpadu z jádra izotopu vzniká jádro jiného izotopu, jehož protonové číslo Z bude menší o dvě jednotky a hmotnostní číslo A o 4 jednotky nižší než výchozí prvek. b) beta - rozpad Draslík (K) se rozpadá odlišně, než radium, a to na elektron a na atom vápníku, jak ukazuje následující vzorec: 40 40 K ---- e + Ca 19 20 Z tohoto příkladu můžeme vidět, jak probíhá beta - rozpad: když jádro s protonovým číslem Z a hmotnostním číslem A vy- mrští elektron, vzniká nový izotop, jehož Z je o 1 jednotku větší a A je stejné jako u výchozího prvku. c) gama - rozpad Částice (kvanta) vlnění nejsou nabita a jejich hmota je malá, proto jádro při vyzáření nemění ani protonové číslo Z ani hmot- nostní číslo A. Nedochází tedy - na rozdíl od rozpadu alfa či beta - vlastně k jaderné přeměně. Jádro, aby uvolnilo kvanta , musí být v excitovaném stavu a návrat k normálnímu stavu je doprovázem zářením gama. Zmenšuje se přitom energie jádra. V excitovaném stavu jsou jádra obyčejně po alfa či beta roz- padu, proto gama - záření většinou doprovází alfa či beta roz- pad. II.1.3 Umělé jaderné přeměny Již jsme si uvedli, že v přírodě se vyskytují izotopy s ne- stálými jádry samovolně se rozpadajícími. Pokusy o umělou ja- dernou přeměnu přirozeně stálých jader byly neúspěšné až do r. 1919, kdy Rutherford po bombardování jádra dusíku částice- mi alfa dosáhl rozštěpení jádra tohoto prvku a jeho přeměny na jiný prvek, kyslík. 14 4 1 17 N + He ---- H + O 7 2 1 8 Zdrojem alfa částic bylo polonium, tedy radioaktivní prvek, tyto částice vyzařující. Později byla obdobně jako dusík užita ji- ná lehká jádra prvků, např. F, Si, S či K. Všechny umělé jaderné reakce probíhají ve dvou etapách: - do jádra proniknou částice alfa a tím vznikne nové přechod- né jádro - přechodné jádro uvolňuje proton (či jinou částici) a mění se v nové jádro 19 4 18 N + He ---- F 7 2 9 18 1 17 F ----- H + O 9 1 8 Vznik umělých radioaktivních jader --------------------------------------------------- Problém přeměny neradioaktivních jader na radioaktivní vyře- šili až v r. 1934 Frederic a Irene Joliot - Curie (dcera a zeť Marie Curie). 27 4 30 Al + He ----- 1no + P 13 2 15 30 30 P ----- e+1(positron) + Si 15 14 (positrony se liší od elektronů pouze znaménkem náboje, posit- ron není obsažen v jádře, vzniká přeměnou protonů na neutron). Uměle bylo získáno postupně asi 300 stabilních izotopů a 700 radioaktivních. II.1.4 Princip užití metod s radioaktivními a stabilními izotopy Po chemické stránce existují stejné vlastnosti stálých i radio- aktivních izotopů (mají stejné protonové číslo!!). Chování radio- aktivního (RA) izotopu se tedy neliší, jeho pohyb v organismu však lze stopovat tím, že zachycujeme záření vzniklé při jejich jaderných přeměnách. Proto nám RA izotopy umožňují zkoumat přeměnu látek, jejich zadržování v organismu (léky!) a pod. Obdobně je užíváno v některých studiích i izotopů stabilních, jejich detekce se však děje na základě jejich odlišné hmotnosti (hmotové spektrografy). I.1.5 Historie užití RA izotopů v biologii a lékařství Izotopová (značkovací) metoda, která později umožnila pod- robně a citlivě sledovat metabolické pochody, pochází již ze za- čátku 20- tého století, ještě před I.světovou válkou.Tato metoda je spojena s Ústavem pro anorganickou a fyzikální chemii ve Víd- ni (při prvním jejím užití šlo o rychlost výměny atomů mezi pevný- mi látkami a solemi) a se jménem Hevesyho. Až v r. 1923 byla metodika užita ke sledování živých systémů, opět Hevesym, který studoval přijímání olova rostlinami. Hevesy se i v dalších letech se svými spolupracovníky a jinými autory sou- středil na metabolismus olova, vizmutu, polonia a thoria - tedy prv- ků s přirozenými RA izotopy. Abychom neupřeli prioritu, pokud jde o sledování živých orga- nismů pomocí RA izotopů, tak již v r. 19O4 byly prováděny poku- sy se zvířaty pokud jde o ukládání polonia a radia (např. London), tyto studie měly však toxikologický ráz, nešlo tedy o sledování metabolismu těchto látek. Hevesy tedy má skutečný primát pokud jde o metabolická sledování. Další rozvoj značkovací izotopové metody nastal v polovině třicátých let - umožnil to objev deuteria a zejména objev umělé radioaktivity. Tím bylo umožněno rozšířit studium z těžších RA izotopů na lehčí, zapojené přímo do metabolických pochodů - H, C,S atd. Je příznačné, že opět se uplatnil jako první Hevesy - jde o práce s tzv. těžkým vodíkem, deuteriem, pak následovaly prá- ce s fosforem. Pravý rozvoj izotopové metodiky nastal po II. světové válce. Jaderný reaktor a cyklotrony umožňovaly produkci levných radio- nuklidů, zdokonalují se měřící aparatury - od jednoduchých Gei- ger-Müllerových trubic se vyvíjejí v polovině padesátých let až scintigrafické kamery. V této době, tj. v padesátých létech, se rozbíhá také užívání i- zotopů u nás - v r. 1951-6O vznikají první biologická a lékařská pracoviště užívající izotopy - na ČSAV, na VŠ, zejm. LF a jinde. V současné době se dělá cekem, včetně vyšetření in vitro, více než 1 milion vyšetření za rok pouze na lékařských ústavech, da- lší vyšetření pak probíhají na biologických, zemědělských či ve- terinárních pracovištích. II.1.6 Radioaktivní rozpad Rozpadem se množství RA atomů stále zmenšuje. Množství aktiv- aktivních atomů ubývá podle rozpadové rovnice: Nt = delta No . lambda e N ... počet atomů (Nt v čase t, No v čase O) delta ... změna lambda... konstanta rozpadu v sekundách e ... základ přirozených logaritmů Rychlost radioaktivní přeměny je tedy dána změnou počtu ato- mů, resp. množství atomů rozpadlých za určitou dobu (sekundu) je úměrné množství daných aktivních atomů. Smysl pravidla je takový, že jestliže se z 10 000 atomů rozpadne za 1 sekundu 100, tj. 1%, pak z 5 000 atomů je to také 1%, tj. 50 atomů. Pro každý RA izotop má konstanta rozpadu jinou hodnotu, např. za 1 sekundu se rozpadá 1.35x10 na 11 atomů radia, 5.6x10 na 7 ato- mů fosforu či 1.29 x 10 na 5 atomů sodíku. Je nutno říci si něco o pojmech, které RA rozpad charakterizují : Aktivita - počet rozpadů za 1 sekundu; je tím větší, čím k vět- šímu počtu rozpadů za sekundu dochází. Aktivita (A) závisí na množství látky (N) a na konstantě rozpadu: A = N. lambda Jako jednotka aktivity se užívá 1 curie (Ci), v preparátu, který má tuto aktivitu, dochází za sekundu k 3,7 x 10 na 10 rozpadům jader. V praxi biomediciny se užívají jednotky menší a to : 1 m Ci = 1/1000 Ci = 3,7 x 10 na 7/sek. 1 u Ci = 1/1000 000 Ci = 3,7 x 10 na4/sek. V naší literatuře se používá jednotka Becquerel (Bq). V preparátu, který má tuto aktivitu dochází k 1 rozpadu jádra za sekundu. To by bylo zase příliš malá jednotka, proto se užíva- jí jednotky o 3, 6 až 9 řádů vyšší : 1 Bq = 10 na 0 rozpadů 1 kBq = 10 na 3 rozpadů 1 MBq = 10 na 6 rozpadů 1 GBq = 10 na 9 rozpadů Přepočet: 1 u Ci = 37 kBq 1 m Ci = 37 MBq 1 Ci = 37 GBq Specifická aktivita = aktivita 1 g RA látky, měří se počtem rozpa- dů za 1 sekundu v 1 g RA látky nebo počtem Ci (Bq) v 1 g RA látky. Poločas rozpadu = časový interval, ve kterém se aktivita RA prvku zmenší na 1/2 - viz obr. č. 3. Vztah mezi konstantou rozpadu a poločasem rozpadu : Čím větší je konstanta rozpadu, tím kratší je poločas rozpadu a naopak. II.2 Příprava RA izotopů a sloučenin Pro jakoukoliv práci s RA izotopy je základní podmínkou před- ně získání potřebného RA izotopu a dále pak výroba RA značené sloučeniny vhodné pro sledování určitého pochodu v organismu. II.2.1 Příprava značených izotopů Radioaktivní izotopy můžeme připravovat trojím způsobem (Di- enstbier a sp., 1989): - v jaderném reaktoru - v cyklotronu - v generátorech a) V jaderném reaktoru (viz obr. č. 4) probíhá řízená jaderná re- akce z jader přirozených RA izotopů (uran, plutonium). Uvolňují se při tom neutrony. Těmi se pak bombardují jádra přirozených stabilních izotopů a získávají se tak RA izotopy, např. 59Fe, 6OCo, 75Se, 125Xe, 169Yb, 198Au. Nebo dochází k emisi 1 p či alfa částice a získává se prvek o 1 či 2 místa vlevo v soustavě, tak získávány 14C, 32S, 32P, 35Cl, 35S. Konečně izotopy vznikají štěpením uranu, tak vzniká na pří- klad 131J, 133Xe. Výhody : možno připravit větší množství, proto levné. Nevýhody: nelze takto připravit všechny izotopy, u řady prvků je nízká specifická aktivita. b) V urychlovačích částic (cyklotron) - jaderným částicím se udě- luje vysoká kinetická energie (viz obr. č. 5). Získává se tak 67Ga, 2O1Tl, 123J, 111In. Výhoda : vysoká spec. aktivita. Nevýhoda: zpracovává se menší množství prvku a výsledné pro- dukty jsou proto drahé. c) V generátorech - v nejpoužívanější formě jde o malou chromatog- rafickou kolonku, kde je na vhodném sorbentu mateřský radionuklid a z něj se produkuje dceřinný (viz obr. č. 6). Takto se získává např. 99Mo, 99Tc (1O-15 dnů možno užívat), 113Sn, 113In (1/2 roku). II.2.2 Příprava značených sloučenin Připravené radionuklidy jsou pak užívány ke sledování stavu orgánů a přeměny látkové ve formě vhodných značených slouče- nin. Tyto sloučeniny mají nahražen buď jednotlivý atom radioak- tivním atomem (podobně to mohou být skupiny atomů) nebo se tvoří komplexy některých kationtů RA prvků s různými sloučeni- nami. Stejně jako látka bez RA izotopů se takto označená látka chová pouze tehdy, když při jejím značení nedochází ke změně struktury sloučeniny. V jiném případě vzniká sloučenina, jejíž chování může být dost podobné chování neznačené sloučeniny, existují však určité roz- díly, které musíme brát v úvahu. Nejčastějším způsobem přípravy značených sloučenin je che- mická syntéza, při čemž jedna z komponent reakční směsi je ra- dioaktivní. Pro dosažení co nejvyššího výtěžku, omezení ztrát ra- dioaktivity i z hlediska bezpečnosti práce je nejvýhodnější, aby radioaktivní látka byla použita co možná ke konci reakce. Výhod- né rovněž je, aby syntéza probíhala jednostupňově. Tímto způsobem se připravují zejména sloučeniny obsahující RA izotopy 3 H, 14 C, 35 S, 75 Se, 99 Tc, 113(či 111) In. Další možností je izotopová výměnná reakce, při které dochází k výměně radioaktivního atomu či celé skupiny obsahující radio- aktivní atom za neradioaktivní část molekuly sloučeniny. Probí- há vždy v jednom reakčním stupni a získané produkty jsou také proto připravovány ve vysoké čistotě, zpracovává se přitom i mi- nimální množství látky. Nevznikají též vedlejší produkty. Této me- tody se užívá především u halogénů - tj. 77Br a 131J - podobně je užívána i pro přípravu karboxylových sloučenin značených 13(či 14) C. V některých případech je jedinou metodou volby biochemic- ká syntéza, v úvahu pochopitelně připadá pouze u látek vyskytu- jících se v živých organismech. Může jít buď o enzymovou syntézu či o celkovou biosyntézu. V prvém případě se užívá enzymů jako katalyzátorů reakcí přivá- dějících RA látku do molekuly. V druhém je RA látka podána živé- mu organismu a izolují se pak značené látky vzniklé metabolic- kými pochody. Může jít např. o mikroorganismy, které mají potřebný RA izo- top v živné půdě, či je izotop resp. jeho sloučenina aplikována jiným způsobem (např. perorálně spolu s potravou či injekčně). Při celkové biosyntéze je specifická aktivita vzniklých RA ozna- čených sloučenin většinou poměrně nízká, protože bočními re- akcemi vzniká řada vedlejších nepotřebných sloučenin. Způsobem biochemické syntézy jsou připravovány zejména 57 Co či 60Co - kobalamin, 75 Se - methionin ale i univerzálně značená 14C - glukóza, mastné kyseliny a podobně. II.3 Měřící a vyhodnocovací postupy Snad největší rozvoj v oblasti studií s pomocí RA izotopů zaznamenaly v posledních desetiletích právě přístroje měřící (ať již in vivo či v extraktech tkání či tělních tekutin) rozpad ra- dioaktivních jader. Účinnost měření takových přístrojů se zvět- šila z původního cca 1% na hodnoty blížící se takřka 100%. Nedílnou součástí měřících aparatur (detektorů) se staly po- čítače, které měření zkvalitňují a velice rychle vypočtou nejen výsledek, ale provedou řadu statistických propočtů a hodnoce- ní kvality stanovení. Detekcí jaderného záření se zabývá dosimetrie. Ta vychází prakticky pouze buď z ionizačního nebo excitačního účinku zá- ření. Podle Navrátila (1989) patří k jejím hlavním úkolům měření aktivity radioaktivních preparátů (radiometrie) a měření dávky ionizujícího záření (vlastní dozimetrie). V zásadě mohou detekční metody zahrnovat: - tzv. proudové metody (např. ionizační komory, GM trubice) - scintilační metody (zejm. scintilační detektory) - vizuální metody (fotografické emulze). II.3.1 Historický úvod Detektory záření, které byly nejdříve užívány, byly na základě využití ionizačního účinku záření: a) Ionizační komory jsou zkonstruovány tak, že ve vzduchovém prostředí jsou 2 elektrody, nabité určitým nábojem. Působením RA záření se vzduch stává vodivým a dochází k vybíjení konden- zátoru. Rychlost vybíjení (jiná možnost : velikost ionizačního proudu) je úměrná intenzitě záření a celkový úbytek je úměrný dávce záření, která prošla prostorem ionizační komory. Na principu ionizační komory jsou založeny přístroje na urče- ní osobní dávky záření u pracovníků, na měření intenzity záření za stínícími kryty. Dále jsou ionizační komory užívány při kont- role aplikovaných dávek RA izotopů a konečně ke měření akti- vity radonu a jiných plynných zářičů - viz obr.č.7. b) U Geiger-Müllerovy trubice (GMT) tvoří obal jednu elektrodu a drát uvnitř této trubice druhou elektrodu. Trubice je evakuována a naplněna inertním plynem o nízkém tlaku. Mezi elektrodami je napětí několika set až tisíc voltů. Když vnikne částice při záření do do trubice, dojde ke vzniku napěťového impulsu, který je dále re- gistrován - viz obr. č. 8. G-M trubice se liší podle toho, jaký typ záření mají registrovat. Pro většinu zářičů jsou to silnostěnné trubice (aby jimi neproš- lo záření beta !) - kovové či celoskleněné, tloušťka stěn je něko- lik mm. Pro měkčí gama záření (např. 131J) mají GMT obalovou elektrodu tvořenou nánosem těžkého kovu. GMT pro měření beta - záření mají část povrchu zeslabenou ­ mají okénko ze slídy - tak do trubice přicházejí částice beta bez podstatného oslabení. Pro měření aktivity beta - zářičů v tekuti- nách se užívá nálevkovitých GMT. Tloušťka okénka je v každém případě odlišná u tvrdých a měkkých (např. 14C, 35S) beta ­ zá- řičů. Značně vyšší účinnost mají bezokénkové GMT, ve kterých se preparát, jehož velikost záření máme určit, dává přímo do trubice, která je proplachována inertním plynem. c) Scintilační detektor je pak založen na jevu, že záření (zvláště ga- ma) při průchodu krystalem NaJ se stopovou příměsí Tl vyvolává slaboučké záblesky viditelného světla - viz obr. č. 9. Ty se zachy- zachytávají katodou fotonásobiče, na jeho výstupu se mění na ele- ktrické impulsy. Scintilační detektory mají účinnost řádově desítky % pro záření gama a jejich různě zdokonalené formy jsou základem dnešních gama měřičů. Pro beta záření mají účinnost řádově menší, na srovnatelnou či dokonce vyšší účinnost ve srovnání se zářiči gama se u beta zářičů dostaneme pomocí tzv. scintilačních tekutin, které mají za základ organické scintilátory (antracen, toluén, dioxan). Používá se jich zejména pro měkké beta zářiče, jako je 14C či 3H a to tak, že se přidávají k měřeným vzorkům do měřících nádobek. Scintilační detektory se dají použít i pro detekci alfa záře- ní, obdobně jako pro gama zářiče se používá ale scintilátor, v případě alfa zářičů jde o ZnS s příměsí Ag. d) Fotografická detekce je založena na zčernání filmové emulze při průchodu ionizujícího záření, při čemž stupeň zčernání je závislý na intenzitě záření. O několik řádů je přitom hustota zčernání vyšší při záření Đ . Tato metoda je užívána ke sledování dávky zá- ření, kterou pracovník používající Đ - zářiče obdržel při práci s RA látkami. Speciálním užitím této metody je tzv. autoradiografie, kterou zjišťujeme např. distribuci radioaktivity ve tkáni. Rozlišujeme přitom makroautoradiografii a mikroautoradiografii. Např. při zjišťování distribuce RA zlata v peritoneální dutině podložíme na několik hodin pod nemocného RTG film, obdobně zjišťujeme takto aktivitu štítné žlázy po tyroidektomii - v obou případech jde o mak- roautoradiografii. Při mikroautoradiografii (tzv. histoautoradiografii) jsou his- tologické řezy tkání, které obsahují RA látku, překryty vrstvou fotografické emulze. Po několika dnech až týdnech je preparát s emulzí vyvolán. Pozorování preparátu pod mikroskopem nás pak in- formuje o stupni nahromadění aktivity v jednotlivých strukturách řezu. II.3.2 Některé metodické problémy měření aktivity Nejdříve je třeba si probrat některé základní pojmy spojené s měřením RA záření (podrobněji viz Dienstbier, 1989): Pozadí - četnost impulsů, které detekční zařízení zaznamenává i bez přítomnosti radioaktivního zářiče. Dáno zejména : - přirozenou RA materiálů, z nichž detektory a a jeho stínění zho- toveny - dále dáno radiační složkou: -- radioaktivitou vzduchu (Rn) -- zářením z povrchu země, ze zdí laboratoří -- kosmickým zářením Podstatného snížení pozadí lze dosáhnout obklopením stíní- cím materiálem - olovem, železem, betonem - lze ho takto snížit až na 1/10. Nežádoucí impulsy je možno omezit též tzv. diskriminací (vý- běr impulsů, které mají být zaznamenány!). Pozor na umístění detekčních aparatur v blízkosti uložení vysokých aktivit či prá- ce s nimi (týká se i aparatur s RTG zářením, betatronů a pod.). Detekční účinnost - poměr impulsů zaregistrovaných a skuteč- ně dopadlých na detektor. Vyjadřuje se v procentech, závisí na energii částic, na rozměrech a tvaru krystalu, na geometrickém uspořádání a pod. Při scintilačním měření může dosahovat až 90%, u GMT je účinnost o jeden až dva řády nižší (1-2%). Časová rozlišovací schopnost je charakterizována tzv. mrtvou dobou, tj. intervalem po průchodu jednoho impulsu, kdy detek- tor není schopen zaznamenat další impuls. To znamená, že při vysoké četnosti impulsů detektor zaznamenává méně impulsů, než jich ve skutečnosti detektorem prošlo. Za sekundu je detek- tor schopen zaznamenat max. 10 na 4 impulsů, tj. 10 000 impul- sů. Energetická rozlišovací schopnost charakterizuje schopnost de- tektoru odlišit od sebe záření dvou energeticky blízkých záření, pohybuje se od 6 do 8%. Geometrie měření - celková účinnost měření aktivity je dána též vzájemným uspořádáním vzorku a detektoru. Při in vivo měře- ní dopadá na detektor pouze část vysílaných fotonů, s rostou- cí velikostí krystalů je jich zachyceno více, ale zároveň se zhor- šuje energetická rozlišovací schopnost detektoru. Ve studno- vém detektoru lze dosáhnout až 90% účinnosti, při rozptýlení v kapalném scintilátoru je účinnost měření již téměř 100%. Chyba měření: každé měření je zatíženo chybou, danou jednak statistickým charakterem RA přeměn, jednak nestabilitou měři- če. směrodatná odchylka = druhá odmocnina N N ... počet impulsů Chybu měření můžeme snížit buďprodloužením doby měře- ní anebo snížením pozadí. Statistická chyba měření by měla být cca 1-2%, vzhledem k nestabilitě přístroje a pod. se celková chy- ba měření však pohybuje kolem 5%. Bližší poučení o výpočtu směrodatné odchylky, variačních ko- eficientů a pod. naleznete ve speciálních učebnicích, např. Roth a sp. (l962) či pokud jde přímo o oblast nukleární medicíny, pak např. v Dienstbier a sp. (l989). Vyhodnocení údajů GMT či scintilačních detektorů se provádí takto: - spočítáním impulsů za určitou dobu zjistíme relativní aktivitu, kterou porovnáváme s údaji standard, aplikované aktivity, se zji- štěnou aktivitou v jiných tkáních a orgánech a pod. - impulsy se integrují - tj.četnost impulsů převádíme na stejno- měrné napětí a velikost aktivity posuzujeme podle výchylky mě- řidla, resp. jeho zápisu Automaticky lze nastavit buď dobu, po jakou má být vzorek měřen, či naopak počet impulsů, který má být změřen a přístroj zaznamená dobu, za jakou se to stane. Je možné přístroji pře- depsat, že měření se bude dít každé 2 minuty či jiný interval. Takto je možné registrovat průběh plynule probíhajícího děje, ať již ho sledujeme v roztoku - in vitro - či v celistvém organis- mu, tj. in vivo. Poněkud odlišné problémy představuje měření aktivity v ce- lémtěle a v jeho částech nebo tzv. v roztoku, tj. v tekutinách izo- lovaných z tkání, krve a pod. Proto si je probereme zvlášť- nej- dříve měření in vitro. II.3.2.1 Měření in vitro Měření aktivity tekutých preparátů (např. krev, moč) se pro- vádí výhradně v nálevkové GMT. Tento způsob se používá pro beta zářiče s vyšším energetickým obsahem, tj. např. pro 32 P, 42 K, 86 Rb. U částic s nižším energetickým obsahem (tzv. měkké beta zářiče) se značně uplatňuje absorbce ve stěně počítače. Pro- to se užívají okénkové či bezokénkové GMT resp. ještě více scintilační detekce se scintilačními roztoky, do kterých se mě- řený vzorek přidává. Platí to především pro měření vzorků ob- sahujících 14 C a 3 H. Pro 3 H - tricium - je to prakticky jediný způsob detekce. Záření gama je detekováno s maximální účinností ve scinti- lačním přístroji s krystalem z NaJ a Tl. U kapalných vzorků se užívá tzv. dutého krystalu, který má vyhloubenu dutinu, do kte- ré se zasunuje zkumavka se vzorkem - viz obr. č. 10. Tekutý vzorek může být proměřován i pevným krystalem bez dutiny, vzorek je pak umístěn v určité vzdálenosti od krystalu. Účinnost měření je v takovém případě pochopitelně nižší, než když vzorek je umístěn přímo v krystalu. Pro měření velkých ob- jemů tekutin, ale i pevných vzorků (např. stolice), je možno k mě- ření celého objemu najednou použít klece ze 6 či většího počtu GMT na měření záření. Všechny GMT měří najednou a jejich vý- sledky se sčítají. Účinnost měření je pak srovnatelná s dutým krystalem ­ viz obr. č. 11. Pro měření kapalinových vzorků se používá též automatický vzorkoměnič, který má kromě stíněného studnového detektoru s krystalem NaJ (Tl) a elektronické aparatury navíc elektronické ob- vody, které umožňují předvolit určitý režim měření vzorků. řetězový Vzorky se před měřením umísťují do zásobníku viz obr.č.12 kazetový viz obr.č.13 on line K přístroji je připojen počítač (tj.přímo u přístroje) off line (jinde, pak je nutné výsledky měření pře- nášet k počítači, např. na disketách) Vícedetektorový systém - viz obr. č. 14. Skládá se z určitého počtu stejných detektorů (12-16 či více), tvořených studnovými scintilačními krystaly, a fotonásobičů. Na- jednou se měří např. 12 vzorků, zpracování výsledků zajišťuje po- čítač, který také koriguje rozdílnou účinnost jednotlivých detekto- rů (může se lišit až o 10%!). Detektory s kapalnými scintilátory pro měření beta ­ zářičů, - viz obr. č. 15. Vzorek se přimíchává do kapalného scintilátoru, ten podobně jako jiné scintilátory (např.scintilační krystal NaJ-Tl) převádí ener- gii ionizujícího záření na záblesky viditelného světla, které se re- gistrují fotonásobiči. Fotonásobiče detekují pouze impulsy od po- zorovaného zářiče, záznam o nich je veden do analyzátoru a do počítače. Přístroj má, obdobně jako gama-měřiče, řetězové či ka- zetové zásobníky, umožňující automatickou výměnu vzorků. U nás jsou nejpoužívanější následující scintilační tekutiny : - na bázi toluénu - např.SLT 31 či SLT 41 - hodí se pro měření vzorků rozpuštěných v organických rozpustidlech (tedy např. vzorků lipidů) - na bázi dioxanu (případně ve směsi s dalšími látkami) pro mě- ření vodných vzorků, tyto scintilační tekutiny pojmou až 5-10% vodné fáze, specielní roztoky (Brayův) jí pojmou ještě více, a to až 25% Pro specielní druhy měření užívány roztoky: - schopné pojmout ještě větší množství vody (na bázi TRITONU X) - scintilační gely (obsahující polymetylkrylát či polyakrylamid, které užívány pro práškové vzorky) II.3.2.2 Měření in vivo Měření aktivity beta zářičů se provádí (např. po aplikaci 32 P) pomocí GMT na měření beta , zejména tzv. okénkovými tru- bicemi. Tyto detektory mohou mít případně i hodně malé roz- měry (např. pro měření aktivity v očním bulbu), či jsou dokon- ce jehlové, které lze do tkáně zabodávat (např. pro měření ak- tivity v mozkové tkáni). Aktivita gamazářičů se může měřit buď celotělově či nad jednotlivými orgány: s kapalnými scintilátory pacient leží - Celotělové počítače není posunován s více zapojenými GMT viz obr. č. 16 se scint. detektory - pacient se (s velkými NaJ krystaly) posouvá V každém případě je nutné, aby celotělový počítač byl stíněn od zevního záření, dále je třeba připojení řady fotonásobičů. Or- gánová měření jsou prováděna převážně scintilačními detekto- ry s NaJ krystaly. Detektor je obložen asi 5 cm olova s otvorem umístěným proti krystalu. Uspořádání otvoru určuje směrový účinek detektoru, toto směrové stínění se nazývá kolimací. Typy kolimátorů - viz obr. č. 17. - válcový - měření probíhá ve válcovém prostoru, daném stěna- mi otvoru, po stranách je polostínový prostor (ten lze zmenšit) - složený kolimátor - se zmenšováním průměru otvoru či s pro- dlužováním délky kolimátoru klesá citlivost detektoru - kónický kolimátor - umožňuje citlivější detekci určité roviny dané sklonem otvoru Při detekci aktivity nad velkými orgány se užívá otevřených kolimátorů, které měří široký prostor. Topografické zjišťování rozložení aktivity se provádí naopak úzce směrovanými koli- mátory. Úzce směrovaný detektor se přitom pohybuje rovno- měrně v řádcích nad sledovanou oblastí - přístroji se pak říká gamagraf - viz obr. č. 18. Impulsy z detektoru jsou v určitém daném poměru reduko- vány a tištěny jako čárky, jejichž hustota podává informaci o rozložení aktivity v různých místech, příklad vidíme na obr. č. l9. Při hodnocení gamagramu je nutno brát v úvahu, že kromě aktivity sledovaného orgánu se měří zároveň aktivita orgánů nad i pod sledovaným orgánem. U většiny in vivo stanovení RA jde zejména o detekci záření vycházejícího z těla po aplikaci RA látky a sledují: - buď časový průběh aktivity radiofarmaka (či jím označených metabolických zplodin) - nebo zobrazení distribuce radiofarmaka v orgánu či celém těle (scintigrafické vyšetření) a) Pohybový scintigraf Skládá se z: - detektoru s kolimátorem - mechanického zařízení, zajišťujícího pohyb detektoru nad tělem - elektronické aparatury - záznamového zařízení Kolimátory se používají o různé rozlišovací schopnosti pro růz- né orgány. Od pohybových scintilátorů se v současné době ve světě již us- tupuje, důvodem je jejich omezená citlivost a skutečnost, že mo- hou pouze staticky zobrazovat. b) Scintilační kamera - viz obr. č. 20. detektor: elektronická zobrazovací aparatura: aparatura: osciloskop displej (počítač, analyzátor) záznam se snímá Pola- - NaJ krystal roidem nebo běžným s kolimátorem fotoaparátem; (mož- nosti záznamu na RTG fotonásobiče film - micro dot (dříve 19, nyní i více než 75) (Kolimátor mnohaotvorový: desítky tisíc otvorů s paralelními otvory) Kolimátor konvergentní : má vyšší účinnost a umožňuje zvětšení menší plochy divergentní : zachycuje velkou plochu, např. obě plíce s jedním otvorem (pin hole) Celotělová scintigrafie - je možná: - postupným zhotovováním snímků (např. kosti) - s přídatným zařízením - hýbe se detektor - hýbe se lůžko Připojení počítačů umožnilo lepší dynamické sledování i hod- nocení scintigrafických záznamů. Umožnilo také zcela nové prin- cipy zobrazování, např. ECT (Emission Computed Tomomograph), která umožňuje zobrazit rozložení radiofarmaka ve 3 rovinách. Vyskytuje se na dvou modifikacích: - SPECT s běžnými zářiči - PET s positronovými zářiči Počítače se v současné době staly nedílnou součástí měřících aparatur při užití RA látek in vivo i in vitro. V rámci daných skript skript není možné se podrobněji zabývat popisem funkce počítače a jeho jednotlivých součástí. Pro podrobnější seznámení se s tou- to problematikou odkazujeme na speciální monografie, např. Lud- vík (l99l). Pro potřeby pracovníků, kteří užívají RA látky ke sledování lát- kové přeměny, je velice instruktivní přehled obsažen v monogra- fii Dienstbier a sp. (1989). Co umožňuje počítač ve spojení s detektory záření : - odpočet pozadí a "odřezání" jiných impulsů podobných izotopů - přepočet tzv. cpm (zaznamenaných rozpadů) na skutečný počet rozpadů (dpm); tedy přepočet s ohledem na účinnost měření - propočet průměrů vzorků s upozorněním na rozptyl či chybné výsledky - sestrojení standardní křivky a výpočet hodnot s ohledem na ředě- ní a pod. - statistický výpočet skupiny výsledků, výpočet chyby měření atd. II.4 Základní údaje o riziku práce s RA izotopy a možnosti ochrany proti němu Při práci s RA izotopy existují v zásadě dvě možnosti ohrožení (Dienstbier a sp., 1989, Blažek a Hupka, 1989): - vnější kontaminace- ozáření vnějším zdrojem záření RA - vnitřní kontaminace (vnitřní ozáření) + vdechnutím + s potravou či pitím + vniknutí poraněnou kůží a pod. Důsledkem zevního ozáření i vnitřní kontaminace je absorbova- ná dávka. Ta je definována jako energie záření absorbovaná v obje- mu látky o jednotkové hmotnosti. Jednotka absorbované dávky je 1 Gray (Gy) , tj. 1 joul v 1 kg hmotnosti. Záleží na expozici, resp. dávce záření (ta se udává v Siever- tech - Sv). Nejvíce jsou zevním ozářením ohroženy gonády a kost- ní dřeň, nejméně ruce, nohy (asi 15x méně). Pracovníci s izotopy mají povoleny 1Ox vyšší dávky - viz tab. č. 1 - proto rizikový přípla- tek a dodatková dovolená. Měření osobních radiačních dávek Ke zjištění osobních radiačních dávek se užívají alfa, beta a RTG filmové dozimetry, které obsahují 2 filmy: - vysoce citlivý - málo citlivý (havarijní) V důsledku radiace může dojít: - ke vnitřní kontaminaci (zejm.RA jodem, méně pak techneciem) - ke kontaminaci povrchů Pokud je radioaktivita přítomna na povrchu pracovních ploch, na nekrytých částech těla, na šatstvu a pod, jde o kontaminaci po- vrchů. Z povrchů se pak může radioaktivní látka dostat do orga- nismu, ať již cestou dýchacího ústrojí, zažívacího traktu či pora- něními v kůži - pak dochází ke kontaminaci vnitřní. Existuje dvojí možnost, jak povrchovou kontaminaci měřit: - metodou stěru - plocha se otře např. vatou namočenou ve vodě (příp. jiné tekutině či rozpustidle, podle toho, v čem je RA látka rozpuštěna). Pokud je povrch obtížně omyvatelný, může do- jít k velkému zkreslení; jinak jde o metodu velmi citlivou. - přímým měřením, tj. pomocí měřičů kontaminace. Tento způsob je nevýhodný pro záření beta a pro měkké záření. Citlivost u gama zářičů je možno zvýšit scintilačním krystalem. Existuje i možnost přímého proměření kontaminace rukou, což je v řadě laboratoří důležité. Radiační ochrana Abychom zabránili či snížili možnost kontaminace, existuje řada prostředků: - užívání ochranných oděvů - užívání gumových rukavic při práci - zákaz pití, jídla či kouření nejen při práci ale i v místnosti, kde se s RA látkami pracuje - ochrana vzdáleností - např.nebrat ampule se zářiči do rukou ale zásadně do peánů, manipulátorů a pod. - ochrana časem - omezit dobu, po kterou se s RA zářením pracu- je - vše si předem připravit resp. procvičit bez RA zářiče - ochrana stíněním - u záření, zejm. se užívá olovo o různé síle podle toho, o jaký zářič jde - ochrana prací v digestoři (zde např. umístěny metabolické klece či respirometr se zvířaty) - odsávání je kombinováno případně s prací s pomocí manipulátorů příp. se stíněním Speciální problém představuje ochrana pacientů, kteří se pod- robují in vivo vyšetření s pomocí RA látek. Obdobně jako u RTG vyšetření jde o to, aby se snížily dávky, které pacient přijímá, aniž by byla ohrožena přesnost stanovení. Následující tab. č. 2 ukazuje limity záření, které pacient mů- že přijmout. Vývoj v nukleární medicíně jde směrem k takovým metodám, kte- ré snižují velikost dávky, jíž je pacient vystaven. Přehled hlavních izotopů užívaných při sledování přeměny lát- kové viz tab. č. 3. Další tabulky obsahují rozdělení látek podle jejich RA nebez- pečnosti (uvádí tab.č. 4) ; resp. dělení radioisotopových praco- višť podle užívaných množství těchto látek (viz tab.č.5). Nebezpečnost určitého RA prvku záleží na jeho: - poločase rozpadu - typu a energii záření - tendenci hromadit se v některém orgánu Je třeba rozeznávat biologický a radiochemický poločas. Uveď- me si např. 22Na a 24Na. Tyto izotopy sodíku mají rozdílné radio- chemické poločasy (22Na má poločas dlouhodobý) - ale jejich bio- logický poločas je u obou krátký v důsledku vylučování močí. Biologický poločas třeba RA olova, stroncia, radia ale i vápníku, je naproti tomu dlouhý, ukládají se v kostech a působí tam až vz- nik nádorů. Plutonium se usazuje přímo v kostní dřeni a z toho vy- plývá i jeho mimořádně nepříznivé působení. Pracovníci, kteří dlouhodobě pracují s RA látkami, se musí po- drobovat pravidelným preventivním lékařským prohlídkám (nejmé- ně 1x ročně), při kterých jsou zejména posuzovány stav krvetvor- by a také imunitního systému. Při některých onemocněních je prá- ce s izotopy přímo zakázána; rozhoduje o tom příslušný odborný lé- kař zdravotního zařízení. II.3.3.8 Komerční RIA soupravy (kity) Jsou dodávány jako souprava, obsahující všechny potřebné sou- části. Výhoda: rychlé zavedení dané metody do praxe, možnost porovnání s hodnotami jiných pracovišť. Nevýhoda: vyšší náklady; proto se někdy kupují pouze některé sou- části kitů, dodávané zvlášť, a část soupravy si pracoviště vyrábí sa- mo. Kity obsahují soubor potřebných substancí a reagencií na urči- tý počet analýz (většinou 100-200 stanovení). Je přiložen podrobný popis metody, kit obsahuje i kontrolní vzorky. Doba použitelnosti je omezena; jde o týdny - měsíce, podle RA izotopu, který je radio- indikátorem i podle stability dalších součástí kitu. Výroba komerč- ních souprav přispěla k velkému rozšíření RIA metodik a také k je- jich standardizaci. Ani komerční soupravy nemusí však být zcela kvalitní - snížená může být kvalita jednotlivých jejich složek; třeba pouze u určitých šarží. Proto je nutné i u nich provádět pravidelné kontroly, ať již centrální či lokální. II.3.4 Popis nejužívanějších RIA metodik V praxi jsou užívány zejména RIA metodiky pro stanovení hla- diny důležitých léků, hormonů a dalších biologicky důležitých lá- tek. Cílem je co možná nejrychlejší stanovení těchto látek, aby se získaly podklady pro urychlené zahájení či změnu terapie. Stejně důležité je, aby se doplnila diagnóza určité patologické poruchy v organismu, na kterou již poukazovaly některé ukazatele stavu (subjektivní a objektivní klinické projevy, vyšetření biochemická a klinická a pod.). Proto je ideálním požadavkem, aby výsledek RIA stanovení ob- držel lékař tentýž den; dle možnosti pouze za několik hodin. Vět- šina současných RIA metodik tuto podmínku splňuje, protože po- třebná inkubační doba je pouze 1-3 hodiny, takže celková doba z- pracování vzorků od případného zpracování krve až po vyhodno- cení výsledků nepřesahuje 6-7 hodin. To je důležité pro případ- nou změnu terapie ještě tentýž den. V konkurenci s některými alternativními metodikami má RIA nevýhodu poněkud delšího zpracování; výhodou naopak je větší přesnost stanovení. Proto se i v nejbližších létech s RIA metodi- kami počítá; není náhodou, že se s nimi u nás počítá jak v kon- cepci nukleární medicíny, tak i v koncepci klinické biochemie. Obdobně to platí i v jiných státech, ať již v Evropě či jinde ve světě. Důležitou otázkou, která o uplatnění určitých metod ve zdra- votnictví, ale i v zemědělství a pod., bude rozhodovat, je, kolik dané vyšetření stojí. Proto je důležité, kolik stojí kit na provede- ní určitého počtu stanovení a jaké další výdaje je nutné do ceny vyšetření započítat (zkumavky či špičky na dávkovače, další po- třebné chemikálie či roztoky, přístroje a pod.). Z tohoto hlediska má značný význam, zda jde o kit s beta zářičem, který pro měře- ní vyžaduje ještě přidání relativně drahé scintilační tekutiny či ni- koliv. Vzhledem k platům pracovníků u nás položka výdajů na mzdy je prozatím méně důležitá. Ekonomické důvody však nemohou být jediným rozhodujícím fakorem; pokud je jednoznačně přesnější stanovení s pomocí be- ta zářiče (který nenarušuje strukturu dané látky), pak je mu nutno dát přednost. Ještě je nutno se zmínit o tom, do jaké míry může být pro pra- covníka, který s RIA metodikou pracuje, nebezpečné záření RA látky. Je nutno říci, že nebezpečí je zcela malé, protože užitá ak- tivita je minimální, prakticky na hranici hodnoty pro RA zářič. Postupně si probereme některé hlavní typy RIA stanovení a to nejprve pro stanovení hladiny důležitých léků, dále pak pro sta- novení vybraných patologických stavů. Podrobněji budeme pro- bírat vždy poprvé určitý postup, u dalších pak pouze odlišnosti. Podrobné návody pak nalezneme v příloze. II.3.4.1 Hladiny léků II.3.4.1.1 Hladina cyklosporinu A (CyA) Cyklosporin je v současné době nejúčinnější imunosupresi- vum (lék potlačující imunitu) , které je užíváno především při transplantaci orgánů a při řadě tzv. autoimunitních onemocně- ní. Ve všech těchto případech je důležité znát průběžně hladinu cyklosporinu v krvi, aby podle jeho aktuální hladiny bylo možné v případě potřeby urychleně upravit dávkování tohoto léku. Zpočátku byla stanovována hladina celkového cyklosporinu, tj. jednak vlastního cyklosporinu, jednak jeho metabolitů. Toto stanovení celkového množství bylo umožňováno tehdejším sta- vem výroby protilátek, které byly polyklonální. S vývojem mono- klonálních protilátek byla pak vyvinuta metodika stanovující jen samotný cyklosporin. Tento způsob stanovení v současné době převládá, proto ho uvádíme podrobněji jako jediný - v příloze je pak obsažena i metodika na stanovení celkového cyklosporinu spolu s metabolity. CyA-kit firmy INCSTAR, znač. 3H (125I) Odběr krve : Odběr se provádí do zkumavek s EDTA jako antikoagulantem. Je lépe stanovovat v celé krvi, než v plasmě. Vzorky, které ne- jsou zpracovávány ihned, mohou být uschovávány ve 4 stupních do 1 týdne, při ­18 stupních Celsia do 6 měsíců. Složení kitu: - koncentrovaný pufr- je třeba doplnit destilovanou vodou do 150 ml (pufr A) a přidá se 10% objemu plasmy kontrolní osoby, která nepřijímá cyklosporin - aktivní uhlí - je třeba přidat 60 ml pufru A a dále 0,7 ml plasmy bez cyklosporinu, promíchat a ochladit - standardy obsahují 16 ng CyA v 1 ml 70 % vodného etanolu - monoklonální protilátky jsou lyofilizované - specifické - nespecifické k oběma se vždy přidá 10 ml pufru A - kontrolní vzorky - jsou rozpuštěné v 1 ml celé krve, jejich hod- noty dosahují cca 100 ug/ml a 400 ng/ml pro CyA s metabolity - značkovač - k 1 ml 3 H - CyA se přidá 9 ml pufru Příprava standard: Standardy se ředí kontrolní krví ze základního roztoku: 100 ul koncentrované standardy + 0,9 krev = 1600 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 800 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 400 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 200 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 100 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 50 ng/ml z toho 0,5 + 0,5 krev = 25 ng/ml samotná krev = 0 ng/ml Předpříprava standard, kontrol a vzorků: 50 ul + 950 ul metanolu, pak centrifugovat 5 minut při 1600 g. Dále pipetovat 50 ul supernatantu. Pipetace: Celková aktivita (CA): standarda 0 50 ul + značkovač 100 ul + pufr B 1050 ul Nespecifická vazba (NSB): standarda 0 50 ul + značkovač 100 ul + pufr B 550 ul Další standardy : totéž s tím, že 50 ul příslušné standardy, pufr B do 1600 ul + 50 ul protilátky Kontrolní séra a vzorky : totéž s tím, že užijeme 50 ul kontrolního séra či vzorku Inkubace: Trvá 2 hodiny při 4oC (v chladničce), pak 15 minut při 0-2o C (miska s vodou a ledem). Pak se přidá do všech zkumavek (s vý- jimkou CA) 500 ul aktivního uhlí. Další inkubace probíhá v ledo- vé lázni 12-15 minut. Centrifugace: Probíhá 5 minut při 1600 g ve chlazené centrifuze. Měření aktivity: Ze supernatantu se odebere 1 ml a přidá se 9 ml scintilační tekutiny SLD. Měřit na beta-měřiči 1 minutu. Výpočet: - udělat průměr duplikátů - odečíst od vzorků, standard a kontrol hodnotu NSB - vypočíst vazebnost nulového vzorku (Bo) - udělat poměry % vazebnosti proti Bo - vynést na semilogaritmický papír - odečíst hodnotu kontrolních a neznámých vzorků Hodnoty: (doporučené rozmezí) U transplantace ledvin : 100 - 300 ng/ml pro hladinu samotné- ho CyA (specifické protilátky) resp. 400 - 600 ng/ml pro hladinu cyklosporinu s metabolity (nespecifické protilátky). U transplantace pankreatu, jater a srdce se hladina CyA udr- žuje o něco vyšší; u pankreatu a jater kolem 200-300 resp. 800 ng/ml, u srdce 400 ug/ml pro samotný CyA a kolem 1200 ug/ml pro CyA spolu s metabolity. Pokud stanovována hladina v plasmě, jsou hodnoty 2,5-3x niž- ší. Pozn. Recentně vyrábí firma INCSTAR prakticky pouze kity se značkovačem 125J. Stanovení je levnější o to, že není třeba přidá- vat scintilační tekutiny, což vzhledem k jejich vysoké ceně není zanedbatelné. V současné době je také v praxi prozkušován stejně kvalitní kit firmy IMMUNOTECH z ČR, který je o dost levnější. II.3.4.1.2 Hladina digoxinu (kit HUMA-LAB Košice, SR ; značený 125J) Mezi nejužívanější léky při kardiovaskulárních nemocech patří digitalisové preparáty (Digoxin, Digitoxin, Lanatosid). Nebezpečím pro činnost myokardu je možnost předigitalizace, ke které dochází u 2O% pacientů a umírá celkem 4-5% pacientů. Pokud se předigita- lisace nepozná, tak úmrtnost pacientů je značně vyšší a dosahuje je 50-100 %! Potřebné by bylo měřit koncentraci digoxinu přímo v srdečním svalu, ta však koreluje s plasmatickými hladinami. Proto se u ne- mocných provádí toto nepřímé měření hladiny digoxinu. Stabilita: Při 2-8 oC vydrží kit 6 týdnů; po rozpuštění 1 týden při2-8 o C. Vzorky se vzhledem k rozptylu doporučuje dělat v triplikátech. Ne- stanovuje se nespecificky vázaná aktivita. Pipetace: 1 - 3 CA: 0,1 ml značkovače 4 - 6 NSB: 0.1 nulového séra + 0,1 pufr + 0,1 ml značk. + 0,1 protilátka 7 - 24 standardy : 0.1 standardy + 0,1 pufr + 0,1 ml značkovače + 0,1 protilátka 25- 27 kontrola : 0,1 kontrolního vzorku + 0,1 pufr + 0,1 ml značkovač + 0,1 protilátka 28-100 vzorky (24 vzorků!) : + 0,1 pufr + 0,1 ml značk. + 0,1 protilátka Inkubace: Probíhá 60 minut při pokojové teplotě. Centrifugace: Probíhá 10 minut při 2000 g. Po centrifugaci následuje odsátí supernatantu a nakonec měření aktivity v sedimentu. Hodnocení výsledků: Možnost předávkování při hodnotách nad 2,0 umol.l-1.* II.3.4.2 Hladiny thyreoidálních hormonů II.3.4.2.1 Funkce štítné žlázy; její regulace a poruchy Tvorbou hormonů ve štítné žláze se většinou myslí tvorba jod- thyroninových hormonů, v tomto orgánu se však vytváří i kalcito- nin, o tom však nebudeme hovořit na tomto místě, ale při probírá- ní kalciofosfátového metabolismu. Tyroidální buňka produkuje bílkovinný nosič - prethyreoglobu- lin - ten se mění na thyreoglobulin nejodovaný (TG). V přítomnosti dostatečného množství jodu se TG jodiduje a vznikají z něj postup- ně vlastní hormony. K tomu je potřebný denní přívod určitého množství jodu s potravou (kolem 200 ug); část jodu se získává ta- ké dejodací thyreoidálních hormonů v periferní tkáni. Jod z plasmy je jodidovou pumpou do tkáně štítné žlázy aktiv- ně koncentrován (koncentrace jodu je ve štítné žláze proti plasmě 30x i více zvýšena!). Vznikají napřed monojodtyrozin, pak dijodthyrozin, v další fá- zi se tvoří vlastní hormony. Jde o thyroxin (T4), trijodthyronin (T3) a reversní T 3. Ve štítné žláze vzniká převážně T4, T3 je vytvářen v malém (asi 1-2 %) a r-T3 ve zcela zanedbatelném množství. Hormony štítné žlázy se váží z převážné míry na transportní bíl- koviny, zejména globuliny (thyroxin binding globulin- TBG)-pou- ze asi O,5 % T 4 resp. O,3% T 3 jsou volné. Denně je produkováno asi 100 ug T 4; stejné množství je ho za normálních podmínek v průběhu 24 hodin destruováno. Regulace funkce štítné žlázy (viz Dienstbier a sp. 1989) V regulaci thyreoidální funkce se uplatňují 3 základní mecha- nismy : a) osa hypotalamus --- hypofýza --- štítná žláza b) thyroidní autoregulace adaptací na přísun jodidu c) periferní dejodační systém ad a) Funkce štítné žlázy je přímo regulována hladinou hypofyzár- ního thyreostimulačního hormonu - TSH. Proto je hladina TSH citli- vým ukazatelem funkce štítné žlázy. Syntéza a uvolnění TSH je sti- mulována thyreotropin - relasing hormonem - TRH (thyreoliberin); který vzniká v hypotalamu a portálním oběhem hypofýzy se dostá- vá do tohoto orgánu. Zpětným regulátorem je hladina thyreoidál- ních hormonů. ad b) Vliv jodu je patrný při deficitu jodu; zvyšuje se aktivita jodové pumpy a dochází k hyperplasii žlázy (vole u alpských kreté- nů!). Do jisté míry může nedostatek jodu kompenzovat i zvýšená tvorba T 3 na úkor T 4. ad c) Vliv periferní dejodace se uplatňuje např. při omezení příj- mu potravy, zejm. sacharidů (pokles T 3, vzestup rT 3); uplatňovat se mohou i léky - např. betablokátory, které vedou k poklesu hla- din T 3. Účinek thyroidálních hormonů Účinek těchto hormonů je zprostředkován vazbou na receptory, uloženými intracelulárně (zejm. v jádru buněk). Receptory reagují hlavně s T 3, méně až vůbec ne s T 4; proto T 4 bývá některými au- tory považována pouze za prohormon. Část účinků thyreoidálních hormonů je zprostředkována adrenergně - tato část je inhibována blokátory beta-adrenergních receptorů. Ve vzácných případech existuje na hormony štítné žlázy resis- tence, tj. ani dostatečná hladina hormonů nevyvolává plnou odpo- věď; pozorujeme přitom zvýšenou hladinu T 4, T 3 i TSH. II.3.4.2.2 Hladina T 4 Hladina celkového thyroxinu (T ) je základním parametrem pro hodnocení funkce štítné žlázy, i když vlastním účinným hormonem je pouze jeho volná frakce. Hladina T4 je určována jeho sekrecí, transportem, metabolizací a exkrecí. Pokud jde o sekreci thyroxinu, zvyšuje se hladina při thyreoto- xikóze a snižuje se u většiny hypothyreóz. V úvahu je nutno vzít kolísání hladiny transportních bílkovin, což vede ke zvýšení hla- diny T 4, aniž by byla zvýšena činnost štítné žlázy, např. u kon- genitálního nadbytku TBG (transport bílkovin), v těhotenství, při jaterních lézích, v důsledku perorální antikoncepce atd. Naopak snížené hladiny T4 v důsledku snížení úrovně TBG nacházíme při kongenitálním snížení hladiny TBG, při nefrotickém syndromu, při podávání androgénů či kortikoidů a pod. Variabilita hodnot T 4 je dále zvyšována variacemi denními či se- zónními. Proto je třeba hladiny T4 vždy korelovat s klinickým obra- zem. Stabilita součástí kitu V 2-8 oC 6 týdnů, po rozpuštění 1 týden v 2-8 oC , 4 týdny v v -2O oC. Hodnocení výsledků Hodnoty pod 45 umol.1na -1 naznačují velkou pravděpodobnost hypothyerózy, nad 150 umol.1na-1 pak naznačují velkou pravděpodo- bnost thyreotoxikózy (euthyreosa při hodnotách v rozmezí cca 50-130 umol.1na-1, hraniční hodnoty, tj. 30- 45 resp. 130-150 umol.l-na 1jsou suspektní). Platí však, že 15-25 % thyreotoxikóz má normální hladinu T 4 10-20 % hypothyreóz -"- -"- 5 % euthyreóz má hodnoty patologické. Pozn. Kromě RIA metody se stanovuje hladina T4 (i dalších tyroi- dálních hormonů) fluorometricky, na přístroji ABBOTT. II.3.4.2.3 Hladina T3 (trijodthyronin) Štítná žláza produkuje dva hormony, jejich stanovení nezname- ná duplicitu stanovení (viz úvod o činnosti štítné žlázy). Denně je je produkováno 80-100 ug T 4, ten se z 8-90 % mění na účinný T 3. T 3 je 3.5x účinnější než T 4. Určování T3 má svůj význam při diagnóze hyperthyreózy; při ní se hladina T 3 zvyšuje a to nejen jen v důsledku zvýšené produkce ve štítné žláze, ale i při perifer- ní přeměně T 4---T 3. Proto nezvýšená (nejen snížená, ale i nor- i normální) hodnota T3 prakticky vylučuje hyperthyreózu (za zvý- šené hodnoty považujeme více než 3,5 umol/ml). Jinak vliv změněných hladin TBG, variací a pod. jako u T 4. II.3.4.2.4 Hladina TSH Thyreotropin (thyroid stimulating hormon - TSH) je glykopro- teid produkovaný předním lalokem hypofýzy; jeho uvolňování je regulováno hormonem hypothalamu TRH (viz úvod o funkci štít- né žlázy!). Ve zvýšené míře je TSH produkován za primární hypothyreózy, kdy v séru jsou nízké hodnoty thyreoidálních hormonů T4 (thyroxi- nu) a T3 (trijodthyroninu). Hodnoty - u zdravých (euthyroidních) 0-6 mU/l. Pozn. RIA metodiky pro stanovení thyreoidálních hormonů začí- nají být v poslední době vytlačovány alternativní fluorometrickou metodikou (IMX), která má výhodu v rychlém stanovení. U menších počtů vzorků umožňuje stanovit za dopoledne naráz všechny tři (případně i další) thyreoidální hormony, zatím co RIA metodika TSH vyžaduje tři dny. Rozdíl v ceně stanovení sice existuje ve prospěch RIA metody, rychlost stanovení však většinou převažuje ve prospěch metodiky na IMx. II.3.4.2.5 Závěry o funkční diagnostice štítné žlázy Zásadně je třeba vycházet z klinického stavu pacienta. Obvyk- lý postup vyšetření je následující (viz Dienstbier a sp. l989): - anamnéza + klinický obraz - periferní parametry: - tepová frekvence - měření systolických intervalů - časového průběhu reflexu Achillovy šlachy Pak až následují: - cílená laboratorní vyšetření 1) Když základním testem je T 4 u hraničních hodnot - u hodnot na vyšší hranici se stanovuje navíc i T 3 - u hodnot na dolní hranici se stanovuje navíc i TSH 2) Když základním vyšetřením je test TRH - normální výsledek vyloučí poruchu - při patologických hodnotách pak stanovení T 4 - T 3 - TSH 3) Když zákl. vyšetřením je TSH - pokud nízký : thyreotoxikóza - pokud vysoký: primární hypothyreóza Doporučené diagnostické postupy pro stanovení funkce a poruch štítné žlázy: Pro thyreotokikózu (hyperthyreoózu) svědčí hladiny: - T 4 : když hladina zvýšená (nad 150 umol/l) - T 3 : když hladina zvýšená (nad 3,5 umol/l) - TRH test (aplikace 200 ug TRH jako bolu - naráz; perorálně podává- me vzhledem k malé resorbci 400 mg); pak v případě patologických hodnot sledujeme hladiny TSH, příp.T4 - když nestoupá za 20-30 mi- nut či dokonce klesá, jde o thyreotoxikózu K diferenciální diagnóze se pak provádí akumulační testy radio- jodem či scintigrafie štítné žlázy. Podezření na hypothyreózu je třeba vidět tam, kde probíhá léčba radiojodem či byla provedena strumektomie, nebo u starších lidí (te- dy za situací, kdy se dá očekávat snížená funkce štítné žlázy). Jednotlivé parametry nasvědčující hypothyreóze: - TSH : když nalézáme vysoké hodnoty (časově předbíhá pokles T 4!) - T 4 : když nalézáme nízké hodnoty - TRH : stimulační test může potvrdit hypothyreózu i tam, kde samot- né nestimulované hodnoty TSH jsou v normálu. TRH test může diag- nostikovat i hypofyzární deficit TSH (vrozený či po zásazích na hypo- fýze) Euthyreóza Pokud je klinicky jasné, že štítná žláza je bez poruchy, není nut- né tento stav diagnostikovat. Stanovení euthyreózy se provádí pou- ze z důvodů posudkových, před operacemi a pod. Užití RIA testů ke screeningovým vyšetřením funkce štítné žlázy: Laboratorní testy (T 4, T 3, TSH) nejsou určeny ke screeningovým vyšetřením - jedinou výjimkou je screening kongenitální (vrozené) hypothyreózy. K tomu účelu se vyšetření provádí mezi 1-7 dnem po porodu (někdy i z pupečníkové krve) stanovení hladiny T4 mikrometodou; pokud je zachycena nízká hladina T4, je na spádovém pracovišti provedeno další doplňující vyšetření. Význam tohoto screeningového vyšetření je v tom, že včas za- hájená léčba hypothyreózy thyroidálními hormony zajistí normální vývoj CNS a předejde se tak těžkým mentálním postižením v průbě- hu dalšího vývoje. II.3.4.3 Hladina hormonů hypofýzy II.3.4.3.1 Přední lalok hypofýzy a) Stanovení TSH - již bylo probíráno u poruch štítné žlázy. b) Kit na stanovení prolaktinu (kit Imunotech Praha) Stanovení hladiny prolaktinu se provádí zejména při diagnos- tice poruch menstruačního cyklu, neplodnosti; dále v diferenciální diagnostice nádorů hypofýzy. V plazmě je prolaktin v koncentracích pod 20 ng/ml; vyšší je hladina v těhotenství a při laktaci za fyziologických podmínek; patologicky jsou zvýšené hodnoty u některých hypothyreóz, typic- ky při adenomech hypofýzy (sterilita, impotence). Pozor na zvýšení v důsledku hypoglykémie (inzulin!) a dále při testu TRH (viz obr. č.40). c) Kit na stanovení růstového hormonu (GH, STH) (výrobce Imunotech Praha) Fyziologické hladiny jsou do 5 ng/ml. Ke stimulaci GH můžeme použít např. hypoglykémie vyvolané inzulínem, argininem, gluka- gonem. Snížení zvýšených hodnot pak můžeme dosáhnout naopak hyperglykémií po podání glukózy per os.) Zvýšené hodnoty nalézáme u dětí, u dospělých při akromegalii. Snížení při poklesu funkce hypofýzy (resp. jejího předního laloku) či při poruchách růstu - viz obr. č.4l. d) Kity na stanovení hormonu stimulujícího folikuly (FSH) a luteinizačního hormonu (LH) (výrobce Imunotech Praha) Jejich stanovení se uplatňuje zejména v gynekologické diag- nostice. Nemá diagnostickou cenu dělat jednotlivá stanovení; vy- šetření provádět buď opakovaně v 15-30 denních intervalech nebo provést stimulační test. Hodnoty v období před pubertou jsou nízké. V dospělosti kolí- sají u žen s menstruačním cyklem; nejvyšší jsou při ovulaci. U mužů nalézáme hodnoty 5-25 FSH 6-30 LH -viz obr. č.42. e) Kit na stanovení hladiny ACTH Jde o velmi složité stanovení, proto zajištěn celostátní servis na III. interně VFN v Praze 2. Normální hodnoty jsou 12-55 pg/ml. II.3.4.3.2 Zadní lalok hypofýzy Hladina vasopresinu a oxytocinu se stanovuje pouze ojediněle. Hladiny - viz obr. č.43. II.3.4.4 Hladina hormonů nadledvin II.3.4.4.1 Kůra nadledvin - Kortizol - normální hladina 160-550 umol/l ráno, výrazný pokles odpoledne (24 hod. rytmicita). Průkaz nižších hodnot kortizolu v plazmě ukazuje na hypokortikalismus (pro průkaz hyperkortika- lismu jiná metoda než RIA, měření odpadu kortizolu močí, odpad by neměl přesáhnout 170 umol/den). - Aldosteron- kit ALDO-steron 125J - Imunotech Praha. Stanovení se provádí v séru a v moči. Ráno vleže hodnota okolo 200 pmol na jeden litr, ve stoje se hodnoty zvyšují - viz obr. č. 44. II.3.4.4.2 Dřeň nadledvin Stanovení katecholaminů pomocí kitu CATECHOLA 3H REA kit či pro stanovení v moči CATECHOLA 14C - oba kity dodává Imuno- tech Praha. Stanovení adrenalinu a noradrenalinu se provádí zřídka RIA me- todou, spíše metodou HPLC a pod. II.3.4.5 Hladina hormonů pohlavních orgánů - Testosteron: Tento hormon se tvoří ve varleti, v menším množství též v kůře nadledvin a ve vaječníku. Denně se ho tvoří 4-9 mg; v plazmě je testosteron vázán na transportní bílkovinu. Ke stanovení se užívá např. kit dodávaný Imunotech Praha. Hodnoty: 1-3 nmol/l u žen, 10-30 nmol/l u mužů. - Estriol -(RIA GNOST Estriol - free Behring) Tento hormon je produkován placentou i plodem; pokles hladi- ny indikuje komplikace gravidity. Hodnoty: od 4 do 13 ng/ml - viz obr. č.45. - Choriogonadotropní hormon (HCG) Tento hormon vzniká zejména v placentě, jeho hladina se prud- ce zvyšuje v průběhu gravidity, zejména v prvním trimestru. Hodnoty stoupají od cca 800 mU/ml až na 100-150 000 mU/ml, po prvním trimestru pak opětovný pokles na cca 15 000 mU/ml. II.3.4.6 Plasmatická reninová aktivita (PRA) (výrobce Imunotech Praha - značeno 125 J) Systém renin - angiotensin představuje jeden z důležitých hor- monálních regulačních systémů pro homeostázu elektrolytů, obje- mu a tlaku krve. Základem je hormon renin, uvolňovaný ledvinami. Ten způsobu- je přeměnu angiotensinogenu na angiotensin I.; měnící se na účin- ný angiotensin II. - viz obr. č. 46. Vlastní účinná látka - angiotensin II.-působí vasokonstrik- ci, stimulaci tvorby a sekrece aldosteronu v kůře nadledvi- nek a stimulaci sympatiku. Stanovení vlastního účinného angiotensinu II. je obtížné, proto se určuje snadněji přístupný angiotensin I; tj. jeho množství vzniklé in vitro v průběhu inkubace z angiotensi- nogenu ve vzorku plasmy. Množství vzniklého angiotensi- nu I. je přímo úměrné množství reninu v plasmě. Stanovení PRA (z periferní či ledvinové krve) lze užít ke studiu účasti renin - angiotensinového systému v pato- genezi hypertenze, v diagnostice poruch elektrolytové, ob- jemové a tlakové homeostázy, v diferenční diagnostice růz- ných druhů hypertenze, k rozlišení primárního a sekundár- ního aldosteronismu. Podmínkou správné interpretace vý- sledků jsou zejména standardní podmínky odběru krve. Pozn.: Odběry krve do vychlazených zkumavek, obsahující EDTA (200 ul 4 % na 10 ml). Během celého zpracování nes- mí teplota vzorků přesáhnout 2-4 o C; na tuto teplotu vychla- zovat i ostatní součásti kitu. Normální hodnoty do 2,0 ug/ml. II.3.4.7 In vitro (RIA) diagnostika nádorů RIA diagnostika nádorů se zakládá na průkazu látek pro- dukovaných nádorem v séru nemocných. Vzhledem k ne- patrným koncentracím těchto látek umožnila jejich stanove- ní právě až RIA metodika. Z nádorových produktů se diagnosticky nejvíce využívá lidský choriový gonadotropin (HCG), alfa-fetoprotein (AFP) a karcinoembryonální antigen (CEA). HCG Fyziologicky produkován pouze v průběhu těhotenství. Pokud se HCG prokáže u muže, jde o jednoznačný projev maligního nádoru varlat, u netěhotné ženy pak o projev ná- doru dělohy (nalézáme také značně zvýšené hodnoty, nad 150 000 mU/ml). AFP, CEA (alfafetoprotein a carcinoembryonic antigen) Kity fy Behring - RIAGNOST AFP resp. CEA; dále fy BIO- MEDICA - viz obr. č. 47. Jsou přítomné v organismu pouze v období embryonálního života a po porodu rychle vymizí. V dospělosti pak nacházíme v krvi pouze nepatrné stopy CEA. AFP se v dospělosti objevu- je u primárních karcinomů jater, obdobně u nádorů varlat. Hodnoty CEA stoupají zase u karcinomu žaludku a střev. Využití AFP a CEA stanovení v onkologické diagnostice Hlavní využití RIA metodik není v základní diagnostice ale spíše při zjišťování účinku léčby; pokud i po léčbě (operační či ozářením) je hladina nádorových produktů stále zvýšena, jsou přítomny metastázy (projevení této změny diagnostikova- né RIA metodou předchází jiné zjistitelné změny a proto má vyšetření značný význam!). Pro diagnostiku a monitorování léčby nádorů prostaty je určenPSA 125J - RIA kit ADICO - viz obr. č. 48. Pozn. V poslední době se na specializovaných pracovištích užívají k diagnostice nádorů receptory a to jednak progeste- ronové jednak estrogenové. II.3.4.8 Poruchy glycidového metabolismu Poruchy glycidového metabolismu v organismu jsou spja- ty s poruchou funkce pankreatu a to jeho části endokrinní. Endokrinní pankreas se skládá ze shluků buněk, vytvářejí- cích tzv. Langerhansovy ostrůvky. Tyto ostrůvky vytvářejí převážně (u člověka z 60-75%) hor- mon insulin (tvoří se v tzv. B-buňkách), z 15-30 % glukagon (vytváří se v tzv. A-buňkách). Asi desetina buněk L. ostrůvků vytváří hormon somatostatin - viz obr. č. 49. Inzulin je jedním ze životně důležitých hormonů, který zasa- huje do intermediárního metabolismu všech živin, nejvýrazně- ji však do přeměny glycidů, resp. do regulace stálé hladiny krevního cukru (glykémie). Insulin se vytváří za přítomnosti příslušného enzymu z tzv. proinsulinu. Spolu s insulinem se v ekvimolárním množství u- volňuje z proinsulinu i tzv. spojovací peptid-C-peptid. V přípa- dech, kdy by vzhledem k podávanému exogennímu insulinu bylo obtížné stanovovat hladinu insulinu, stanovujeme raději právě hladinu C-peptidu. Obdobně to platí pro případ, že by množství stanoveného insulínu bylo zkresleno přítomností cirkulujících protilátek pro- ti insulinu. Fyziologickým antagonistou (protihráčem) insulinu je druhý pankreatický hormon - glukagon. Zatímco insulin hladinu krev- ního cukru snižuje, glukagon ji naopak zvyšuje; má tedy hyper- glykemický účinek. Hlavními podněty pro zvýšenou tvorbu glu- kagonu jsou hypoglykemie (pokles hladiny krevního cukru), hla- dovění a také přívod aminokyselin. Poslední uvedený faktor - přívod aminokyselin - působí sti- mulačně jak na uvolňování insulinu, tak glukagonu; proto je např. přívod 10 % argininu infuzí užíván u obou hormonů jako stimulační test. Obdobně jako jsme uváděli v případě jiných po- ruch, ať již jde o myokard či štítnou žlázu, nemusí totiž stanovo- vání bazálních hodnot insulinu či glukagonu dát informaci o pří- padné poruše orgánu. Až když orgán vystavíme určité zátěži, která ho donutí ke zvýšené činnosti, může se tato porucha pro- jevit. Insulin působí na celou řadu metabolických pochodů ­ ovliv- ňuje transport látek (nejen glukózy resp. dalších monosachari- dů), jejich oxidaci i ukládání, ale také syntézu ribonukleové ky- seliny (RNK) v jádru buněk či hladinu cyklického adenosinmo- nofosfátu (c-AMP). Onemocnění diabetes mellitus (DM) lze charakterizovat jako relativní deficit insulinu, který nestačí zajistit utilizaci glukózy a dalších metabolitů ve tkáních. I když se stále užívá jeden název ­ diabetes mellitus - a odlišují se pouze jeho dva typy - I. a II. ­ - dohodli se recentně diabetologové na světovém kongresu, že ve skutečnosti jde o dvě onemocnění, odlišná jak pokud jde o patogenezi tak o léčbu. Tak zvaný DM I. typu je vždy závislý na dodávce exogenní- ho insulinu (IDDM), protože za tohoto stavu organismus nedo- káže produkovat buďprakticky žádné nebo velmi malé (nedo- statečné) množství insulinu. Pankreas také není schopen od- povědět zvýšenou produkcí insulinu na glukozovou zátěž. Naproti tomu u DM II. typu (NIDDM) závislost na vnějším in- sulinu nenacházíme a v odpověď na glukózovou zátěž může- me najít dokonce i vyšší produkci insulinu. Tento hyperinsuli- nismus však nevede k poklesu glykémie v krvi. Uvedený stav může být způsoben buď menší periferní citlivostí na insulin, a- le uvažována je naopak i zvýšená citlivost buněk L.ostrůvků na glukózu; pochopitelně v kombinaci s dříve uvedenou sní- ženou citlivostí periferních tkání na insulin. Diabetes mellitus může vzniknout i druhotně a to při akro- megalii, Cushingově chorobě, při feochromocytomu a také, jako sekundární efekt imunosupresivní léčby, při transplan- tacích orgánů. Primární defekt v sacharidovém metabolismu může být vyvolán v těchto případech růstovým hormonem, kortikoidy či katecholaminy. Hyperinsulinemie pak je vlastně kompenzačním mechanismem na těmito působky vzniklou glukózovou zátěž. Důsledkem hyperinsulinemie se tak může stát až vyčerpání rezerv L. ostrůvků a následné selhání jejich funkce. Při diabetu mellitu (DM) vzniká hyperglykémie jako výsle- dek zhoršeného transportu a vychytávání glukózy ve svalech a tukové tkáni. Současně také poklesá transport a vychytává- ní ve tkáních u aminokyselin, zvyšuje se hladina aminokyselin v krvi a následně dochází k novotvorbě glukózy z aminokyse- lin v játrech (glukoneogenese). Metabolické poměry při DM je možno pozorovat na následu- jících obrázcích č. 50 a č. 51. Vidíme poměry za fyziologických podmínek, kdy se po přívo- du glycidů zesílí všechny cesty utilizace glukózy a naopak situa- ci při diabetu mellitu. Pomocí RIA metodik můžeme stanovit prakticky všechny pa- rametry potřebné pro diagnostiku poruchy metabolismu glycidů. II.3.4.8.1 Hladina celkového insulinu Stanovení hladiny insulinu pomáhá diagnostikovat hypo-resp. hyperinsulinémii. Spíše než bazální hodnoty, mají význam stimu- lované testy (za 30-60 a 120 minut po podání glukozy, jídel různé- ho složení a pod.). Tzv.clamp představuje zvláštní stimulaci po i.v. podané glukó- ze. Sledují se časy např. 4-6-10-20-30-40-60 min.případně i za del- ší dobu (10-ti hodinový clamp). Po jiné stimulaci (např. p.o.glukózou) hladina insulinu stoupá- pá asi na cca 50-60 uU/ml za 30-60 minut a pak opět poklesá. Při clampu je možné pozorovat hodnoty insulinu až 1500-4000 ul/ml. Při insulinomu většinou nacházíme vysoké hodnoty insulinu při nízkých hodnotách glykémie. Hyperinsulinemie může být i při pře- dávkování insulinu, v pokročilém těhotenství, při akromegalii, Cu- shingově syndromu a pod. Ke stanovení hladiny insulinu je možné používat několik kitů - anglického, polského a českého. Kvalita polského kitu se značně pohoršila. Anglický kit fy AMERSHAM je velice kvalitní, ale vzhle- dem k ceně je spíše používán kit český. Používáno je i stanove- ní fluorometrické na přístroji ABBOTT. Normální hodnoty Normální bazální hodnoty 0-25 uU/ml. Po zátěži p.o. (např. glu- kosou) se dostávají zvýšené hodnoty po 30 resp.60 minutách (na 60-100 uj/ml) a pak opět hodnoty poklesají přibližně k výchozí ú- rovni. Při diabetu se objevuje vrchol hladiny insulinu později, ale je vyšší než u zdravých osob. Hyperinsulinemie bez hypoglykémie nacházíme u insulinomu či při předávkování insulinu. Může se ) také projevit v pokročilém těhotenství, při akromegalii, Cushin- gově chorobě a pod. II.3.4.8.2 Hladina volného insulinu Pro některá onemocnění je důležité znát nikoliv celkovou hla- dinu insulinu, ale jeho volnou frakci. Jeho hladina se stanovuje stejným kitem jako insulin celkový, rozdíl je pouze v tom, že k 0,2 ml vzorku krve přidáme 0,2 ml PEGu (5g PEG do 15 ml puf- ru). Dosažené výsledky pak násobíme 2x vzhledem k uvedené- mu ředění. Některé dodávané kity pak stanovují přímo volný insulin. II.3.4.8.3 Hladina protilátek proti insulinu V krvi je přítomno- zejména za určitých stavů - i určité množ- ství protilátek proti insulinu, které mohou část insulinu vázat v komplexu. Množství protilátek se kvantifikuje jako vazebnost, resp. se stanovuje množství protilátek (relativní kvantitativní odpověď pacienta na insulin; komplikace značeného a nezna- čeného insulinu nastává jen u pacientů léčených insulinem). II.3.4.8.4 Hladina C-peptidu Insulin se vytváří z tzv. proinsulinu. Účinkem specifických enzymů se zároveň s insulinem uvolňuje ekvimolární množst- ví C-peptidu (jednoduchý polypeptid tvořený řetězcem 31ami- nokyselinových zbytků). Insulin je vylučován do v. portae (vrátnicový oběh), játra vstřebávají asi polovinu insulinu přicházejícího v. portae. To- to množství je závislé na koncentraci insulinu a glukózy. Pro- tože C-peptid je v játrech vychytáván v konstantním množství (asi12 %), poskytuje sledování C-peptidu spolehlivější infor- maci o sekreci beta buněk, než samotný insulin. Výpočet Stanovuje se buď bazální hodnota (na lačno) nebo stimulovaná hodnota - po orálně podané glukóze za 0-30-60-120 minut - po i.v. podané glukóze (clamp) - např. za 0-4-6-l0-20-30-40- 60-l00-ll0-l20 sekund - po i.v. podaném glukagonu ve stejných časech II.3.4.9 Poruchy kalciofosfátového metabolismu II.3.4.9.1 Regulace hladiny vápníku v plasmě Na regulaci hladiny vápníku v plasmě se podílejí svými hor- mony zejména dvě endokrinní žlázy a to příštítná tělíska (pro- dukují parathormon) a štítná žláza (produkuje kalcitonin). Kro- mě nich působí na metabolismus vápníku nadledvinkové kor- tikoidy (glukokortikoidy) a také růstový hormon předního lalo- ku hypofýzy. Vápník je v těle obsažen hlavně v kostech, kde se nachází ve dvou formách: - snadno směnitelná zásoba - pool stabilního (pomalu směnitelného) vápníku V plasmě je normálně obsaženo asi 5 mekv/l vápníku, kte- rý je zčásti vázán na protein a zčásti je difusibilní. Vápník plas- my je v rovnováze se snadno směnitelným vápníkem kostí. Volný (ionizovaný) vápník v tělesných tekutinách je nezbyt- ný pro normální kontrakce svalů kosterních a myokardu, pro přenos nervového vzruchu i pro srážení krve. Vzhledem k vaz- bě vápníku na plasmatické bílkoviny je důležité stanovovat ve- dle hladiny vápníku i hladinu plasmatických bílkovin. Vápník je aktivně transportován ze střeva; tento pochod je stimulován vysokoproteinovou dietou a také působením vit. D. V kůži vzniká z provitaminu D vlivem slunečního světla vit. D 3. Ten se transportuje do jater, kde se mění na 25-OH vit. D 3 a po transportu do ledviny na vlastní fyziologicky aktivní 1,25 dihyd- roxy vit. D 3. Ten prostřednictvím stimulace tvorby RNA působí zvýšení transportu vápníku. Při deficitu vit. D tak dochází k hypo- kalcémii a poruchám mineralizace kostí. Při nedostatečné funkci ledvin není tento orgán rovněž scho- pen vyrábět potřebné množství 1,25 - dihydroxy vit. D 3, což se projevuje poruchou mineralizace. Naopak podávání velkých dá- vek vit. D 3 zvyšuje hladinu vápníku v plasmě natolik, že to při- spívá k léčbě nedostatečné funkce příštitných tělísek. Existují vzájemné vztahy mezi hladinou vápníku, tvorbou 1,25 dihydroxy vit. D 3 a hladinou PTH - tvorba vit.D se zvyšuje při po- poklesu vápníku volného; tento účinek je zprostředkován PTH. Řada onemocnění se vyznačuje poruchou kalciofosfátového metabolismu a následnými kostními změnami. Při osteoskleróze, která se vyskytuje u nemocných s hypoparathyreosou, či při me- tastazujících tumorech, nacházíme zvýšené množství kalcifikova- né kosti. Naopak při osteoporóze, která se vyskytuje u nemocných s velkým omezením pohybu či při nadměrné sekreci glukokortiko- idů, nacházíme snížené množství kalcifikace kostí. Jako o osteo- malacii hovoříme v případech poruchy přirůstání kostního minerá- lu (křivice). Po vynětí příštitných tělísek (parathyreoidektomii), ať již záměr- né (při tumorech tělísek nebo při hyperparathyreoze) či nechtěné (při operacích štítné žlázy), dochází k poklesu hladiny vápníku v plasmě; obvykle naopak stoupá hladina fosfátů. Velmi nebezpeč- ná je hypokalcemická tetanie (spasmus kosterních svalů, zejm. končetin a laryngu). Tetanie mizí po injekci PTH resp. po podání velkých dávek vit. D. Při hypersekreci parathyreoidálního tumoru dochází k hyperkalcemii a hyperkalciurii, současně dochází na jed- né straně k demineralizaci kostí, na druhé pak k vytváření mnoho- četných kostních cyst (osteitis fibrosa cystica). Při vysoké hladině vápníku v plasmě se inhibuje sekrece PTH a vápník se ukládá v kostech. Při nízké hladině se sekrece PTH zvy- šuje a dochází k mobilizaci vápníku z kostí. Za stavů s chronickým snížením hladiny plasmatického vápníku (např. chronická nefropa- tie) dochází tak k sekundární hyperparathyreose. Vylučování kalci- toninu se naopak zvětšuje při vyšších hladinách vápníku (viz obr. č. 52), což je přirozené vzhledem ke skutečnosti , že kalcitonin je, pokud jde o hladinu vápníku, antagonistou PTH. Zájemce o podrobnější informace o patogeneze i terapii poruch kalciofosfátového metabolismu odkazuji na monografie z této ob- lasti, zejména Sotorník a sp. (1992). Z RIA resp. ostatních RSA metod jsou při diagnóze poruch kal- ciofosfátového metabolismu užívány zejména následující: - stanovení PTH a) IRMA metoda dvou protilátek, pro stanovení celého aminokyseli- nového řetězce PTH; umožňuje při současném stanovení hladiny vápníku odlišit hypo-, eu- i hyperparathyreoidismus, změny při re- nální nedostatečnosti i při obezitě. b) C-terminal PTH - pro stanovení 65-84 aminokyseliny řetězce PTH, odliší hypo-, eu- i hyperparathyroidismus. - stanovení kalcitoninu - užíván zejména jako marker tumoru posti- hujícího C-buňky štítné žlázy; jeho zvýšené hladiny byly nalezeny i u jiných nádorů - hladina 25 - OH vit. D 3 - pro zjištění, zda nalezené hodnoty uvedené formy D3 patří ještě do normálního rozmezí zásobení orga- nismu tímto vitaminem či nikoliv - hladina 1,25 - (OH)2 vit. D 3 - pro zjištění, zda nalezené hodno- ty tohoto biologicky účinného vitaminu patří ještě do normálního rozmezí; dále se užívá ke kontrole účinnosti podávaných preparátů pokud jde o hladinu vápníku a fosforu - hladina osteokalcinu - vzhledem k tomu, že hladina tohoto speci- fického kostního proteinu koreluje s aktuálním stavem kostního me- tabolismu, je osteokalcin citlivým ukazatelem kostních onemocnění Postupně probereme všechny tyto in vitro metodiky; zvláštní pozornost bude přitom věnována dvěma metodikám, které zname- nají poněkud odlišný metodický postup a to stanovení PTH a 1,25- (OH)2 vit. D 3. II.3.4.9.2 Hladina PTH a) PTH (parathyroid hormon ALEGRO Nichols Inst. Diagnostics, San Juan Capistrano, Ca., USA Imunoassay pro kvantitativní stanovení lidského parathormonu v séru. Kit vystačí na 1OO zkumavek, tj. 18 zkumavek na celkovou aktivitu, nespecifickou vazbu, standardy a kontroly a 82 na 41 vzorků v duplikátech. Princip metody Jde o imunoradiometrickou metodu - IRMA - pro stanovení celé- ho aminokyselinového řetězce PTH. Metoda užívá dvě protilátky (ko- zí) proti lidskému PTH, které jsou specifické pro dvě definované o- blasti molekuly PTH. Jedna z nich váže pouze prostřední část a C- terminální PTH (39-84); tato protilátka je navázána na plastické ku- ličky. Druhá protilátka váže pouze N-terminal PTH (1-34); tato pro- tilátka je označena 125J pro detekci. Vzorek obsahující PTH je inkubován současně s kuličkou obsa- hující protilátku a s protilátkou obsahující 125J. PTH přítomný ve vzorku je navázán na obě protilátky a vytváří "sendvičový" kom- plex, protilátka kuličková (39-84) --- PTH (1-84) ---125J -protilátka (1-34). Pro detekci je potřebné vytvoření tohoto komplexu s vla- stním PTH, i když kuličková protilátka váže také střední a C-ter- minální fragmenty. Kapacita kuličkové (imobilizované) protilátky je nastavena tak, aby nedošlo k interferenci s neaktivními frag- menty a to i při jejich vysoké koncentraci. Na konci inkubace se kulička obsahující protilátku promyje, aby se odstranily nenavázané komponenty a měří se pomocí ga- maměřiče aktivita navázaná na pevné fázi. Protože k vytváření tak zvaného "sendvičového" komplexu dochází pouze v přítomnosti vlastní intaktní molekuly PTH, je aktivita komplexu přímo úměrná množství PTH ve vzorku. Křivka závislosti radioaktivity na koncentraci se připraví pomocí standardních vzorků, které jsou zpracovány spolu s neznámými - koncentrace neznámých vzorků se přitom přímo odečítá z této ka- librační křivky. Sběr resp. příprava vzorků Stanovení PTH se dělá v séru; přijatelné je i stanovení v EDTA plasmě. Pro stanovení duplikátu je potřebné 400 ul séra. Vzorky je třeba centrifugovat (nejlépe v chlazené centrifuze); ihned dát zmrazit do -20o C (při pokojové teplotě vydrží pouze 2 hodiny; při 4o C 8 hodin; při -2Oo C 4 měsíce a při -7O o C 11 měsíců). Poznámky: Je nutné pořádně promíchat všechny reagencie jemným třepá- ním či vířením. Všechny složky kitu je třeba skladovat při 2 - 8o C až do doby užití. Standardy a kontroly po rekonstituci je třeba dát nejprve do le- dové lázně na dobu 10 minut. Stejně jako vzorky je pak udržovat v ledu až do doby stanovení. Standardy a kontroly užít ihned po jejich přípravě; zbývající skladovat při ­20 o C; zde vydrží po dobu 6 týdnů (s maximálně třemi cykly roztátí x zmražení). Promývací roztok může být skladován v pokojové teplotě. Postup: - pipetovat 200 ul standardu (C-H), kontrol (J-K) či vzorků - + 100 ul značené protilátky (B) a promíchat na Vortexu - + vždy 1 kuličku s protilátkou (A) do zkumavky - pokrýt stojan se zkumavkami parafilmem a pod. - inkubovat při pokojové teplotě 22o C cca 22 hodiny -------------------------------------------------------------- - přidat 2 ml promývacího roztoku a odsát či dekantovat superna- tant - totéž opakovat ještě jednou - změřit aktivitu na gamaměřiči 1 minutu Limitace metody Nejvyšší stanovitelné množství PTH je 1500 pg/ml, nejnižší je l pg/ml. Variace v obsahu bílkovin cca 25 % mají malý až žádný vliv na hodnoty PTH. Ředit je možné vzorky mezi l 500 - 100 000 pg/ml. Očekávané hodnoty Hodnota u 253 zdravých osob byla zjištěna v rozmezí 10-65 pg/ ml. U primárního hyperparathyreoidismu jsou zvýšené hodnoty 53- 1180 pg/ml (celkový vápník byl od 1O,5 do 16,3 mg/100 ml). Při hyperkalcemii maligní jsou hodnoty větší než 1 pg/ml až 22 pg/ml, hodnoty kalcemie přitom 10,5 - 17,6 mg/100 ml. Při hypopa- rathyreoidismu hodnoty 1-21 pg/ml; kalcium přitom je mezi 6,3 - 8,5 mg/100 ml. U chronické renální nedostatečnosti a osteitis fibrosa pokroči- lé jsou hodnoty zvýšeny v průměru na více než 1033 pg/ml. b) C - terminal PTH 125J RIA kit INCSTAR Corp., Stilwater, Min., USA) - na 65 stanovení Jde o metodiku se zpožděným přidáním značkovače, což zvy- šuje sensitivitu metody. Protilátka byla vypracována proti hovězí- mu PTH a reaguje na 65-84 sekvenci molekuly PTH. Při této RIA metodě sevzorek a první protilátka inkubují po 16-24 hodin při 2-8 o C. Pak se přidá značkovač a znovu je inkubace 16-24 hodin při 2-8 o C. Separace se dosáhne pomocí druhé protilátky s PEG; pak následuje opět 2 hodinová inkubace. Hladina PTH (stejně jako standardy) se vyjadřuje v ng/ml. Očekávané hodnoty Normální hodnoty: O,44 Hyperparathyreoidismus: zvýšené hodnoty PTH. Hypoparathyreoidismus - snížené (až neměřitelné) hodnoty. Poznámky: Pokud je to možné, stanovujeme raději metodikou Allegro celou molekulu PTH. Hladina PTH je základním ukazatelem u postižení poruch kalcio- fosfátového metabolismu, proto je nezbytné tento hormon u každé- ho nemocného, u kterého se objevují určité poruchy, skutečně sta- novit. Stejně tak stanovovat jeho hladinu opakovaně v průběhu urči- té terapie, ať již operativní či konzervativní. II.3.4.9.3. Hladina kalcitoninu Calcitonin-Radioimmunoassay kit - Nichols Institute Diagnos- tics, San Juan Capistrano,USA Kalcitonin, polypeptidický hormon s 32 aminokyselinami, je se- cernován především C-buňkami štítné žlázy (původně se předpoklá- dalo, že je secernován v parathyroidní tkáni!); z určité části i mi- mo štítnou žlázu. Účinkem kalcitoninu je snížení hladiny kalcia; inhibice resorp- ce v kosti. Také podporuje clearenci kalcia a fosfátu močí ­ po- kud jde o fosfor, je synergistou parathormonu, účinek na kost a na vápník v moči je naopak antagonistický PTH. Fyziologický význam jeho funkce v homeostáze vápníku v savčích buňkách není dopo- sud dobře prokázán, zejména u člověka. Přesto je RIA stanovení kalcitoninu považováno většinou bada- telů za nejvhodnější metodu pro určení diagnózy medullárního kar- cinomu štítné žlázy (MTC). Tento karcinom postihuje C-buňky štít- né žlázy a tvoří 5-10% všech thyroidálních karcinomů; může být buďto familiární či nikoliv. U familiárních MTC je možná časná diag- nóza: koncentrace kalcitoninu na lačno jsou zvýšeny, enormně se zvýší jeho hladina po podání kalcia či pentagastrinu. Tyto změny hladiny kalcitoninu se projevují dříve než klinické příznaky (když ni- koliv basální hodnoty, tak zcela určitě hodnoty po stimulaci!). Zvýšené hladiny kalcitoninu byly také nalezeny u jiných nádorů, např. plicních či mamárních. Na rozdíl od jiných RIA kitů užívá kit fy Nichols vysoce citlivé a specifické protilátky a tak umožňuje stanovovat i nízké hodnoty (3 pg/ml u normálních osob). Očekávané hodnoty u normálních osob Laboratoř výrobce určila 3-26 pg/ml u mužů (u 41 mužů), resp. 2-17 pg/ml u žen (u 56 žen ). Po stimulaci pohlaví čas infúze pentagast. kalcia a pentagast. ženy 1 min. 2 - 26 6 - 82 2 min. 3 - 29 4 - 94 5 min. 3 - 23 5 - 76 ______________________________________________________ muži 1 min. 6 - 9O 26 - 35O 2 min. 1O - 84 32 - 35O 5 min. 7 -1O6 24 - 244 II.3.4.9.4 Hladina 25-hydroxy vitaminu D3 Kit na stanovení 25-hydroxy vitaminu D3 (značeno 3H) (Nichols Inst.Diagnostics, San Juan Capistrano, USA) Princip Alkoholové extrakty 1OO ul séra jsou inkubovány se specific- kou protilátkou (vaznou bílkovinou) na vit. D a se značeným 25- hydroxy vitaminem D3. Inkubace trvá 3 hodiny a probíhá při 4 o C. Pak se přidá charcoal (aktivní uhlí) a následuje další 20 min. inkubace. Pak jsou zkumavky centrifugovány při 4o C po dobu 20 min. při 1500 g. Supernatant se dekantuje, do scintilačních lahviček se scintilačním koktejlem. Měření probíhá na beta měřiči, hodno- ty neznámých vzorků se porovnávají s hodnotami standard. Vý- sledky se vyjadřují v ng/ml séra. Průměrné hodnoty Výrobcem byly stanoveny hodnoty kontrol (americké!) a to 45 ng/ml (16-74 ng/ml). Je však nutné udělat si kontroly vlastní. Nejmenší změřitelná hodnota: 2 ng/ml II.3.4.9.5 Hladina 1,25 dihydroxy vitaminu D3 (Nichols Institute San Juan, Capistrano, USA Kit postačí na 65 zkumavek. K označení je užit 3H (tricium). Při metodě je nutné oddělit 1,25 - (OH)2 D od ostatních lipidic- kých látek (dříve byly potřebné opakované extrakce a přečišťo- vání). V metodě s užitím kitu je zapotřebí modifikovaná extrakce na C18 OH koloně; k 1 ml extraktu se přidá specifický vazný protein, po 1 hod. inkubace pak označený 3H - 1,25 (OH)2 D3. Pak je opět 1 hod. inkubace a přidá se charcoal. Po 30 min. in- kubaci při 2-8 o C se zkumavky zcentrifugují 20 min. v chlaze- né centrifuze. K supernatantu se přidá scintilační koktejl a změ- ří se aktivita. Výsledky se vyjadřují jako pg/ml. Je třeba korekce na krok sloupcové chromatografie. Provedení A) Extrakce - 1 ml (séra či kontroly) do zkumavek 13x100 mm + 50 ul reag. K (značkovač) - 2x promíchat v průběhu 10 minut (po 50 ul také napipetovat do 2 scintilačních lahviček, přidat 10 ml scint. koktejlu = základ pro stanovení recovery!) + 1 ml acetonitrilu, 30 sekund intenzivně míchat - centrifugovat 15 minut v chlazené centrifuze při 1300-1500g - supernatant slít do zkumavek 13x100 mm, kde již připraveno 0,4 ml fosfátového pufru o pH 10.5, promíchat - centrifugovat 10 minut při 2-8 o C - dekantovat do připravených C18 OH kolonek B) Příprava kolonek před použitím a vlastní extrakce Postupně proplachovat následujícím způsobem: a) 5 ml hexanu 5 ml isopropanolu 5 ml metanolu 5 ml destilované vody b) zapnout vývěvu a rychlostí 1 kapka/min. nechat protéci vzorky c) vypnout vývěvu a promýt kolonu 5 ml vody 5 ml 70% metanolu ve vodě 5 ml 10% metylchloridu v he- xanu 5 ml 1% isopropylalkoholu v hexanu d) vymýt 1,25 (OH)2 D 5 ml 5% isopropanolu v hexanu (pokud se užívají stejné kolonky, promýt 5 ml isopropanolu a pak B-A) e) vysušit eluáty N2 (30-45 minut) - eluáty mohou být skladovány 1 týden při ­20 o C f) vysušené eluáty rekonstituovat 200 ul reagence D (standarda 0); promíchat, dvakrát po 5 minutách - rekonstituované vzorky je nut- no dále zpracovávat do 30 min. C) RIA provedení Hodnoty zdravých osob: l8-62 pg/ml, průměr = 39 pg/ml. II.3.4.9.6 Hladina osteokalcinu (RIA kit OSTEOCALCIN 125J INCSTAR Corp. - Stilwater, USA - Sorin Fueter, Bruxelles, Belgie) Osteokalcin - protein závislý na vit. K - je jeden z nejdůležitěj- ších nekolagenních proteinů v kosti. Nalézá se pouze v kosti a pravděpodobně je produkován osteoblasty. Předpokládá se, že hraje roli v mineralizačním procesu a že je pod vlivem ostatních lá- tek regulujících metabolismus vápníku, tj. kalcitoninu, PTH a vit. D. Hladina osteokalcinu při různých kostních onemocněních je specifičtějším ukazatelem než alkalická fosfatáza (ta reaguje i na změny v zažívacím ústrojí, v játrech či v nádorech). Proto je os- teokalcin specifickým ukazatelem kostních onemocnění. Normální hodnoty Výrobce uvádí rozmezí 1,8 - 6,6 ug/ml; je však třeba si udě- lat vlastní kontroly! Citlivost metody: 0,2 ug/ml. Poznámky: - je lépe stanovovat celý komplex výše uvedených regulačních lá- tek kalciofosfátového metabolizmu, protože to umožňuje jemně dife- rencovat jak patologické změny, tak i výsledek terapie - v současné době se počet stanovovaných látek ještě dále rozšířil o alkalickou kostní fosfatázu II.3.4.9.7 TANDEM-R-OSTASE (HYBRITECH EUROPE S.A., Belgium) IRMA pro měření kostní alkalické fosfatázy (kostní ALP v séru Lidské alkalické fosfatázy (ALP) katalyzují hydrolýzu fosfátových estérů při alkalickém pH. V séru jde především o ALP kostní a jater- ní. O hladině kostní ALP se předpokládá, že odráží metabolický stav osteoblastů. Přesné zjištění kostního metabolismu je důležité pro určení závažnosti kostního onemocnění a reakce na terapii. Užívá se např. pro hodnocení osteomalácie, primárního hyperpara- thyroidismu, renální osteodystrofie, osteoporózy a kostních metas- táz. Princip metody Jde o imunoradiometrickou metodu (IRMA), ve které vzorky obsa- hující kostní ALP reagují jednak na monoklonální protilátku, kterou jsou potaženy plastické kuličky, jednak na monoklonální protilátku označenou RA značkovačem. Vytvoří se komplex (sendvič) tvořený protilátkou na pevné fázi - kostní nenavázanou značenou protilátku a aktivitu komplexu měříme na gamaměřiči. Z kalibrační křivky pak odečteme koncentraci ALP, která je přímo úměrná naměřené radio- aktivitě. Souprava je pro stanovení ve 100 zkumavkách, tj. 43 vzorků ! Poznámky: - pokud vzorky mají více než 120 ug/l je nutné je naředit nulovým standardem a znovu stanovit - promytí kuliček je velmi důležité pro přesnost stanovení ! - pro pipetování značené protilátky a promývacího roztoku možno užít pipetoru, ostatní složky pipetovat s vyměnitelnými špičkami, ty měnit po každém vzorku ! - rozsah stanovení je limitován počtem vzorků, které mohou být na- pipetovány za 20 minut - nepoužívat skleněné zkumavky ! - nejlepší vazba na protilátky při teplotě inkubace 2-4 o C ! Interference NEVADÍ: Hemoglobin a bilirubin do 500 mg/100 ml resp. 25 mg/100 ml Triglyceridy do 1420 mg/100 ml Proteiny v rozmezí 6-15,6 mg/100 ml léky Minimální změřitelné množství 2 ug/l Závěr o RIA metodách Bylo by možné říkat ještě řadu příkladů o užití RIA metod, kterými můžeme stanovovat řadu dalších důležitých látek (např. C-AMP, vitaminy, hladiny železa atd.). Odkazuji však na speciali- zované publikace, informativní letáky jednotlivých výrobců a pod. Roční informace vydává rovněž referenční RIA laboratoř v Ostra- vě. Pokud jde o příklady jednotlivých kitů pro RIA či ostatní RSA stanovení, jde skutečně pouze o příklady - v současné době je na trhu celá řada kitů a pro jejich výběr je nutné uvážit jak jejich cit- livost, tak i pracovní a ekonomickou náročnost. III. METODY S UŽITÍM RA LÁTEK V zásadě lze pomocí RA látek provádět následující vyše- tření a sledování: - lokalizační gamagrafii - funkční orgánovou diagnostiku - stanovení biologických objemů a metabolických zásob . stanovení koncentrací biologicky účinných látek (zejm. po- mocí RIA a dalších in vitro metodik) - vlastní metabolická sledování, tj. sledování určitých pocho- dů přeměny látkové za podmínek fyziologických i patofyziolo- gických Postupně si probereme tyto přístupy, při čemž hlavní po- zornost budeme věnovat přístupům užívaným ve fyziologii, tj. od stanovení biologických objemů počínaje a vlastními meta- bolickými sledováními konče. Příklady užití těchto metodik pro metabolické studie budou probrány podrobněji, v posled- ní části skript. III.1 Lokalizační gamagrafie a funkční orgánová diagnostika Tyto metodiky jsou užívány zejména v lékařství, biologové fyziologického zaměření je budou s největší pravděpodobnos- tí používat spíše výjimečně. Proto se o nich zmíníme jen krát- ce a pro podrobnější informace odkazuji na učebnice nukleár- ní medicíny, např. Dienstbier a sp. (1989) či Blažek a Hupka (1989). III.1.1 Lokalizační gamagrafie Pokud se vybraná značená látka selektivně hromadí v urči- tém orgánu, lze tento orgán zobrazit záznamem gama záření nad povrchem těla. Tento způsob zobrazení se nazývá gama- grafie nebo scintigrafie. Z gamagramu lze hodnotit velikost, tvar, uložení a případné změny struktury orgánů. Toto zobrazení je odlišné od rentgenového zobrazení. Zatím co rentgenový snímek vzniká na základě rozdílné absorbce pa- prsků vysílaných RTG lampou, při gamagrafii v sobě vyšetřo- vaný orgán hromadí více či méně radioaktivní látku. Pokud změny v orgánu nemění absorbci RTG paprsků, ale mění funkci orgánů, dává gamagrafie přesnější výsledky. Totéž pochopitelně platí naopak, obě metodiky se navzájem doplňu- jí (vidíme to z jejich porovnání za stejných stavů organismu). Lokalizační gamagrafie se uplatňuje při sledování funkce růz- ných orgánů, ale zvláštní uplatnění nalézá v onkologii (umožňu- je najít ohraničené nádorové ložisko). III.1.1.1 Lokalizační gamagrafie ledvin Jako značená sloučenina se využívá např. merkaheptonát či dimerkaptosukcinát, jako radioindikátor v obou případech 99Tc. Tyto sloučeniny se podají i.v. (aktivita cca 100 MBq), sleduje se hromadění v parenchymu ledvin. Při narušení funkce ledvin ku- mulace probíhá delší dobu (2-4 hodiny). Při normální funkci je distribuce radioaktivity v ledvinách ho- mogenní. Pokud nalezneme místa s nižší aktivitou, nasvědču- jí ložiskovým procesům (viz obr. č.21). Pomocí gamagramu mů- žeme hodnotit i velikost orgánu. III.1.1.2 Lokalizační diagnostika jater Ke statickému zobrazení jater pomocí značených sloučenin se využívají buňky retikuloendotelového systému (RES), které jsou ve tkáni jater rovnoměrně rozloženy. Pro RES je vhodný ja- ko značená sloučenina nejspíše radiokoloid, např. sulfurkoloid, opět značený 99 Tc. Ten se asi z 90% nahromadí v játrech a z- bytek nalézáme ve slezině. Ke zpomalení vychytávání dochází při těžších poruchách ja- ter, kdy se také zvyšuje kumulace ve slezině, u velmi těžkých poruch nacházíme aktivitu i v kostní dřeni (viz obr. č. 22). Podaná aktivita je cca 50 MBq . Výpadky radioaktivity (tzn. menší aktivitu) nalézáme při různých ložiscích, včetně onko- logických. III.1.1.3 Lokalizační diagnostika patologických ložisek v myo- kardu Jako radiofarmakon se podává chlorid thalný, značený 201 Tl. Většinou se vyšetřuje myokard po zátěži (např. bicyklolový ergometr), podává se cca 80 MBq chloridu 201 Tl. Zobrazení se provádí 15-30 minut po aplikaci, potom za 2 a 4 hodiny (viz obr. č. 23). III.1.1.4 Lokalizační thyreologická diagnostika Původně byl ke sledování štítné žlázy užíván prakticky vý- hradně tzv. akumulační test, při kterém se sledovala aktivita nad štítnou žlázou za 8-24-48 hodin po podání radiojodu - tj. jodidu značeného 131 J (viz obr. č. 24). Gamagraficky se dá štítná žláza zobrazit ve vrcholu křiv- ky při akumulačním testu, nebo po i.v. podání 20-40 MBq per- pertechnátu 99 Tc. Tento způsob vyšetření je pro pacienta výhodnější, sleduje se hromadění po 30 minutách. Izotop má krátký poločas, tak- že radiační zátěž je malá. Ze stejného důvodu se v současné době k zobrazení užívá i krátkodobý izotop jodu ­ 123 J. Příklad zobrazení - viz obr.č. 25. III.1.1.5 Lokalizační diagnostika nádorů skeletu Po podání metylendifosfonátu ­ 99 Tc se tato značená látka za několik hodin nakumuluje v celém skeletu. Jako ložiska vyznačující se zvýšeným hromaděním aktivity (pozitivní ložiska, horká místa) se zobrazují osteogenní nádory. Při gamagrafickém zobrazení se i.v. podává cca 500 MBq uvede- né značené látky a po 3-4 hodinách se provede zobrazení (viz obr. č. 26). III.1.1.6 Lokalizační diagnostika nádorů mozku Zatímco zdravá mozková tkáň má velice omezený přestup z krve do mozku, je tato bariéra porušena v nádorové tkáni. Tu se také ra- diofarmakon může hromadit v intracelulárních prostorech, zatímco normální mozková tkáň ji prakticky nevychytává. Jako nejvhodnější radiofarmakon se používá pertechnát ­ 99 Tc a to v dávce cca 300 MBq , měří se po 1 hodině. Protože pertechne- tát se vychytává také ve štítné žláze, jak již bylo uvedeno, blokuje se její činnost chlorigenem. Zobrazení mozku viz obr. č. 27. III.1.1.7 Lokalizační diagnostika nádorů pomocí 67Ga I když se pomocí 67 Ga pozitivně zobrazují ložiska různé etio- logie, používá se uvedená metodika se značeným galiem v něk- terých případech, zejm. u lymfomů a bronchogenních karcino- mů, jako jedna z hlavních metod. Aplikuje se i.v. cca 1 MBq citrátu - 67 Ga/kg hmotnosti, gama- magrafie se provádí za 48 hodin. Příklad viz obr. č. 28. Vedle lokalizačních gamagrafických metod se RA slouče- nin v klinice užívá i v jiných metodikách; odkazuji na speciální publikace jako Dienstbier a spol.(1989) "Diagnostika metodami nukleární medicíny" či Blažek a sp. (1989) "Radiologie a nukle- ární medicína". III.1.1.8 Alternativní zobrazovací metody Kromě rentgenologických metod jsou při zobrazování orgá- nů hlavními konkurenty sonografie, výpočetní tomografie a magnetická rezonance. a) Ultrazvukové vyšetření (ultrasonografie, echografie) ---------------------------------------------------------------------------- Ultrazvukové vyšetření snad ani není třeba podrobně vy- světlovat, přesto ale alespoň něco o principu této metody. K diagnostice se užívá ultrazvuku o frekvenci 1-10 MH. S výjim- kou Dopplerovské metody trvá impuls 1-100 ms. Zdrojem ul- trazvuku jsou tzv. piezomateriály, které působením střídavé- ho proudu vysílají ultrazvukové vlny. Při dopadu ultrazvuko- vých vln slouží piezomateriály jako přijímač. Ultrazvuk prochází hmotou a je jí rozptylován, absorbován i odrážen zpět. Síla odrazu závisí na rychlosti ultrazvukových vln a na hustotě tkáně. Tato metodika se velmi rychle ujala při vyšetřování kardiovaskulárních poruch, dále při zjišťování po- ruch funkce ledvin a gastrointestinální trubice. Zvláštní použi- tí má v gynekologii a porodnictví, kde umožňuje vyšetřování i v průběhu gravidity, bez nebezpečí ohrožení plodu, jaké při- chází v úvahu při rentgenových vyšetřeních či při užití RA lá- tek. Např. v kardiologii nás informuje echokardiografie v růz- ných aspektech lépe než RTG vyšetření. Pomocí ultrazvuku však můžeme vyšetřovat i mozek (echoencefalografie), s u- žitím ultrasonotomografie orgány břicha a pánve, štítnou žlá- zu, prsy a p. Ultrazvukové přístroje jsou vyráběny v řadě typů, odlišných i podle orgánů, jejichž činnost mají sledovat. Příklad takové- ho přístroje viz obr. č. 29. b) Výpočetní tomografie (Computer tomography - CT) -------------------------------------------------------------------------- Tento způsob rentgenové diagnostiky spojuje diagnostiku pomocí Rentgenova záření, schopnou zhotovení řezu přísluš- ným orgánem přibližně za 5 sekund s počítačovým zpracová- ním těchto řezů do komplexního zobrazení (autor CT Houns- field byl za její objev vyznamenán Nobelovou cenou v roce 1979). Tímto způsobem zobrazuje CT i měkké tkáně, jako je mozek, slinivka, slezina, ale také játra, ledviny či svalstvo. Výpočetní tomograf (viz obr. č. 30) má následující hlavní části: - posunovatelný vyšetřovací stůl - vlastní přístroj s vysoce výkonnou rentgenovou lampou a detektory (vše opět pohyblivé) - rentgenový generátor - stoly operátora a vyhodnocovací, napojené na počítač Zobrazení CT je možné zaznamenat buď na disketu nebo jako fotografie na plochém filmu (obrázky z monitoru lze přefotogra- fovat na RTG filmy). Indikace CT jsou velmi široké, protože při tomto vyšetření lze zjistit takové patologické procesy, které se liší svojí denzitou od okolí. c) Magnetická rezonance (MR) ----------------------------------------- Stručně o principu magnetické rezonance : Atomová jádra s lichým počtem protonů (nebo neutronů) mají tzv. spin, tj. otá- čejí se kolem vlastní osy. Nejjednodušší jádro, které se takto chová, je jádro vodíku. Jádro se otáčí podél své osy nejrůzněj- šími směry; to se však mění, když se jádra atomu nacházejí v silném magnetickém poli. V tomto případě probíhají totiž osy otáčení ve směru magnetického pole, tedy rovnoběžně. Čím je magnetické pole silnější, tím je rovnoběžné uspořádání os do- konalejší. Když na tuto rovnováhu působíme střídavým magnetickým polem a to vysokofrekvenčním, dojde k tzv. precesi, tj. osa otá- čení se vychýlí a pohybuje se jakoby po plášti pomyslného ku- žele (jádro i osa se tedy pohybují jako dětská káča). Když přes- tane vysokofrekvenční impuls působit, vrací se jádro do rovno- vážného stavu. Na cívce, která předtím byla zdrojem vysoko- frekvenčního impulsu napětí, se vytváří rezonanční signál. Doba, po kterou se obnovuje rovnovážný stav, tj. kdy se o- sy otáčení vracejí z vychýleného stavu, se nazývá relaxační do- ba. Skládá se z T2 - tj. interval od vypnutí impulsu k začátku na- vracení se os otáčení jader a T1 - interval, kdy se osy vracejí z vychýleného do rovnovážného stavu. T2 je vždy kratší než T1 a oba časy charakterizují vyšetřovanou tkáň. Tak např. pankreas má T1 290 ms, T2 60 ms - játra T1380 ms a T2 40 ms. Tyto orgány s nádorovými metastázemi zvyšují hod- notu T1 - pankreas na 840 ms a játra na 570 ms. V praxi se užívá při MR zjišťování právě T1a T2. K tomu, aby se rezonance z určité vrstvy těla, z určitého orgánu zobrazila, slouží tzv. gradientové cívky, které vyvolají vzestup magnetické- ho pole ve směru os x, y a z. Při zapojení gradientové cívky doj- de k precesi vždy pouze v jedné rovině. Kromě zjišťování T1 a T2 se dále měří hustota jader, zejména vodíku. Přístroj MR může zhotovit obrázky buď T1 a T2 či hustoty pro- tonů, nebo komplexní obrázek. Čím vícekrát se měření opakuje, tím je výsledný obrázek dokonalejší; proto jedno vyšetření na MR trvá desítky minut až hodinu. Geometrická rozlišovací schopnost MR je horší než se dociluje u modernějších výpočtových tomografií (CT). Lepší výsledky než CT dává naproti tomu magnetická rezonance u vyšetření lebky, ať již zadní jámy lebeční či spodiny lebeční. Velkým přínosem mag- netické rezonance je, že bez podání kontrastní látky je vidět tepny a jednotlivé oddíly myokardu. Další výhodou MR je, že beze změny polohy nemocného je možné měřit ve třech rovinách lidského tě- la. Pomocí NMR lze také měřit i rychlost krevního proudu. Zařízení MR tvoří magnet, v něm je tunel pro vyšetřovaného, dále vodivé cívky pro homogenizaci statického magnetického po- le, dále cívky gradientové a vysokofrekvenční. Cívky jsou chlaze- ny vodou či vzduchem, magnet tekutým heliem a dusíkem. K zaří- zení dále patří vysoce výkonný řídící počítač, obrazový počítač a kamera (viz obr. č. 31). Magnet sám o sobě váží kolem 10 tun, stínění kolem něj - ze železných plátů - přes 20 tun. Stěna, strop a podlaha vlastní vy- šetřovny mají další stínění, z měděných desek. Pořizovací nákla- dy jsou velice vysoké - několik desítek miliónů, drahý je i pro- voz (zkapalněné plyny!). Nebyl prokázán žádný škodlivý vliv tohoto vyšetření, pouze prohřátí jako u diatermie; je možné opakovat vyšetření. Nelze vyšetřovat nemocné, kteří mají kov v těle (kardiostimulátory, hřeby v kostech, ale i kov v zubních protézách). Pro vyšetření kostí není MR příliš vhodná, protože kosti obsahují málo vodíku. Toto vše se týká MR jako zobrazovací metody, kromě toho se za- číná využívat i jako spektroskopické vyšetření např. sodíku, fosfo- ru či uhlíku. Po dalším rozvoji těchto spektroskopeckých vyšet- ření mohou být obohaceny i dynamické metabolické studie, pro které prozatím jsou jediným metodickým přístupem RA látky. Již v součas- né době se tohoto způsobu užívá ke sledování životnosti transplan- tovaného štěpu. III.2 Stanovení biologických objemů Principem metod, pomocí nichž stanovujeme biologické objemy, je to, že různé látky zaujímají v organismu vždy určitý prostor. Pro některé látky je prostorem celý organismus (např. pro vodu), u jiných je to určitý orgán, u dalších např. intravazální prostor a podobně. I když užíváme obecnější pojem látka, většinou jde o metabolit, tj. o produkt látkové přeměny. Takovou látku označíme vhodným RA izotopem, při čemž pro stanovení objemu je důležité, aby se v určo- vaném prostoru rychle rozptýlil. Nutnou podmínkou je pochopitel- ně i to, že v průběhu stanovení se označená látka ani nerozkládá ani nepřechází do jiného prostoru. V zásadě jde o tzv. princip zřeďovací analýzy (viz obr. č. 32) Neznámý objem - V na obrázku - určujeme pomocí porovnání kon- centrace (= radioaktivity) značeného indikátoru před podáním do organismu a po rozptýlení v určovaném prostoru. Platí, že součin objemu a koncentrace v obou těchto situacích je shodný. Potom tom také musí platit, že neznámý objem - V - se vypočte znásobe- ním objemu indikátoru podílem původní a nalezené radioaktivity. III.2.l.Studie tělesných tekutin Více než 60% tělesné váhy tvoří voda, která je obsažena ve dvou oddílech: - intracelulární tekutina - vnitřní prostředí buňky - extracelulární tekutina - z toho menší část tvoří krev, největší část pak intersticiální tekutina III.2.1.1 Stanovení celkové tělesné vody Původně bylo užíváno ke stanovení celkové tělesné vody tzv. těžké vody, tj. vody se stabilním izotopem vodíku, deuteriem. V současné době se výhodněji užívá tritiové vody (3 H2O), tj. vody, ve které je obsažen RA izotop vodíku, tricium. Stanovení je jednoduché - vyšetřované osobě se podá 1 ml této vody a za 24 hodin se z diluce tricia v plasmě určí volum celkové tělesné vo- dy. Není nutno zavádět korekci na ztráty vody močí a její příjem, protože se voda z těla vyloučí spolu s tritiovou vodou ve stejné koncentraci, jako je ve všech ostatních tekutinách. III.2.1.2 Množství extracelulární tekutiny (ECT) Pod pojem ECT řadíme tu část tělesné vody, která není v buň- kách, ale mimo ně, tj. v plasmě, v interstitiu, v pojivové tkáni, ce- rebrospinální tekutině, v trávicím ústrojí a pod. Původně se užívalo k jejímu stanovení velkých molekul inuli- nu, který se distribuuje prakticky jen v plasmatické a interstici- ální tekutině. Z radioaktivních prvků se užíval RA izotop sodíku - 24Na. To- to vyšetření se provádí tak, že se perorálně podá 1 MBq NaCl a za 24 hodin se odebere 20 ml heparinové krve. Během této doby se sbírá moč a v případě průjmů i stolice. Vzorky krve a moče se pak proměřují buď jako Đ - záření v ná- levkovitých GMT či ve studnicovém scintilačním krystalu jako ga- ma záření (převážně se používá měření jako gama záření!). Vypočítává se napřed množství 24Na v těle po 24 hodinách ja- ko specifická aktivita podaného roztoku x jeho objem bez speci- fické aktivity moči x její objem. Dále můžeme vypočítat tzv. distribuční sodíkový prostor. Ten vypočteme následujícím způsobem : množství 24Na v těle po 24 hod. distribuční sodíkový prostor = ----------------------------------------------- specif.aktivita 24Na v plasmě Výsledkem je objem tekutiny v ml, ve kterém je sodík v těle distribuován. Pomocí 24Na jsou zjišťovány objemy o něco vyšší, než je skutečnost, vzhledem k tomu, že sodík zčásti proniká přes buněčnou membránu. Proto se ve stejném uspořádání užívá stanovení tzv. chlorido- vého prostoru, zjištěného pomocí RA izotopu 82 Br. Dosažený výsledek pak násobíme faktorem O.9 (tím korigujeme výsledek o tu část bromidů, která proniká do erytrocytů resp.se váže na plas- matické bílkoviny). Vyšetřované osobě je možné podat najednou 3 H2O a Na 82Br a stanovit tak vedle sebe celkovou vodu i ECT. III.2.1.3 Stanovení objemu krve Při určování objemu tělesných tekutin je důležitou složkou rov- něž určení objemu cirkulující krve. To provádíme zejména pomocí radioaktivním jodem značeného (125J i 131 J) albuminu. Příprava izotopu Značený sérový albumin (o aktivitě 1 MBq) se rozpustí ve 100 ml fyziologického roztoku. Z toho se odebere 10 ml, přidá se 1990 ml deionizované vody. Dále se odebere 5 ml = STANDARD. Akti- vitu standardu pak změříme ve studnicovém krystalu. Stanovení objemu krve Dalších 10 ml připraveného izotopu je i.v. injikováno paciento- vi. Po 15 min. provedeme odběr 8 ml krve z druhé ruky (do odbě- rové zkumavky přidáváme heparin!), odpipetujeme 5 ml této kr- ve a měříme na studnicovém krystalu 5 minut = VZOREK. Ve zbývajícím vzorku krve určíme hematokrit. Výpočet aktivita standardy x 200 objem krve v ml = ------------------------------------ aktivita vzorku krve masa červených krvinek = objem krve x hematokrit objem plasmy = objem krve x masa červených krvinek. III.2.1.4 Množství intracelulární tekutiny Množství intracelulární tekutiny (ICT) není izotopovými ani ji- nými metodikami postižitelné a volum ICT se stanoví odečtem ECT od celkové tělesné vody. III.2.2 Vyšetření poruch tvorby červených krvinek Toto vyšetření provádíme pomocí chloridu či citrátu s RA izo- topem 59Fe; jeho poločas rozpadu je 45 dnů. Provedení Vyšetřovanému se odebere krev v množství cca 50 ml; centri- fugací se získá asi 25 ml plasmy. Odebereme 3 ml ke stanovení plasmatického železa; ke zbyt- ku plasmy se přidá 700 kB 59Fe. Plasma se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě; během této doby se železo naváže na volnou ka- pacitu transferinu. Pokud by vyšetřovaná osoba měla tuto kapaci- tu plně obsazenou, např. při intenzivní terapii preparáty železa, je potřebné užít plasmu zdravého dárce. Intravenózně se pak vyšetřované osobě podá tato značená plas- ma a v intervalech 10-20-30-45-60 a 90 minut se odebírají vzorky krve. Tak se získá obraz o rychlosti obratu plasmatického železa. Z křivky na semilogaritmickém papíře v závislosti na čase pak je možné odečíst poločas úniku železa z plazmy (je 60-120 minut). Při stavech charakterizovaných zvýšenou poptávkou po železe (ane- mie z nedostatku železa) se tento poločas zkracuje; při snížení tvor- by erytrocytů v kostní dřeni se poločas naopak prodlužuje. Za 24 hodin je možno začít měřit in vivo a to nad křížovou kos- tí, játry a slezinou a to po dobu několika dnů. Nad křížovou kostí je maximum mezi prvním a druhým dnem u zdravých jedinců po počátečním prudkém zvýšení; nad játry či slezinou je toto maximum méně výrazné. Pokud tvorba erytrocytů je v křížové kosti snížena, může zvýšení nad játry či slezinou naopak převažovat. Dalším užívaným parametrem je sledování vzrůstu radioaktivity v červených krvinkách po dobu 12-14 dnů; po této době již aktivita dále nestoupá. Protože je známa podaná dávka železa, je možné hodnotit, kolik z podané radioaktivity se inkorporovalo do krvinek. Koeficient utilizace železa u zdravého jedince dosahuje až 95% - poruchy krvetvorby se projevují snížením tohoto indexu. III.3 Radioimunoanalýza (RIA) a další obdobná stanovení in vitro III.3.1 Radioimunoanalýza (RIA) Předpokladem RIA stanovení je, že sledovaná substance má an- tigenní vlastnosti. Imunizací vhodného zvířete se připraví proti da- né substanci protilátka. Když k ní přidáme sérum se substancí, do- jde k reakci a vytvoření komplexu antigén (substance) + protilátka (specifický vazebný reagens). Vztah antigen x protilátka je defino- ván vazebnou kapacitou protilátky; ta je konstantní - viz obr. č. 33. V případě radioimunoanalýzy soutěží o vazná místa na proti- látce jednak neznačený antigén Ag, jednak značený antigén Ag+. RIA metodika je řazena do širšího pojmu radiosaturační analý- zy (RSA), tj. souboru mikroanalytických metod, kterými je možné stanovovat s pomocí RA izotopů řadu biologicky účinných látek (např. hormonů, ale i léků a pod.). Z metod RSA je RIA historicky nejstarší ale také stále nejužívanější. První práce s RIA metodikou jsou z konce padesátých a začátku šedesátých let - Dr. Yallowová dostala v roce 1977 za tyto práce Nobelovu cenu. Začátek je v pracech Bersona a Erskina spolu s Yal- lowovou. Berson v r. 1959 popsal tuto metodiku pro stanovení inzu- linu, Erskin v r. 1960 pro stanovení thyroxinu. Dnes je stanovováno metodikou RIA více než 500 látek, počet vzorků jen v medicíně je na světě stovky milionů za rok. Ve srovnání s jinými postupy, dříve používanými pro stanovení biologicky účinných látek má RIA metodika následující výhody: - vysoká specifičnost; umožňuje stanovení i v komplexu látek - velká citlivost - 10-12 ug i méně - vysoká přesnost - možnost polo- či větší automatizace; možnost zpracování velkých sérií vzorků Základem RIA je imunochemická reakce antigenu se specifickou protilátkou či protilátkami, probíhající in vitro v přítomnosti radio- indikátoru. Jde tedy o reakci specifická protilátka---neznačený antigén --- značený antigén. Čím je větší koncentrace přirozeného (neznačeného) antigénu v analyzovaném vzorku, tím menší koncentrace značeného antigénu může být navázána na vazebných místech specifické protilátky a na- opak. Klasický způsob Yallowové a Bensona je založen na principu kompetice značeného antigénu (Ag+) a neznačeného antigénu (Ag) o vazebná místa omezeného množství protilátky (Ab): Ab + Ag ---- Ag Ab Ab + Ag+---- Ag+Ab Po dosažení rovnováhy této konkurenční (kompetitivní) reakce zůstává část antigénu volná, nenavázaná na protilátku. Pomocí vho- dné separační metody se oddělí tento volný antigén od komplexu Ag-Ab a změří se aktivita jedné případně obou frakcí. Při optimální volbě koncentrací základních substancí a reakčních podmínek klesá podíl vázané radioaktivity s rostoucím obsahem ne- aktivního antigénu (tj. určované látky) ve směsi. Kalibrační závislost získáme pomocí sady standardních roztoků o známých koncentra- tracích určované látky. Za předpokladu identické imunoreaktivity radioindikátoru a určo- vané látky lze pak z kalibrační křivky stanovit koncentraci určované látky - viz obr. č. 34. III.3.2 Další analytické metody, jejichž základem je kompetiční princip Kromě radioimunoesejí je kompetiční princip základem několika dalších RSA analytických metod: - Kompetiční vazba na proteiny (CPBA) využívá specifické vazby li- gandu (analyzované látky) na proteiny; tato vazba nemá antigenní povahu; nejde tedy o imunochemickou reakci. Tímto způsobem se stanovovala a zčásti stále stanovuje hladi- na thyroxinu či steroidních hormonů. Jako radioligand se užívají plasmatické proteiny, např. globulin. Ve srovnání s RIA má CPBA horší specifičnost a menší citlivost. - Radioenzymová analýza (REA) - jako vazné činidlo ke stanovení biologicky účinných látek se užívá enzym; značená biologicky účin- ná látka je radioindikátorem. Užívá se méně než RIA metody; užití např. pro stanovení katecholaminů (kit Catechola - Imunotech Pra- ha). - Radioreceptorová analýza (RRA) - využívá jako specifické vazné činidlo tkáňové receptory (membránové či cytoplasmatické) a jako radioindikátor je využita značená sledovaná látka (ligand). Výhodou je skutečnost, že touto metodou je určována skutečná biologická aktivita, tj. pouze vlastní látky, nikoliv jejich metabolity či prekurzo- ry. Tato metoda je proto vysoce specifická a citlivá. Nevýhodou je technická náročnost. Užívá se však i ke stanovení přítomnosti (ano-ne) a koncentrace receptorů (steroidní receptory při nádo- rech, např. ca mammy). - Imunoradiometrická analýza (IRMA) - na rozdíl od RIA je RA lát- kou označena protilátka. Rozvoj této metody je spjat s použitím pevných nosičů, na které jsou protilátky navázány a s použitím tzv. monoklonálních protilátek. Nejčastěji je užívána tzv. dvoumístná (two site) IRMA, s dvěma protilátkami proti různým antigenním variantám téhož antigénu. Jedna protilátka je vázána na pevnou fázi, druhá slouží jako radi- oindikátor. Obě protilátky jsou v nadbytku, po proběhnutí reakce se jejich přebytek odstraní promytím. Výsledkem reakce je "sendvič" tvořený antigénem obklope- ným oběma protilátkami. Radioaktivita sendviče je přímo úměr- ná obsahu určované látky v reakční směsi. Koncentrace se ur- čuje pomocí sady standardních vzorků (vzestupné kalibrační křivky). Metoda 3 protilátek (two site sandwich): protilátka mezi dvě- ma antigény - viz obr. č. 35. Výhodou IRMA je vysoká specifičnost a citlivost, kratší inku- bační časy. Značení protilátek je méně choulostivé než značení antigénů; protilátky jsou v nadbytku, takže ani nižší imunoreak- tivita či aktivita neohrozí spolehlivost metody. IRMA se užívá zejména ke stanovování antigénů a protilátek u hepatitid, ke sledování nádorových antigénů a dalších biologic- ky důležitých látek (např. PTH, inzulín a pod.). III.3.3. Základní podmínky RIA metod K tomu, aby příslušná RIA metoda dávala adekvátní výsledky, je zapotřebí splnění několika podmínek: 1) Je nezbytné, aby odpovídala chemická čistota, zejména hlavních komponentů RIA reakce, tj. protilátek (ty navíc musí být co možná i maximálně specifické), standard a značené látky. Nutná je pocho- pitelně dobrá kvalita všech užitých substancí, ne pouze hlavních. Pokud je k RIA stanovení užita firemně vyráběná souprava (kit) či její součásti, měla by tato podmínka být splněna bez problémů. V případě, že je vyvíjena vlastní RIA metoda, je tomuto aspektu ne- zbytné věnovat maximální pozornost jako primární podmínce ús- pěšnosti RIA metody. 2) Je třeba stanovit optimální koncentrace jednotlivých substancí i přesné podmínky jednotlivých kroků daného stanovení. V přípa- dě firemně dodávaných kitů by měla být splněna i tato podmínka. Dříve než přikročíme k sériovému stanovování, je však třeba pro- zkoušet, zda výrobcem udávané podmínky i kontrolní hodnoty od- povídají. Na druhé straně není možné bezdůvodně měnit poměry mezi substancemi, inkubační dobu a další udávané (a ověřené!) podmín- ky; vedlo by to ke zkreslení výsledků. Proto případné změny dělá- me až po dohovoru s výrobcem kitu. 3) Velice podstatnou složkou je separace volné a vázané frakce ; chyba v tomto kroku metodiky může zcela znehodnotit výsledky. Tak jako v jiných činnostech, vyžaduje i práce při RIA meto- dách jednak určitou zručnost, jednak zkušenost s biochemickou a laboratorní prací vůbec a s touto metodikou zvláště. Některé me- tody jsou přitom jednodušší, tj. mají menší počet úkonů, resp. ne- mají složité mezistupně (např. stanovení digoxinu), jiné jsou slo- žitější a vyžadují různé metodické kroky. Postupně si probereme jednotlivé podmínky úspěšnosti RIA sta- novení, které je nezbytné dodržovat v zájmu správných výsledků a tím dobré diagnozy resp. kontroly odpovídající léčby. III.3.3.1 Protilátky Jsou to vysokomolekulární sérové bílkoviny, patřící obvykle do imunoglobulinů - IgG. Jejich molekulová váha je cca 160 000. Tvoří se v lymfocytech jako odpověď organismu na podání určitých látek, vyvolávajících imunologickou odpověď imunogénů. Vhodnými imunogény jsou polypeptidy s molekulovou vahou nad 4 000. Z toho vyplývá, že nízkomolekulární látky a látky nebílkovin- né povahy je nutno navázat na vhodné nosné bílkoviny (albumin, tyreoglobulin a pod.). Tyto konjugáty se pak užívají k imunizaci a k přípravě protilátek. Po úspěšné imunizaci se získají antiséra, obsahující řadu různých protilátek. Je nutno provést kontrolu kva- lity získaných protilátek, jejich případné přečištění a konečně testování jejich afinity, specificity, titru. Afinita protilátky k antigénu se vyjadřuje pomocí konstanty K; tato konstanta ukazuje reaktivitu protilátky s antigénem pří- padně stabilizaci komplexu antigén-protilátka. Velikost konstan- ty je důležitá pro citlivost RIA metodiky; čím vyšší je hodnota K, tím citlivější je příslušná RIA metoda. Specifičnost - schopnost minimálně interferovat s jinými lát- kami. Je závislá na heterogenitě: antiséra vzorku (příbuzné látky, prekurzory, metabolity, fragmenty) je třeba: izolovat vlast- izolovat interferující ní látku látky Titr antiséra - je takové ředění, při kterém je antisérum schop- no vázat jisté množství určované látky, případně značené látky. Antisérum připravené imunizací obsahuje protilátky proti všem antigenním determinantám daného antigénu, ale bohužel také vče- tně nežádoucích kontaminant. Afinita antiséra je tedy součet afinit jednotlivých protilátek a afinita proti nežádoucím příměsím může být vysoká a tak výrazně zkreslovat výsledky. Podle způsobu příp- ravy mohou protilátky být: - polyklonální - značně heterogenní, i když je užito čistých imu- nogénů; jejich příprava není zcela reprodukovatelná; - monoklonální - homogenní, v identické kvalitě ( jednotlivé klony v mediu rostoucích buněk produkují stejné protilátky!) jich je možné připravovat neomezené množství. Dosud připravené monoklonální protilátky mají ve srovnání s polyklonálními zpravidla nižší afinitní konstanty, jsou však velmi čisté a proto vhodné i pro IRMA metodu. III.3.3.2 Radioindikátory Látka, která je označena RA izotopem, musí splňovat následu- jící požadavky: - vysoká specifická aktivita - vyhovující radiochemická čistota - dobrá schopnost vazby na protilátku (stejná jako u neznačeného substrátu - neměnnost během stanovení Nejčastěji užívanými radionuklidy jsou 125 J,3 H,14 C. Postup při přípravě RA indikátoru: - označení (např. jodace 125J) - izolace ze směsi - zejm. chromatografickými metodami příp. repu- rifikace po skladování - testování vlastností - kontrola kvality Radiochemická čistota - charakterizuje obsah radioaktivních nečistot (např.poškozené molekuly, volný jod anorganický a pod.). Ke stanovení se používají chromatografie, elektroforéza atd. Imunoreaktivita - nejdůležitější charakteristika radioindikátoru pro RIA; vyjadřuje jeho schopnost vázat se na specifickou proti- látku. Zkouší se stanovením podílu vázané aktivity ve vzorcích s nadbytkem specifické protilátky a s nulovou koncentrací nezna- čené určované látky. Podíl vazby kvalitního radioindikátoru by neměl být příliš niž- ší než 100% (nevýhodou tohoto způsobu stanovení je velká spo- třeba protilátky!). Pro účely IRMA se jako radioindikátory užívají velmi čisté specifické protilátky, zejména IgG, značené 125J. Ty- to molekuly jsou většinou značně větší, než antigény užívané v RIA. Lze do nich zavést několik atomů 125J a tím dosáhnout vyso- ké měrné aktivity, což je hlavní předpoklad vysoké citlivosti IR- MA metody. Pro úplnost je třeba dodat, že kromě radioindikátorů se ke stanovení biologicky účinných látek používají i neradioaktivní (stabilní) izotopy. Ty jsou základem řady důležitých metod jako enzymoimunoanalýzy (ELISA), fluoroanalýzy (TDx), luminis- cenční analýzy, metaloimunoanalýzy. Tyto metody mohou mít rovněž vysokou citlivost,a umožňují také automatizaci. Dá se očekávat, že tyto alternativní metody se budou postup- ně rozvíjet a do určité míry budou vytlačovat RIA metody. Za- tím je však jejich určitou nevýhodou ve srovnání s RIA metoda- mi větší finanční náročnost (tj. ceny potřebných přístrojů i kitů) a také většinou menší citlivost. U jednotlivých skupin metodik, se ještě o některých alterna- tivních metodikách zmíníme. III.3.3.3 Standardy Předpokladem pro užití standardu v dané RIA metodě je jeho identita s určenou látkou, zejména pokud jde o imunologické vla- stnosti. Na tom je založeno RIA stanovení resp.výpočet hladiny ur- čované látky (porovnání efektu za identických podmínek u vzorků a u standardů o známé koncentraci, např. na aktivitu komplexu a pod.). Jako standard je užíván velmi čistý, homogenní a stabilní substrát určované látky. Jednodušší biologicky aktivní látky (např. hormony štítné žlázy, steroidy či různé léky) jsou dostupné v čisté formě, výsledky lze proto vyjadřovat v jednotkách hmotnos- tních či v jejich látkové koncentraci. Komplikovanější je situace u látek složitějších, např.u polypep- tidových hormonů.Ty bývají méně čisté (obsahují příměsi prekur- sorů, metabolitů, látek příbuzných a pod.). Vlastní jejich stanove- ní je potom zatíženo větší chybou, zejména při současné hetero- genitě polyklonálních protilátek. Proto je nutná kontrola metodik u těchto látek, včetně užívání referenčních (např. WHO) standar- dů. Množství těchto složitějších látek je vyjadřováno v meziná- rodních jednotkách aktivity, tak jako je užíváno doposud někdy např. u inzulínu. Je třeba určovat imunologickou identitu standardu a určované látky; zkoumá se u standardu i vzorku při několika koncentracích (dosaženo ředěním!). Pokud existuje imunologická identita, pak koncentrační závislosti standard a vzorků jsou obdobné; svědčí pro ni i shodné výsledky po různém ředění po přepočtu - viz obr. č. 36. III.3.3.4 Optimalizace podmínek stanovení Předně je nutná standardizace podmínek odběru; jinak je ob- tížné až nemožné porovnávat výsledky. Tato standardizace zahrnuje zejména následující faktory: - příprava pacienta - dieta před odběrem, - klid na lůžku určité období před odběrem - doba odběru v závislosti na denním rytmu vylučování určované látky (většinou ráno) - technika vlastního odběru - nejčastěji se užívá venózní krev; pokud neprovádíme stanovení v celé krvi je třeba oddělit před vlastním stanovením, např. centrifugací, plasmu Při většině stanovení vadí hemolýza. Může docházet také k en- zymové destrukci látek - zejména při skladování - pak je nutné užití vhodných antikoagulancií (heparin, EDTA a pod.). Lipemická (ikterická) séra rovněž mohou komplikovat stano- vení (zákal zhoršuje účinnost měření). Aby se zabránilo zkreslení výsledků, je někdy nutné přidání inhibitorů rozkladu; zpracovává- ní v chladu a pod. Pokud není možné okamžité či rychlé zpracování vzorků a je nutné delší skladování, pak je nejlepší při teplotách kolem -18 C. Stejně je však potřebné počítat s tím, že je omezena doba, po kte- rou je možné určité látky přesně stanovit; tato doba je u různých látek rozdílná a je udávána u každé metodiky. Vhodnější než zjišťování bazálních hladin určitého hormonu jednorázově je stanovování více hodnot po různé době po zátěži (např. u inzulínu, plasmatické reninové aktivity aj.). Kontrolní vzorky - ke kontrole kvality výsledků: - intralaboratorní - mezilaboratorní. Kontrolní vzorky mají být svými vlastnostmi co nejbližší analy- zovaným vzorkům; proto se připravují smícháním vhodných již stanovených vzorků směsná séra (rozpipetovávají se na obje- my pro jedno použití). Je možno je připravit i z nulových sér při- dáním známého množství dané látky. Kromě toho jsou k dostá- ní i komerční kontrolní séra s deklarovanými koncentracemi. Při počátečním testování (a pak průběžně) je třeba určovat průměr- nou hodnotu a rozptyl těchto kontrolních vzorků, stejně jako je- jich dobu stability. Ostatní používané chemikálie nesmí vyvolávat zkřížené reak- ce či nespecifické efekty a tím zkreslit výsledky analýzy. Proto záleží také - a to výrazně - na čistotě užívaných chemikálií. Je třeba vybrat optimální kombinaci a koncentrace potřeb- ných substancí, vhodných metod a uspořádání. Cílem je dosa- žení maximální správnosti a přesnosti výsledků, v požadova- ném rozsahu koncentrací, za minimální dobu a s minimálními náklady. Přesnost a citlivost stanovení závisí na následujících fakto- rech: - sklon kalibrační závislosti - přesnost měření RA - koncentrace určované látky (profily přesnosti) Pro optimalizaci podmínek RIA metodiky je tedy třeba zajis- tit kromě optimalizace objemů a složení reakční směsi (přede- vším koncentrací specifické protilátky a radioindikátoru) také vhodnou volbu podmínek inkubace. Především jde o její dobu a teplotu. Teplota: inkubace při nižších teplotách snižuje velikost inku- bačního poškození radioindikátoru a umožňuje dosažení vyšší citlivosti. Delší inkubací se naopak zvyšuje možnost poškození radioindikátoru. Mezi teplotou a délkou inkubace existuje nepří- mý vztah : ve vyšších teplotách je doba analýzy zkrácena. Někdy je používána i tzv. sekvenční technika - napřed prein- kubace neznačeného antigénu s protilátkou, pak až přidání ra- dioindikátoru. Tento postup má vliv na tvar kalibrační křivky i na citlivost metody - viz obr. č. 37. III.3.3.5 Metody separace V zásadě je při RIA metodě nutné od sebe oddělit volnou a vá- zanou frakci, tak aby mohla být měřena radioaktivita jedné z nich či separovaně mohly být měřeny obě tyto frakce. Separace by měla: - být kvantitativní a dávat reprodukovatelné výsledky - mít stejnou účinnost pro standardy a analyzované vzorky - být rychlá, jednoduchá a levná Nejstarším způsobem separace je chromatoelektroforéza, která byla použita již Yalowovou a jejími spolupracovníky při prvních RIA sledováních. Nejčastěji je však užívána metoda vychytávání či vysrážení s následnou centrifugací. Jedna z frakcí se převede do pevné fáze, např. volný antigén pomocí vhodného sorbentu - aktivní uhlí - a pevná a kapalná váze se pak oddělí centrifugací. Obvykle je po centrifugaci měřena aktivita kapalné fáze, tj. vázané frakce. Me- toda vychytávání na sorbent je však časově závislá a proto může být zdrojem chyby. Někdy se do pevné fáze převádí komplex antigén - protilátka; používá se přitom nespecifické precipitace přítomných proteinů či gamaglobulinů. K tomu účelu jsou užívány anorganické soli (např. síran amonný či sodný), organická rozpustidla (etanol, aceton). Nejčastěji je však užíván tzv. PEG (polyetylénglykol); měří se pak aktivita precipitátu uvedeného komplexu. Je třeba dávat pozor na možnost zkreslení výsledků v důsledku vysoké nespecifické vazby! Hodně se používá specifické precipitace pomocí druhé (preci- pitační) protilátky, ta se váže na komplex antigén - protilátka a tím ho sráží. Opět se měří radioaktivita sraženiny. Může být použito ve variantě, že komplex první a druhé protilátky je přidá- ván v suspenzi, či že druhá protilátka je vázána na pevných nosi- čích. Výhodou je větší citlivost metodiky, nevýhodou jsou naopak vyšší náklady a větší časová náročnost metodiky. Perspektivní jsou imunosorbenty a separace na pevné fázi (na ni může být vázán antigén, protilátka i druhá protilátka); tento přístup umožňuje lepší separaci a automatizaci. Výhodou je nízká nespecifická vazba a tím menší možnost zkreslení výsledků , nevý- hodou je pomalejší průběh reakcí a náročná příprava imunosorbentů. V současné době jsou kromě sorbentů ve formě zkumavek, kuli- ček, mikročástic užívány magnetické mikročástice jako imunosorben- ty; separace pak probíhá v magnetickém poli. III.3.3.6 RIA analýza - provedení Postup při RIA metodě lze tedy shrnout takto: a) odběr, zpracování a skladování vzorků b) příprava roztoků resp. úprava vzorků před stanovením c) dávkování roztoků a vzorků do zkumavek d) inkubace (případně opakované) e) separace - viz předešlou stránku f) měření radioaktivity g) výpočet a vyhodnocení vzorků. Pokud jde o odběr a další zpracování vzorků, resp. další pří- pravu reagencií, liší se u jednotlivých metod a proto tyto údaje uvádíme přímo u popisu těchto metodik. ad c) Dávkování reagencií Problémem je provedení velkého množství - většinou několika set - pipetací malých objemů; převážně 50-100 ul (ale i menších objemů) do reakčních zkumavek. Toto je hlavní zdroj chyb; přitom není nutné pipetovat absolutně správné množství ale pipetovat s co možná nejmenší chybou stále stejné množství. K tomuto účelu se užívá: - skleněných pipet (ale přes hadičku!) - stříkaček - mikropipet s měnitelnými (či nastavitelnými) nástavci - ruční i automatické dávkovače Užívaná dávkovací zařízení je třeba kontrolovat: - vizuálně - kontrolou přesnosti Nejvýhodnější k tomuto účelu je gravimetrická metoda (s des- tilovanou vodou; její určitý objem vážíme na analytických vahách), fotometrická či s užitím RA látek. Správnost by se měla pohybovat v rozmezí 1-2%, přesnost cca 1%. ad d) Inkubace Inkubace v nižších teplotách se provádí v chladničkách či chlazených boxech; ve vyšších teplotách v termostatech průtokových či třepacích lázních s regulací teploty. Při řadě metod se užívá tzv. laboratorní teploty, tj. kolem 25 stupňů Celsia. ad f) Měření radioaktivity Principem je měření RA za stejných podmínek. Jako detektory se užívají: - pro měření gama zářičů studnové detektory (125 J) či vícedetek- torové měřiče pro 12-16 či více vzorků najednou - pro beta zářiče v současné době prakticky pouze automaty s mož- ností měřit větší počet vzorků (řetězový či kazetový zásobník) Mikroprocesory při tom v obou případech umožňují řízení pro- cesu měření a automatizaci výpočtu i hodnocení výsledků. Kontrolu stability měření provádíme měřením za pomoci kont- rolního zdroje záření (etalon 129 J). Provádí se nejméně 1x denně a rovněž během měření každé série vzorků. Přesnost měření závisí na počtu naměřených impulsů. Proto re- lativní chyba klesá se zvýšeným množstvím impulsů a naopak přes- nost měření za těchto podmínek vzrůstá. Důležitá je tedy i doba měření; měla by být taková, aby naměřený počet impulsů se pohybo- val od 1 000 do 10 000 impulsů (pak je statistická chyba měření mezi 1-3%). ad g) Vyhodnocování výsledků Původně byly užívány pouze manuální (ruční) grafické metody, při kterých se sestrojovala kalibrační křivka z jednotlivých ka- libračních bodů; z křivky se pak odečítaly hodnoty analyzovaných vzorků - viz str. xx . Je to poměrně pracný způsob, znemožňující přitom vypočítávat některé parametry, důležité pro kontrolu stabi- lity metodiky, stejně jako užívat statistické metody zpracování výsledků. Proto je v současné době prakticky výhradně užíváno počítačo- vé vyhodnocování, které optimálně proloží kalibrační závislost, vyloučí chybné výsledky, provede kontrolu kvality a validity výs- ledků a přesně vypočte hledanou koncentraci. III.3.3.7 Kontrola kvality RIA metodik Podle Závady a sp. (1989) má kontrola kvality RIA metodik splňovat následující hlavní úkoly: - výběr optimálních metodik a komerčních výrobků; naopak eliminaci metod nekvalitních - tuto úlohu splňuje výběrová kontrola - unifikaci a standardizaci užívaných metodik, v síti RIA labora- toří - centrální garanční kontrola (tyto oba úkoly má na starosti referenční RIA a RSA laboratoř pro ČR). - kontrola rutinních stanovení a kritické posouzení výsledků ana- lýz se v každé laboratoři provádí individuálně Úkoly referenční laboratoře: - centrální výběrová kontrola - ověření nových postupů - doporučení k zavedení metody do praxe; zkouší se vždy nejméně 3 šarže; několik laboratoří najednou provádí zkoušení (centrální garanční kontrola pro vybrané metodiky - průběžná a dlouhodobá kontrola kvality práce laboratoří v síti RIA pracovišť Referenční laboratoř je v Ostravě; vede ji Dr.Bartoš. V novém uspořádání českého zdravotnictví tato laboratoř funguje za finanč- ní náhradu, kterou jednotlivé laboratoře platí. Lokální kontrola, to je kontrola, která by měla probíhat v rámci každé laboratoře. Zahrnuje dvě hlavní složky: a) lokální ověřovací kontrola je určena k ověření nové metodiky, k určení normálních a patologických hodnot b) lokální rutinní kontrola reprezentuje průběžné každodenní a dlouhodobé sledování spolehlivosti výsledků Pro provádění lokální kontroly vyšel metodický pokyn, kterým by se měly všechny laboratoře provádějící RIA metody řídit. Sledované parametry při lokální kontrole Při RIA metodikách jsou sledovány následující parametry: - celková RA vzorku: je základem pro výpočet dalších parametrů - podíl specifické vazby : blank (samostatné rozpustidlo, např. plasma) bez přídavku určované látky - podíl nespecifické vazby : blank bez specifické protilátky - tvar kalibrační křivky: možno sledovat vizuálně, pomocí směrnice křivky či podle interceptů - nejčastěji se užívá I50 (snížení množství radioaktivity o 50%) - citlivost: nejmenší detekovatelné množství odlišitelné od nulo- vého standardu - přesnost stanovení: souhlas výsledků souběžně zpracovávaných replikátů (du-tri-tetra-penta atd.); většinou se vyjadřují v % va- riačních koeficientů; čím jsou vyšší, tím je přesnost menší - sledování hodnot kontrolních vzorků: zpravidla 3 kontrolní vzor- ky ať již komerční nebo vlastní připravené - validita : souhlas s klinickým stavem a s údaji v literatuře Otázky každodenní kontroly přesnosti laboratorní práce jsou pravidelnou součástí práce každé laboratoře, stanovující hladiny látek důležitých pro organismus. Předně proto, že pouze za před- pokladu správnosti výsledků může laboratoř přispět k diagnostice i kontrole léčby pacientů. Dalším důvodem je i to, že takové labo- ratoře, které dodávají nestandardní výsledky, se v současné konku- renci laboratoří stanou málo seriózní a proto bude klesat počet vzorků, které budou dostávat ke zpracování. V současné době dochází k tomu, že sice stoupá počet různých laboratorních vyšetření, stoupají však také kapacitní možnosti la- boratoří v důsledku modernizace techniky. Proto je také pravděpo- dobně nutné považovat současný vzestup počtu laboratoří provádějí- cích tatáž stanovení pouze za dočasný. To povede - a tento proces již také začal - ke zvýšení konku- rence a ke tlaku na tato laboratorní pracoviště, aby se od ostat- ních odlišila, zejména kvalitou výsledků a cenou. Je nutné zdůraz- nit obě tato hlediska, protože snížení ceny vyšetření při snížení jejich přesnosti a kvality by vedla k opačnému výsledku, tj. ke snížení poptávky po službách takovéto laboratoře. Proto je tak důležité, aby v laboratořích zpracovávajících klinické vzorky byla důsledně a trvale dodržována určitá pravidla, zajišťující dobrou kvalitu výsledků. To jsou právě zásady SLP, je- jichž neustálé dodržování k zajištění trvalé kvality výsledků ve- de. Jejich principem je několikastupňová kontrola práce jednotli- vých pracovníků i pracovních postupů. Stejně důležitá je i pravi- delná kontrola funkce přístrojů a dokumentace (nejlépe přímo zápi- sy jednotlivých přístrojů!) všech výsledků. Pro každou prováděnou metodu je nutné mít tzv. SOP, tj. závazný standardní operační pos- tup. Celý proces zavádění SLP do všech našich laboratoří je zatím na samém začátku. V nejbližší době se však dá očekávat, že labora- toře RIA budou musit mít (obdobně jako na odd. klinické biochemie, hematologie, pro kontrolu léků a pod.) akreditaci. Prvním krokem k jejímu získání je udělení certifikátu správné laboratorní praxe (SLP, anglicky GLP), který je vždy udělen pro určitý typ práce, např. klinická biochemie či hematologie, zkoušení léků, laborator- ní nukleární mediciny a pod. Napřed (první 2 roky) je vydán na omezenou dobu (např. na dva roky). Po další kontrole pak je vydán certifikát na neomezenou do- bu, který je platný pro všechny země OECD. III. UŽITÍ IZOTOPŮ PŘI SLEDOVÁNÍ METABOLICKÝCH POCHODŮ Aplikace izotopů při sledování činnosti orgánů či jejich užití v RIA metodách, pro určení hladiny látek, jinými metodami obtíž- ně či méně přesně zjistitelných, přináší nesporně mnoho přínos- ného. Pravá doména izotopů leží však jinde. Zobrazování orgá- nů umožňují též některé další metodiky - od rentgenových, NMR (nukleární magnetická rezonance) až po ultrazvukové. Stejně to platí o RIA (a podobných dalších metodách s užitím izotopů)-ty rovněž mají konkurenci v alternativních metodikách - od chro- matografie až po ELISA atd. Zatím však nejsou izotopové metody srovnatelně nahraditel- né pokud jde o možnost sledování metabolických pochodů a je- jich dynamiky, a to na všech úrovních - od úrovně celého orga- nismu, přes orgánovou, tkáňovou, buněčnou úroveň až na úro- veň jednotlivých enzymových soustav. Prozatím neexistuje al- ternativní metoda tohoto sledování, a to dynamického, schop- ná tohoto sledování na stejně dobré úrovni. Dá se však před- pokládat, že takovouto metodou bude perspektivně schopná se stát, alespoň v některých oblastech, NMR spektroskopie. Bylo by škoda zůstat při užití izotopů ve fyziologii pouze při sledování funkce orgánů či stanovení hladin důležitých látek, i když se tak, bohužel, v praxi v podstatné míře doposud děje. Proto si postupně probereme principy metabolických studií a hlavní příklady možností přístupu sledování přeměny látko- vé hlavních živin pomocí značených RA látek. Nejprve tuto pro- blematiku probereme obecněji, tj. uvedeme příklady možnos- tí sledování jednotlivých metabolických cest, potom přistou- píme k možnostem studia větších problémů pomocí znače- ných sloučenin. III.1 Kinetika dějů v živých organismech Ještě koncem třicátých let se věřilo, že látky v buňce se vytvoří během jejího růstu a až do té doby, než je buňka po- škozena či zničena, v ní uvedené látky setrvávají nezměně- né. Od počátku 40-tých let se ale začalo prokazovat, že slož- ky živého organismu jsou v dynamickém stavu, tzn.že např. sacharidy, tuky, ale i enzymy a p. jsou průběžně odbourává- ny a nahražovány jinými, nově vytvořenými. Dochází tedy k metabolickému obratu (turnover), který je možné sledovat pouze pomocí indikátorů, tj. látek označenými radioaktivní- mi, v některých případech i stabilními izotopy. Rychlost obratu není ve všech orgánech a u všech látek stejná - obecně platí, že u metabolicky aktivních komponent je rychlý obrat, strukturální složky pak mají obrat pomalý. Nejjednodušší případ je, když radioaktivní indikátor lze do organismu vpravit najednou (v jednom okamžiku) - jde o tzv. bolus. Příklad: značená glukóza, i.v. podaná, se smísí s neznače- nou glukózou v organismu a její specifická aktivita stále kle- sá; tento pokles je exponenciální s časem a poločas obratu se pak dá vypočítat jako poločas rozpadu RA izotopu. Někdy se musí indikátor "vyrobit" v jiném organismu­izo- lovat ho a pak až podat dalšímu organismu. Příklad: Psům byl podán cystein znač. 35 S a lysin zna- čený 14 C, za 24 hodin jim byla izolována krev. Z krve jsou separovány bílkoviny a dalšímu psu je podána dvojitě zna- čená bílkovina ­ viz obr. č.52. V časových intervalech je odebírána krev resp. plasma, je provedena izolace gamaglobulinu a aktivity 35 S i 14 C jsou sle- dovány v průběhu 0-60 dnů. Pokud nebyla podána vlastní zna- čená látka, ale její prekursor, má tento děj jiný průběh - viz obr. č. 53. Napřed se z prekursoru vybudovává daná látka; dochází k vze- stupu aktivity. Pak je prekurzor spotřebován a značená látka se postupně odbourává; v této fázi dochází k poklesu aktivity. Je možné studovat i otázku, zda nějaká látka je či není prekur- sorem určitého produktu. Pokus uděláme tak, že sledujeme jed- nak časovou křivku látky, o které předpokládáme, že je prekurso- rem, jednak předpokládaného produktu - viz obr. č. 54. Vidíme, že u prekursoru je napřed patrný vzestup, pak pokles, za- tím co u produktu se projevuje pozdější vzestup a pokles od okam- žiku, kdy se obě křivky protínají. III.1.1 Izotopové metabolické studie; základní údaje Izotopové metabolické studie jsou pro užití izotopů v biologii a biochemii nejpříznačnější, protože zde je tato metoda zatím nena- hraditelná. Postup těchto studií je takový, že do organismu apliku- jeme látku, jejíž metabolismus hodláme studovat, ve značené for- mě. Po určité době pak izolujeme metabolity této látky a měříme jejich radioaktivitu. Označení může probíhat delší dobu, případně se přívod znače- né látky opakuje. Pokud označení probíhá kratší dobu, tak musí mít aplikovaný značkovací preparát vyšší specifickou aktivitu. Mo- hou být použity i molekuly látek dvojitě značených (např. 14 C a 3 H, 14 C a 32 P či 3 H a 32 P). Kombinovat je možné i radioaktiv- ní a stabilní izotopy. Ukončení značení se dosahuje v případě buněk či tkání fixač- ními roztoky či zmrazením (příp. v kombinaci s odstraněním pří- stupu RA izotopu - tj. nahražení kultivačního media se značeným izotopem novým neaktivním mediem). V pokusech in vivo se zna- čení neukončí usmrcením zvířat; tkáně i po smrti organismu zů- stávají určitou dobu ještě živé. Proto je třeba urychleně provést také preparaci a fixaci (zmrazení) tkání; jinak by výsledky byly ve větší či menší míře zkresleny. Podávání RA látek zvířatům Pro sledování absorbce se užívá následujících způsobů: - perorálně (p.o.) s potravou (potravu slabě navlhčit, aby nedošlo k jejímu rozprá- šení!) s vodou v kapslích žaludeční sondou (méně fyziologické ale přesnější!) - intraperitoneální (i.p.) aplikace - nitrožilní (i.v.) aplikace - subkutánní (s.c.) aplikace. III.1.1.1 Radiorespirometrie Sleduje se vydechování 14 CO2 ze značeného prekursoru oz- načeného 14 C. Jak vypadá zařízení pro větší zvířata (zejm. sav- ce) , viz obr.č. 55. III.1.1.2 Metabolický obrat (turnover) Veškeré složky organismu jsou v dynamickém stavu, to zna- mená, že v různých tkáních jsou tyto látky stále nově vytváře- ny, zatím co jiné molekuly stejných látek jsou odbourávány. Metabolicky aktivní komponenty tkání mají rychlý obrat, kom- ponenty strukturální mají obrat pomalý. Sledování obratu látek je možné buďpomocí vlastní znače- né sloučeniny (např. 14 C-glukózy či bílkovin značených 14 C, 35 S a pod.) či jejího prekursoru. V tomto případě pozorujeme napřed vzestup aktivity (to se vytváří vlastní látka) a pak případ- ně po nějaké době konstantní úrovně její pokles. Z časových změn specifické aktivity můžeme určit, zda urči- tá látka je či není prekursorem druhé látky. Tuto problematiku ještě budeme podrobněji probírat v dalších částech skript. III.1.1.3 Vyšetření resorbce tuků a mastných kyselin K vyšetření resorbce tuků se používá tuků s nenasycenými mastnými kyselinami (nejčastěji triglycerid s kys. olejovou­tri- olein), které mají navázán v místě dvojné vazby radiaktivní 131 J (resp. 125 J). Pokud jde o vyšetření resorbce mastných kyse- lin, užívá se obdobně značená olejová kyselina. Značený triolein se podá perorálně (u lidí spolu se šlehač- kou či mlékem, u zvířat s tukem, který je součástí jejich stra- vy, např. s lojem). Před vyšetřením je třeba standardizovat po několik dnů pří- jem tuků (u lidí na 100 g tuků denně, u zvířat úměrně jejich nor- málnímu příjmu). K eliminaci případných regulačních zásahů štítné žlázy je podáván Lugolův roztok (roztok jodu), který čin- nost thyreoidey zablokuje. V průběhu několika dnů se pak sle- duje jednak neresorbovaný zbytek ve stolici, jednak resorbo- vaná část v krvi. Provedení u pacientů Vyšetřovaný pacient vypije nalačno emulsi trioleinu, která obsahuje 370 kBq 131 J. Stolice se sbírá 3 dny a změřená akti- vita se přepočte na % podané dávky (nad 3% je výsledek sus- pektní, nad 4,5% již je prokázána porucha resorbce tuků). Po- kud jsou sledovány změny v krvi, pak se po dobu 8 hodin ode- bírá krev a stanovuje se v ní aktivita. Zpomalený růst aktivity v krvi indikuje poruchu resorbce, proto se aktivita objevuje pomaleji v krvi - viz obr. č. 56. Stejným postupem se provádí i stanovení resorbce 131J ­ ky- seliny olejové. Toto vyšetření může odlišit primární poruchu re- sorbce (stejně postihuje triglyceridy jako mastné kyseliny) a po- ruchu sekrece pankreatu (proto jsou neutrální lipidy většinou neresorbovány, zatím co volné mastné kyseliny se vstřebávají normálně). V tomto případě stanovujeme aktivitu spíše v krvi než ve stolici. III.1.1.4 Vyšetření bílkovinného metabolismu A. Resorbce bílkovin Obdobně jako resorbci tuků je možné sledovat i resorbci bíl- kovin a to pomocí sérového albuminu, značeného 125 J, 131 J (příp. aminokyselin či jiných bílkovin či jejich frakcí). Metoda je zatížena poměrně značnou chybou, zejména v důsledku mož- nosti odštěpování volného značeného jodu z bílkovinné mole- kuly. Problémem se může rovněž stát porušení molekuly bílko- vin při jodaci. B. Obrat bílkovin O poruchách tvorby bílkovin v těle a o jejich ztrátách může- me získat základní informaci z vyšetření hladin krevních bílko- vin a také z relativního poměru bílkovinných frakcí (zejm. albu- min a globulin). Snížená koncentrace bílkoviny v krvi však ješ- tě nemusí nutně znamenat poruchu v její tvorbě či její zvýšené ztráty. Je třeba získat informace o přeměně bílkovin, např. o směnitelném množství bílkovin, o jejich distribučním prosto- ru, obratu a pod. Snížená produkce bílkovin se vyskytuje při jaterních poru- chách (snížení syntézy v jaterním parenchymu) a při nedosta- tečném přívodu aminokyselin. Zvýšení produkce bílkovin přichází při myelomu, zvýšené ztráty bílkovin u nefrózy a u enteropatií. Obrat bílkovin je sledován pomocí 131J-albuminu. Je nut- né používat albuminu čerstvého a jodace provádět tak, aby molekula albuminu obsahovala maximálně 2 atomy jodu (jinak není zaručen stejný metabolismus značeného albuminu a albu- minu v organismu). Provedení: Je aplikováno i.v. 1500 kBq 131J lidského albuminu, za 20 minut se provede první odběr a pak dalších 8-10 dnů je sledo- vána aktivita v krvi. Z křivky je možné odečíst poločas mizení albuminu (u zdravých lidí je to 18-22 dnů, při poruše metabolis- mu bílkovin pouze 3-5 dnů) - viz obr. č. 57. Zároveň je možné shromažďovat stolici a moč a zjišťovat v nich vyloučenou aktivitu. Z rozdílu podané dávky a vyloučené aktivity je možno určit retenci bílkovin. Poměr aktivity v plasmě a aktivity retinované bílkoviny vyne- sený do grafu nám pak ukáže vyrovnání koncentrace albuminu mezi intravaskulárním prostorem a celkovým distribučním pro- storem. Z toho je možno vypočíst celkový distribuční prostor, po vynásobení zjištěnou koncentrací albuminu pak i celkové množství výměnného albuminu v těle - viz obr. č. 58. Z poměru denních ztrát albuminu značeného a jeho denní reten- ce je možné vypočíst jeho denní obrat. Pozn.: Aby se zabránilo zpětné resorbci odštěpeného RA jodu ve střevě, podává se vyšetřovaným osobám či zvířatům několik dnů po 5 ti hodinách určité množství iontoměniče. Na něj se odštěpený jod naváže a nemůže pak zkreslovat výsledky. C. Ztráty bílkovin stolicí (porucha střevní stěny) Provádí se pomocí 51 Cr - albuminu. Chromát sodný značený 51Cr je pevně navázán na albumin. Za normálních podmínek pouze malé množství 51 Cr albuminu prostupuje cévními cestami do gas- trointestinálního traktu. Proto test, při němž se i.v. aplikuje 51Cr albumin a po 4 dny se sleduje aktivita ve stolici, odliší nefyziologic- ké (patologické) ztráty albuminu stolicí. Provedení: - udělat kontrolní odběr stolice před aplikací (24 hodinový vzorek) - injikovat i.v. 51 Cr albumin o aktivitě 1500 kBq (1000x naředěnou aktivitu užít jako standard) - odebrat 24 hodinové vzorky stolice za 24-48-72-96 hodin - změřit buďhomogenní alikvot nebo na celotělovém měřiči ce- lé vzorky Výpočet: % exkrece = akt. stolice - pozadí ----------------------------- standarda - pozadí Hodnocení: Exkrece menší než 1% znamená fyziologické ztráty. III.1.1.5 Sledování přeměny glycidů Pro sledování přeměny uhlovodanů se užívá zejména glukóza, značená 14 C či 3 H. Při značení 14 C je glukóza značena na prv- ním, resp. šestém uhlíku nebo je značena na všech uhlících, tj. uni- verzálně (připravená in vivo označením). Sleduje se přitom jak pře- měna glukózy na její metabolity (laktát, glycerol, alanin atd.), tak je- jí oxidace. V případě značení 3H se užívá zejména glukózy znače- né na prvním, třetím, čtvrtém a šestém uhlíku. Jako příklad užití značené glukózy ke sledování mechanismu hypoglykémie je možno uvést práci Chenga a Kalanta (1970) - viz obr. č. 59. Pro určení turnoveru glukózy s užitím značených substrátů existuje řada modelů, vycházející jak z jednoduché bezkompart- mentové analýzy, tak z 2 či více kompartmentových modelů. Pro doplnění ještě informaci, že izotopová technika, např. s tri- ciem značenou glukózou, může být užita i v kombinaci s euglyke- mickým klempem při sledování metabolizace glukózy za stavů normo- a hyperinsulinémie. Několik slov k tomuto pokusu: Skupinu tvořilo 45 zdravých o- sob ve stáří cca 40 let (23 m , 22 ž). Hladověli přes noc, před vlast- ním stanovením 1/2 hodiny leželi v klidu. Pak podána značená glu- kóza (označená na šestém uhlíku) do infuze; podaná radioaktivita odpovídá množství cca 10 uCi na osobu, za dalších 15 minut přidá- na do infuze 1-14C - palmitová kyselina, navázaná na lidský albu- min. Po 75 minutách se pak odebíraly v 5-ti minutových intervalech vzorky krve. Ke stanovení objemu plasmy se do infuze přidal za 60 sekund 125 J - lidský albumin a za 15-25- a 35 minut se odebíraly vzorky krve. Ke sledování vlivu růstového hormonu či insulinu se po 5ti odběrech 5ti minutových - tj. za 95 min.- přidal jeden ze sledova- ných hormonů. Na obr. č. 60 vidíme vliv stoupajícího množství insulinu na pří- tokovou a odtokovou rychlost plasmatické glukózy - přítok se stoupající dávkou poklesá a narůstá její odtok. Zatím ponechá- me stranou pravou část obrázku, k té se ještě vrátíme. Na dalším obr. č. 61vidíme vliv podaného insulinu - 0,05 U na kg hmotnosti - na inkorporaci glukózo-6-fosfátu značeného 14 C do glycerolu (spodní část obrázku) - resp.14 C - palmitové kyse- liny do mastných kyselin. Nepřerušované čáry ukazují vliv insuli- nu. Pouze o něco mladší je švýcarská práce na 9 pacientech z Cu- ryšské nemocnice (Kelter a Frosch, 1972). Opět šlo o pacienty cca 40 let staré. Intravenózně do kubitální žíly byly injikovány 14 C xy- lit - l4 C sorbit - resp. l4 C fruktóza - v dávce 0,5 g a 1,5 uC/kg. Po 5- 10-15-20-30-45-60-90-120 a 180 min. byly provedeny odběry kr- ve. Následující obr. č. 62 ukazuje křivky u xylitu a sorbitu. U metabolismu glycidů (stejně jako proteinů) se při studiu je- jich přeměny užívá vedle radioizotopů i stabilních izotopů, např. 2 H, 13 C, 15 N; ke stanovení je v tomto případě potřebný hmoto- vý spektrograf, tj. zařízení dostupné pouze na malém počtu pra- covišť u nás, přesto odkazuji např. na práci Veiva a sp.(r. 1977), která se touto problematikou zabývá. III.1.1.6 Sledování tukového metabolismu Mastné kyseliny značené 14C byly používány ke sledování tu- kového metabolismu již od šedesátých let. V práci Chenga a Ka- lanta (1970), kterou jsem již citoval pokud jde o sledování meta- bolismu glukózy (viz obr. č. 61), byl sledován zároveň metabolis- mus palmitové kyseliny, značené 14 C, která byla přidána do in- fuse za 15 minut po glukóze. Sledovány byly jednak koncentra- ce jednak specifické aktivity volných mastných kyselin a mast- ných kyselin v plasmatických triglyceridech. Složitou otázkou je sledování in vivo syntézy lipidů, ať již mastných kyselin či cholesterolu. K tomuto účelu se užívala řa- da značených prekurzorů, ať již jde o acetát, mevalonát, ale i o pyruvát či glukózu označené 14 C. Problémem je zde otázka poolu uvedených substrátů v těles- ných prostorech a tím i otázka velikosti diluce značkovače v růz- ných kompartmentech organismu. Tyto problémy nejsou pouze s triciovanou vodou, jak již bylo popsáno Dietschem (1953), při užití velkých dávek aktivity 3 H2O však vyvstávají jiné problémy a to s exspirací značené vody a pod. Kinetická data o cholesterolu mohou být získána po aplikaci značeného cholesterolu. Příklad můžeme vidět např. v práci Go- odmana a sp. (1983), kteří sledovali křivky specifické aktivity po i.v. aplikaci 14C-cholesterolu (cca 1800 kBq). Obrat cholesterolu je pak sledován po dobu 30-40 týdnů. Autoři užili tří kompartme- ntového modelu, v jiných studiích jsou tyto modely ještě složitěj- ší. Na následujících dvou obrázcích č. 63 a č. 64 můžeme vidět křivky obratu (turnoveru) cholesterolu. Pokusy byly prováděny v Izraeli u dvou dobrovolníků, kteří se vyznačovali poruchami pře- měny lipoproteinů - konkrétně u nich chyběly betalipoproteiny. Každý z obou dobrovolníků dostal i.v. cca 900 kBq 14 C - cho- lesterolu a v časových intervalech až do 30-40 dnů po podání se odebírala krev a stanovovala se v ní aktivita. Výsledky studie se porovnávaly s výsledky dosaženými u 82 osob - zčásti normoli- pidemických, zčásti hyperlipidemických (buď zvýšena hladina cholesterolu, nebo triglyceridů či obou frakcí najednou). U obou osob byl nalezen pokles specifické aktivity choleste- rolu na 1% za 140-190 dnů (osa x - dny), zatím co u normálních osob v průměru až za 254 dnů. Touto metodou je tedy možné stanovit denní obrat cholesterolu přesněji a snáze než stanovo- váním produktů degradace cholesterolu, tj. neutrálních steroi- dů a žlučových kyselin ve stolici. Po i.v. aplikaci 14C- palmitátu se označí po jaterních triglyce- ridech (TG) také lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL), je- jichž metabolizaci je možné analyzovat pomocí multikompart- mentového modelu. Je možné i označení VLDL pomocí konti- nuální infuzí podaného 3 H - glycerolu, což pro sledování kine- tiky představuje interpretačně menší problém. III.2 Experimenty in vivo Experimenty na celém zvířeti mají pochopitelně výhodu v po- rovnání s experimenty in vitro a to v tom, že nejsou nijak ovlivně- ny možnými artefakty při přežívání tkání. Naproti tomu je ale in- terpretace získaných výsledků mnohem složitější, protože kromě sledovaných resp. kontrolovaných dějů se může uplatnit celá řada dalších faktorů. Nevýhodou stopovacích experimentů in vivo u člověka či zvíře- te se však může stát jejich značná nákladnost, protože potřebná aktivita značeného metabolitu, kterou aplikujeme, je vždy řádově či o několik řádů vyšší než v experimentech in vitro. Pokusy na malých laboratorních zvířatech, kdy se podávají až kBq (tj. stovky uCi), jsou ještě cenově přijatelné, neumožňují však většinou opakované odběry vzorků krve, což je při dynamických sledováních podstatné. Tento problém se proto obvykle řeší tak, že se vždy použijí jednotlivá zvířata (nebo skupiny dvou až šesti zvířat) v různých sledovaných časových intervalech. III.2.1 Způsob aplikace značené sloučeniny Stopovací látka může být v pokusech in vivo podávána (viz i str. OO) perorálně, intravenózně nebo intraperitoneálně. V prv- ních sledováních byla značená sloučenina homogenně rozptýle- na v potravě experimentálních zvířat. Tento jednoduchý způsob však nedovoluje změřit celkovou podanou aktivitu s dostatečnou přesností. Proto se v současné době často podává značená aktivita per- orálně sondou do žaludku v přesně stanoveném volumu. Nefyzi- ologický způsob podávání je tak vyrovnán přesností stanovení přívodu izotopů. Aplikace intraperitoneální je velmi častá zejména u malých laboratorních zvířat. Její provedení je velmi jednoduché, je si ale nutné uvědomit určité omezení této aplikace. Intraperitoneál- ní cestou je totiž možné podávat pouze sloučeniny velmi malé molekulové váhy, které se z peritonea vstřebávají rychle a obje- vují se v krevním řečišti s velmi malým zpožděním. Intraperitoenální aplikace se často používá pro preferenční označení epididymální tukové tkáně nebo bránice. Uveďme zde příklad užití této aplikace: Porovnali jsme intraperitoneální podání značeného acetátu- 1-C14 s jeho intravenózní aplikací a to tak, že jsme měřili aktivitu exspirovaného CO2 (vzniklého z 14 C - acetátem označeného ace- tylCoA a následnou oxidací v Krebsově cyklu). Z obr. č. 65 je pa- trné, že při intravenózní aplikaci je aktivita CO2 maximální v nej- kratším měřeném čase (v intervalu 0-5 minut) a pak klesá. Naproti tomu při intraperitoneální aplikaci dosahuje aktivita CO2 maxima až ve druhém intervalu (5-10. minut) a pak až klesá podob- ně jako po podání intravenózním. Časový rozdíl a posun křivek CO2 při i.p. aplikaci vyjadřuje z- poždění způsobené přesunem značeného acetátu z peritonea a dosažení homogenní distribuce v extracelulární tekutině. Aplikace intravenózní je u malých laboratorních zvířat tech- nicky poměrně náročným úkolem. Je ale zároveň nejvýhodněj- ším způsobem, protože zaručuje nejpřesněji definované pod- mínky pro označení metabolitu v přesně vymezeném prostoru. Podáme-li zvířeti značenou sloučeninu jednorázově, máme bě- hem několika vteřin zajištěnou homogenní distribuci v krevním řečišti a můžeme tedy považovat v čase nula podanou aktivitu skutečně za stoprocentně obsaženou v krevním řečišti. Jiným příkladem jednorázové intravenózní (i.v.) aplikace je označení plasmatických volných mastných kyselin palmitátem- C14, kdy pokles aktivity značeného palmitátu v čase je možné analyzovat multikompartmentální analýzou. O tomto případu budeme ještě podrobněji hovořit. Intravenózní aplikace značené sloučeniny může být také kon- tinuální a zvýšením konstatní rychlosti infuze lze docílit rovnová- hy mezi odsunem a přísunem značeného metabolitu do krevního řečiště. III.2.2 Značení syntézy acetátem Jako příklad experimentu s jednorázovým intraperitoneálním po- dáním acetátu značeného RA izotopem 14C lze uvést měření rychlos- ti syntézy řetězce mastné kyseliny s použitím acetátu-1-C14. Acetát, který se z peritonea dostane do krevního řečiště, se ve velmi krát- krátké době rovnoměrně distribuuje v extracelulární tekutině. Od- tud pak vstupuje do buněk všech orgánů, kde dochází k syntéze mas- tných kyselin. V pokuse in vivo jsme nejdříve chtěli zjistit, po jak dlouhou dobu je acetát-C 14 k dispozici ke značení všech metabolických cest. Sledovali jsme dynamiku vydýchaného C 14O2 v krátkých časo- vých intervalech po jednorázové aplikaci stopového množství acetátu-1-C14. Jak je vidět z obrázku č. 66, poklesá aktivita expirovaného CO2 exponenciálně s časem a to ve dvou fázích. Obě fáze jsou v semilo- garitmickém vyjádření lineární, průsečík obou přímek je asi ve 40. minutě, přičemž poměr rychlostních konstant je 4:1. Tomuto obrazu odpovídá aktivita acetátu v celkovém plasmatic- kém volumu, kterou jsme zjišťovali jako aktivitu všech ve vodě rozpustných metabolitů. Aktivita acetátu v séru klesá rovněž expo- nencielně až do 3O.-4O. minuty. V této době se mění rychlost mize- ní aktivity z krevního řečiště. Z obou výsledků lze uzavřít, že podaný značený prekursor je k dispozici pro značení poolu acetyl CoA do 3O.-4O. minuty po i.p. aplikaci. V dalším čase se pool (hotovost) dvouuhlíkatých fragmentů pro značení acetyl CoA mění pouze nepatrně a je do- plňován katabolismem dříve označených metabolitů. V souhlase s touto představou vymizení podaného acetátu z ex- tracelulární tekutiny je průběh aktivity celkových mastných kyse- lin jater. Tento orgán je kvantitativně nejdůležitější pro de novo syn- tézu mastných kyselin (viz obr. č. 67). Aktivita dosahuje svého maxima ve 30. minutě po aplikaci; po- daný značený acetát je tedy k dispozici 30-40 minut po i.p. podání ke značení syntézy mastných kyselin. Pro měření rychlosti jejich syntézy s použitím značeného acetátu in vivo je třeba užívat zví- řata cca v tomto intervalu. Pokud není tato podmínka dodržena, jsou výsledky měření syntézy mastných kyselin ovlivněny jednak katabolismem značených mastných kyselin, jednak přesunem značených mastných kyselin mezi orgány. Přesun značených mastných kyselin z jater do tukové tkáně je patrný z obr. č. 68. Značené mastné kyseliny vzniklé v játrech jsou ve formě lipoproteinů odsouvány do depotní tukové tkáně. Kvantitativně odpovídá pokles aktivity jaterních lipidů mezi 30. - 120. minutou zhruba přírůstku v tukové tkáni. Rovněž skutečnost, že aktivita plasmatických lipidů je nejvyšší ve 30. minutě, odpoví- dá naší představě o redistribuci mastných kyselin krevním řečiš- těm v tomto čase. III.2.3 Utilizace glukózy 14C Glukóza, jejíž molekulová váha je podstatně vyšší než moleku- lová váha acetátu, a která má mnohem komplikovanější trans- port z extracelulárního do intracelulárního prostoru, nemůže být podávána intraperitoneálně. Nejvhodnějším způsobem aplikace je její perorální podání sondou do žaludku. Při sledování osudu takto podané glukózy je nejlepší informací sledování dynamiky vydýchaného CO2. Jeho aktivita se prudce zvyšuje v krátkém čase po podání sondou a pak dosahuje maxi- ma mezi 60. a 120. minutou po aplikaci, pak klesá až do 4. hodiny (viz obr. č.69). V dalším čase je pokles podstatně pomalejší. Značená glukóza, která je po podání transportována složitou cestou až k místu oxi- dace (event. stopování anabolických cest), je dostupná v intervalu 0-4 hodiny. V tomto intervalu je také oxidováno 8O% z celkově oxi- dované glukózy z 8 hodinového intervalu. Po intervalu 4. hodiny je expirován značený CO2 vzniklý především oxidací dříve označe- ných metabolitů a značení CO2 je podstatně nižší než v předešlém intervalu do 4. hodiny. Pro měření poměru mezi oxidací glukózy a její utilizace jako netukového prekursoru pro syntézu mastných kyselin jsme zvo- lili právě tento interval a zabíjeli proto zvířata 4 hodiny po aplikaci glukózy-C 14. Měřili jsme jednak aktivitu expirovaného CO2, jed- nak aktivitu mastných kyselin v celkovém karkasu, v játrech a epi- didymální tukové tkáni. III.3 Experimenty in vitro Při pokusech in vitro inkubujeme části tkáni v inkubačním me- diu, ve kterém je obsažena kromě inkubačního roztoku (např. Krebs-Ringer fosfátový pufr - KRF) radioaktivně značená látka. Značená látka je pochopitelně různá podle toho, jaké metabolic- ké pochody sledujeme; jde např. o glukózu 14 C, acetát-14 C, ne- bo mastné kyseliny značené 14C a pod. U některých tkání můžeme použít přímo její extirpovaný kousek, dostatečně tenký (aby byl zaručen homogenní přísun živného me- dia do tkáně) a přitom natolik kompaktní, aby se v průběhu inku- bace neporušil. V jiných případech děláme pomocí žiletky v držáku tenké tkáňové řezy. První z uvedených způsobů můžeme např. po- užít u bránice, epididymální či perirenální tukové tkáně, řezy tkání děláme např. u jater. Příklady in vitro experimentů: - Ke sledování tvorby mastných kyselin a dalších lipidových frakcí se užívá acetát-1-14C, přidávaný do inkubačních baniček (viz obr. č. 70 v množství 2 uC na vzorek. Inkubační doba je 60sekund, in- kubace probíhá při 37oC a s O2 jako plynnou fází. Po skončené inkubaci jsou kousky tkáně z media vybrány, opláchnuty, osušeny na filtračním papíru, pak jsou homogenizo- vány. Z homogenátu jsou pak extrahovány lipidy metodou dle Folcha (1957) dvacetinásobkem chloroform - metanolu v poměru 2:1. Pak se k tomuto extraktu přidají 2 díly 2% KH2PO4 na 1O dílů extraktu. Alikvot chloroformové části extraktu je potom pomocí tenko- vrstevné chromatografie (TLC) na silikagelu rozdělen na fosfolipi- dy, mono-,di- a triglyceridy, cholesterol a volné mastné kyseliny. Tyto frakce byly pak metodou kapalné scintilace změřeny. -Oxidace acetátu-1-14C byla sledována při inkubaci tkáňových (na příklad jaterních řízků) v KRF, při 37oC, po dobu 60 minut. Vydýchaný CO2 byl vychytáván v 50% alkoholickém roztoku mo- noetylaminu. Aktivita byla měřena po rozpuštění alikvotu roztoku ve scintilační tekutině. - Esterifikace mastných kyselin je sledována s palmitát-1- 14C v jaterních řezech. Závěr: Je si třeba uvědomit, že in vitro sledování nemusí odrážet poměry v intaktním organismu, kde existuje regulace pomocí hor- monů i CNS. Spíše je testována možnost reakce organismu v da- ném pochodu než její skutečná velikost. III.4 Metabolické problémy a způsob jejich řešení Použitím značených sloučenin se řada biologických disciplin posunula na zcela jinou kvalitativní úroveň. Zejména v posledních cca 30 letech má jak kvalita tak kvantita získaných experimentál- ních dat vzestupnou tendenci. To je způsobeno jednak rozšířením palety komerčně vyráběných sloučenin, dále pak rutinním použi- tím dokonalých automatů pro scintilační detekci měkkého beta záření C 14 a H 3. Hlavním důvodem pak je objevení řady nových separačních me- tod. Použití značených metod skrývá však v sobě úskalí spočívající v tom, že aplikací RA značené sloučeniny, izolací sledovaného me- tabolitu a změřením jeho aktivity u jakéhokoliv vzorku lze získat poměrně jednoduše řadu experimentálních čísel. To vede k tomu, že kvantita výsledků ze stopovacích experimentů vzrůstá závrat- nou rychlostí, ne vždy jde ale o kvalitativně nové informace. III.4.1 Porovnání rychlosti stejné metabolické reakce u různých skupin zvířat a1 A B a2 Měřili jsme rychlost syntézy triglyceridů a fosfolipidů v játrech. Jak triglyceridy tak fosfolipidy vznikají esterifikací volných mast- ných kyselin transportovaných z krevního řečiště do hepatocytu. Po přechodu celulární a mitochondriální membránou a aktivaci mastných kyselin na acyl-CoA může být mastná kyselina utilizo- vána dvěma alternativními cestami a to jednak oxidací, jednak esterifikací - viz obr. č. 71. Je známo, že utilizace mastných kyselin beta oxidací je akcen- tována hladověním. Položili jsme si otázku, zda současně s oxida- cí mastných kyselin není změněna i jejich rychlost esterifikace. Syté a 48 hodin hladovějící krysí samice byly dekapitovány a z jejich jater byly připraveny tkáňové řezy. Řezy byly inkubovány 10 minut v Krebs-Ringerově fosfátovém pufru bez vápníku v kys- líkové atmosféře do ustavení rovnováhy. Pak byl postranním ra- ménkem inkubační baničky (Warburgovy) injikován značený pal- mitát-1-C 14 v komplexu s albuminem. Finální koncentrace vol- ných mastných kyselin pak byla 0,2 umol/ml a poměr mastné ky- seliny:albumin byl 7:1. Po 60 minutách inkubace byl metabolismus tkáňového řezu zastaven přidáním 1 ml 5N H2SO4 a do vloženého kalíšku s mo- noetanolaminem byl vychytáván expirovaný CO2. Po 40 minu- tách byla jaterní tkáň homogenizována a směsí chloroform-meta- nol 2:1 byly extrahovány celkové jaterní lipidy. Pro rozdělení na tenké vrstvě kyseliny křemičité (TLC) byla pa k stanovena aktivi- ta volných mastných kyselin, triglyceridů a fosfolipidů. Změřená aktivita v CO2 a ve všech lipidových frakcích (na 1 g) byla vydělena specifickou aktivitou palmitátu-1-C14 v me- diu a výsledné hodnoty jsou pak vyjádřeny v mumol mastné ky- seliny oxidované na CO2 resp. esterifikované na triglyceridy či fosfolipidy. Z obrázku č. 72 je vidět, že kromě potvrzené zvýšené oxida- ce mastných kyselin za hladovění ve srovnání s kontrolními sytými zvířaty, poklesla i rychlost syntézy triglyceridů po 48 ho- dinách hladovění a to o 40%. III.4.2. Porovnání rychlosti dvou metabolických cest Na křižovatce dvou metabolických cest lze pomocí značené sloučeniny sledovat poměr rychlosti mezi těmito dvěma cesta- mi (A----B resp. A----C). Případ je jednodušší, pokud známe alespoň přibližně velikost poolu A a pokud značená molekula při přeměně na finální meta- bolit B nebo C neprodělává několik ředění v poolech, jejichž veli- kost je značně variabilní a experimentálně nepřístupná měření. V takovém případě lze obě tyto reakční rychlosti vyjádřit v abso- lutních hodnotách a vypočítat jejich poměr. Jako příklad může sloužit sledování poměru oxidace a esteri- fikace mastných kyselin v játrech. Vzhledem k tomu, že známe velikost extracelulárního poolu volných mastných kyselin a jeho specifickou aktivitu, můžeme ji položit rovnou specifické aktivitě intracelulárního poolu palmityl-CoA. Předpokladem ovšem je, že transport mastných kyselin do int- racelulárního prostoru není limitující , a také, že aktivita palmityl CoA syntetázy není limitována. III.4.3 Sledování vztahu dvou metabolických rychlostí Při změně nutričního stavu organismu či při jiné změně ne- dochází k jedné ale k celé řadě metabolických změn současně. Vyvstává otázka, která z těchto změn je primární a které jsou z této prvotní změny odvozeny. Jako příklad lze uvést sledování vztahu esterifikace k oxida- ci mastných kyselin. Za hladovění dochází k vzrůstu koncent- race volných mastných kyselin, jejich zvýšenému vychytávání v játrech a ke zvýšené jejich oxidaci na CO2 a také ke zvýšení produkce ketolátek. Předpokládá se, že zvýšená tvorba ketolá- tek je regulována prostřednictvím zvýšené intracelulární kon- centrace acetyl CoA, citrátu nebo hormonálně. Alternativní cestou oxidace mastných kyselin v játrech je je- jich esterifikace na triglyceridy a fosfolipidy a za hladovění do- chází současně se zvýšením oxidace i ke snížení esterifikace mastných kyselin. V následujícím pokuse jsme se snažili zjistit, zda esterifika- ce nehraje regulační úlohu v oxidaci mastných kyselin a pro- dukci ketolátek. Předpokládali jsme, že by snížená rychlost es- terifikace za hladovění mohla umožnit zvýšenou dostupnost mastných kyselin pro oxidaci. Sledovali jsme proto časový rozvoj obou rychlostí po hlado- vění a následné realimentaci. Metodou inkubace jaterních ře- zů s palmitátem-l-C 14 jsme měřili rychlost esterifikace a sou- časně také rychlost produkce acetoctanu. Jak je patrné z obrázku č. 73, je produkce ketolátek po 12 hodinovém hladovění signifikantně zvýšena, ačkoliv nedochá- zí ještě ke zřetelné změně rychlosti syntézy TG resp. PL. Po 24 hodinách hladovění dochází k dalšímu zvýšení produkce keto- látek a současně ke změně rychlosti esterifikace. Po delším hla- dovění se již ani produkce ketolátek ani rychlost esterifikace ne- mění. Ke změně oxidace dochází tedy dříve než ke změně este- rifikace. Podobný obraz jsme viděli při porovnání obou metabolických rychlostí po realimentaci 24 hodin hladovějících zvířat sondou po- danou glukózou (4 g na 1 kg váhy). Již 30 minut po realimentaci dochází ke snížení produkce acetoctanu na hodnoty, které se blí- ží kontrolním zvířatům. Rychlost syntézy triglyceridů se ve 30. minutě po realimenta- ci ještě nemění a je signifikantně vyšší až 90 minut po realimen- taci. Ani tehdy se ještě nemění rychlost syntézy fosfolipidů. Z časového zpoždění změn esterifikace za oxidací lze tedy u- zavřít, že esterifikace nemůže hrát regulační úlohu v produkci ke- tolátek. III.4.4 Určení rychlosti limitujícího kroku Změna rychlosti syntézy (nebo štěpení) finálního produktu, jako výsledek podnětu působícího na organismus, zahrnuje v sobě řadu změn v rychlosti tvorby intermediárních metabolitů. Při změně rychlosti syntézy triglyceridů je možno očekávat změny rychlosti ve všech krocích, kterými molekula mastných kyselin projde: volné mastné kyseliny ------ acylCoA ------ kys. fosfatidová ---------- 1,2 diglycerid ------ triglycerid Je důležité zjistit, který krok je regulační, tedy rychlost limi- tující. K řešení této otázky jsme uspořádali pokus a to tak, že jsme měřili rychlost syntézy všech intermediárních a finálních metabolitů u skupin kontrolních a 18 hodin hladovějících pot- kanů. Tuto dobu hladovění jsme považovali na základě našich dřívějších výsledků za takový časový interval, kdy může dojít k prvním změnám rychlosti syntézy triglyceridů - viz obr. č. 74. Po 18 hodinách hladovění došlo u zvířat k minimálnímu sní- žení rychlosti syntézy triglyceridů. Tento pokles je statisticky nevýznamný. Rovněž pokles rychlosti syntézy 1,2 diglyceridů je statisticky nevýznamný. Porovnáme-li rychlost syntézy hlavních frakcí fosfolipidů, vidíme, že není významného rozdílu v rychlosti syntézy fosfati- dylcholinu (lecitinu - FCH - a fofatidylethanolaminu - FE), kte- ré jsou finálními produkty. Naproti tomu snížení rychlosti syntézy kyseliny fosfatidové (KF), která je prvním krokem syntézy triglyceridů, je vysoce sta- tisticky významné. Aktivita kroku aktivujícího mastnou kyselinu na acyl CoA nemůže být rychlost limitující, neboť aktivita acyl- CoA syntézy je naopak za hladovění akcentována. Rychlost limitujícím krokem esterifikace je tedy právě reakce regulovaná alfa-GP acyltransferázou (přenesení dvou řetězců mastných kyselin na molekulu alfa-GP), vedoucí ke vzniku kyse- liny fosfatidové. III.4.5 Nehomogenita metabolického poolu Zvyšování rozlišovací úrovně, která je důsledkem používání nových experimentálních přístupů, vede někdy k nutnosti zásad- ní změny názoru na studovaný metabolický systém. Interpretace nových experimentálních dat si často vynucuje předpoklad, že studovaný systém má mnohem složitější strukturu, než jaká byla dosud předpokládána. Vyskytuje se zejména situace, při které dochází k nálezům svědčícím pro skutečnost, že místo původně jednoho předpoklá- daného poolu existuje poolů několik, navzájem od sebe odděle- ných. Příkladem je pool zásobních triglyceridů v adipocytu (tukové buňce), který byl dříve považován za homogenní. Výsledky Vaug- hanové (1959) se ale ukázaly v naprostém nesouhlase s touto představou. Vaughanová inkubovala epididymální tukovou tkáň krys se značeným palmitátem a označila tak triglyceridy tukové buňky a pak měřila uvolňování mastných kyselin z takto označe- ných triglyceridů. Uvedená autorka zjistila, že specifická aktivita uvolněných mastných kyselin (aktivita uvolněných mastných kyselin dělená množstvím uvolněných mastných kyselin) je podstatně vyšší než průměrná specifická aktivita mastných kyselin v celé tukové tká- ni. Tento fakt lze vysvětlit pouze tak, že triglyceridy v tukové tkáni jsou ve dvou poolech, z nichž pool A komunikuje s extracelulár- ním prostorem, kdežto pool B prakticky pouze s poolem A - viz obr. č. 75. To, že s plasmou komunikuje pouze pool A, je jistě zjednoduše- ná představa; i pool B by mohl rovněž komunikovat s plasmou, ale rychlostí podstatně nižší než pool A. Palmitátem-C14 označíme triglyceridy v poolu A a měříme spe- cifickou aktivitu mastných kyselin uvolněných z tohoto poolu. Pool B se značí postupně přesunem značených mastných kyselin z A do B. Zavedeme-li nyní předpoklady, že: a) systém je v rovnovážném stavu b) rychlosti rBO, rAB a rBA jsou zanedbatelné vzhledem k rOA a rAO, pak můžeme předpokládat, že měříme specifickou aktivitu volných mastných kyselin uvolněných do media. Ta se rovná specifické ak- tivitě mastných kyselin v A, protože pool B se neoznačí významně a specifická aktivita v B bude proto téměř rovna 0. Pak rovnice: specif. akt. v celé tuk. tkáni (A+B) ----------------------------------------------------------------- specif. akt. uvolněných MK x 1OO% udává velikost poolu A z celkových triglyceridů tukové tkáně. Porovnali jsme tímto způsobem tukovou tkáň u zvířat mladých (2 měsíčních) a dospělých (8 měsíčních). Epididymální tukovou tkáň jsme inkubovali 30 minut se značeným palmitátem C14 a pak po dobu 60 minut jsme inkubovali tuto tukovou tkáň v 3% albumi- nu (měření uvolňování volných mastných kyselin) - viz obr. č. 76. Obě skupiny se liší v množství uvolněných mastných kyselin a také v jejich specifické aktivitě. Rovněž specifická aktivita tri- glyceridů v tukové tkáni po inkubaci palmitátem je u starších je- dinců nižší, protože rychlost esterifikace je snížena. Vypočteme-li nyní poměr specifické aktivity, zjistíme, že pool A (aktivnější, s rychlým obratem) činí 3,7% celkových triglyceridů u mladších zvířat, kdežto u starších zvířat je pouze 1,2%. Velikost aktivního poolu se tedy stářím snižuje. III.4.6 Distribuce značeného metabolitu Pokusy sledující distribuci jsou ve svém principu velmi jedno- duché. Konečným vyjádřením distribuce je procentuální část po- daného značeného metabolitu lokalizovaná ve stanoveném čase ve vymezeném prostoru (celém orgánu, v určitém druhu buněk nebo subcelulárních částic). Velmi často není ani nutné analyzo- vat, v jaké formě je značený atom podaného metabolitu ve studo- vaném prostoru. Takto stavěné experimenty jsou obyčejně prv- ním stupněm řešení otázek z oblasti výživy, farmakologie a pod. Jako příklad uvádíme vychytávání plasmatických volných ma- stných kyselin v ischemickém kosterním svalu. Ischemie pravé zadní končetiny krys bylo dosaženo přetětím pravé illické tepny bez přerušení žíly a inervace. Pokusným a kontrolním zvířatům byl i.v. injikován komplex albuminu s kyselinou palmitovou C 14 (3 uC) a Rb86 Cl (5 uC). V 90.-té sekundě po aplikaci, kdy je pře- vážná část mastných kyselin vychytána extravaskulárně, byla zvířata dekapitována. Aktivita v bércovém svalu byla vyjádřena v procentech z podané aktivity mastné kyseliny. Procento vy- chytaného rubidia ukazuje přitom změnu rychlosti průtoku - viz obr. č. 77. Jak je z něj patrno , je do ischemického krysího svalu inkor- porováno méně mastných kyselin. Protože jsme v témže expe- rimentu měřili změnu průtoku, mohli jsme distribuci mastné kyseliny porovnat se změnou průtoku. Je vidět, že jak distribu- ce C14, tak distribuce RA rubidia je v ischemickém svalu sní- žena asi o 60% v porovnání s kontrolní skupinou. Snížení in- korporace mastné kyseliny do ischemického svalu je tedy zřej- mě dáno sníženou rychlostí průtoku krve svalem. III.4.7 Měření přítoku (inflow) Změření distribuce metabolitu, které jsme probrali v před- chozí části, nemusí být vždy postačující pro řešení některých otázek přeměny ve tkáních. Distribuce jednorázově podané značené látky v organismu dává dostatečnou informaci při po- rovnání dvou skupin pouze v případě, že obrat tohoto metabo- litu je u obou skupin stejný. Jako příklad si můžeme uvést experiment zčásti již popsa- ný v minulých odstavcích. Zvířatům trenovaným zvýšenou fy- zickou zátěží, omezeným v pohybu a kontrolním byla opět po- dána 14 C-kyselina palmitová. Zvířata dekapitovaná v 5 a 10 minutě po aplikaci, kdy je již aktivita v krevním řečišti mini- mální (tzn. že podstatná část podaného značeného palmitátu je již distribuována do tkání), byla shrnuta do jedné skupiny. U této skupiny byla změřena aktivita v epididymální tukové tkáni a v musculus soleus - viz obr. č. 78. Distribuce palmitátu-C14 u všech sledovaných skupin je vy- jádřena jako procento z podané aktivity. Tento ukazatel podá- vá dobrou informaci při porovnání skupiny kontrolní a treno- vané, protože odtok se mezi oběma skupinami neliší. Tréno- vaná zvířata distribuují větší procento aktivity do svalu a mé- ně do depotního tuku. Naopak při porovnání skupiny kontrol- ní a omezené je toto procentuelní vyjádření zcela zkreslující. Obě skupiny se zásadně liší v hodnotě odtoku (outflow) plasmatických mastných kyselin. Chceme-li tyto skupiny zví- řat porovnat, musíme měřit přítok (inflow) mastných kyselin do svalu a epididymální tukové tkáně v absolutních hodno- tách. To znamená vyjádřit ho v umolech mastných kyselin transportovaných do celého svalu či epididymálního tukové- ho tělesa za časový interval. Tento výpočet je velmi jednoduchý.: I = D . R % ----------- 1OO I ......... inflow mastné kyseliny do orgánu D ......... je procento, které ze 1OO% podané aktivity bylo distribuováno do tohoto orgánu R ......... je hodnota odtokové míry (outflow rate). Je pochopitelné, že hodnota přítoku mastných kyselin do svalu nebo depotní tukové tkáně je závislá na rychlosti obratu plasma- tických volných mastných kyselin. Čím je rychlost obratu větší, tím více přitéká mastných kyselin do sledovaného orgánu, i když se procentuelní distribuce nemění - viz obr. č. 79. Na tomto obrázku jsou uvedeny hodnoty přítoku mastných kyse- lin u sledovaných skupin. Do svalu kontrolních a pohybově omeze- ných zvířat přitéká podobné množství mastných kyselin za 1 minutu. Toto množství je pravděpodobně nutné pro minimální krytí energe- tických výdajů z lipidů u sytého organismu. Naproti tomu zvířata tré- novaná zásobují kosterní sval větším množstvím mastných kyselin. Dlouhotrvající trénink na fyzické zatížení vede k adaptaci koster- ního svalu na vyšší produkci energie z mastných kyselin i ve stavu klidu. Naopak kontrolní zvířata distribuují větší množství mastných kyselin, které nebyly použity ve tkáních pro utilizaci, zpět do depot- ní tukové tkáně. III.4.8 Multikompartmentální model metabolismu mastných kyselin a lipoproteinů V této kapitole uvedeme příklad analýzy experimentálních dat s použitím počítače. Přístup analýzy experimentálních dat s užitím počítače umožňuje nejen zobecnit a interpretovat experimentální údaje, ale i vypočítat údaje přímému měření nepřístupné. V uplynu- lých létech se objevilo několik prací, které problém metabolických regulací lipidů studují s použitím značených mastných kyselin a multikompartmentální analýzou. Provedli jsme pokus, ve kterém jsme pro označení metabolické cesty použili kyselinu palmitovou-C14 v komplexu s albuminem i.v. aplikovanou do ocasní žíly neanestezovaných krys. Absolutní che- mické množství mastné kyseliny bylo velmi malé, prakticky šlo o stopové množství. V časových intervalech od 1O sekund do 4O minut jsme jednot- livá zvířata utráceli a stanovili u nich aktivitu volných mastných ky- selin a triglyceridů (ve frakci velmi nízko denzitních lipoproteinů - VLDL) v séru a dále aktivitu celkových lipidů jater. Aktivita všech frakcí byla měřena po extrakci lipidů a jejich rozdělení tenkovrstev- nou chromatografií (TCL) na beta měřiči s užitím kapalného scintilá- toru. Osud intravenózně podané značené mastné kyseliny bude patr- nější ze základního kompartmentového schematu- viz obr.č. 8O. Mastné kyseliny mizí z plasmy (kompartment 1) jednak do jater (kompartment 2 + 5), jednak do extrahepatálního prostoru (kom- partment 4 + 6), reprezentovaného především tukovou tkání. V ját- rech je část mastných kyselin uložena a další část uvolněna z jater ve formě plazmatických triglyceridů velmi nízké density (VLDL je kompartment 3). Ty jsou dále štěpeny a utilizovány. Literární údaje a naše předchozí zkušenosti s analýzou podob- ných systémů nás vedly k tomu, že jsme zavedli předpoklad rozdě- lení hepatálního i extrahepatálního prostoru na dva pooly, z nichž jeden je labilní a komunikuje s plazmou, kdežto druhý je stabilní a komunikuje pouze s labilním poolem. Dále jsme počítali s jistým do- pravním zpožděním vzniklým při syntéze triglyceridů v hepatocytu a navázání triglyceridů do komplexu lipoproteinů. Z vypočítaných hodnot rychlostních konstant je patrné, že k14 je větší než k12, takže mastné kyseliny jsou vychytávány více v ex- trahepatálních tkáních než v hepatálním prostoru. Zpětný tok ex- trahepatálního prostoru však vrací mastné kyseliny zpět do plazmy. my. Fyziologický význam těchto toků je asi takový, že značené mast- né kyseliny, které se dostanou na povrch celulárních membrán a- dipocytů, se zde míchají s neznačenými mastnými kyselinami uvol- ňovanými z tukové tkáně. Vracejí se pak do vaskulárního prostoru, aby mohly být vychytávány dále v játrech. Toky mezi labilním a stabilním poolem jsou v játrech i extrahepatálním prostoru vyzna- čeny jako jednosměrné, což pochopitelně ve fyziologických pod- mínkách organismu neplatí. Vzhledem ke krátké době sledování však specifická aktivita sta- bilního poolu nedosáhne takové hodnoty, aby bylo nutno se zpět- ným tokem kalkulovat, při dlouhodobějším experimentu by to bylo nutné. Shoda mezi experimentálními daty (jednotlivé body jsou hodno- ty y1, y2 a y3) a vypočtenými hodnotami aktivit v kompartmentu 1 = y1, 2 + 5 = y2 a 3 = y3 je patrné z horní části obrázku č. 81. Z průběhu křivky 3 je vidět i časové zpoždění Td. Vypočtený průběh aktivit dalších kompartmentů (experimentálně nepřístupných měře- ní) je na dolní části obrázku. Řešení multikompartmentálního modelu je jednoznačné a lineár- ní (typické pro experimenty s podáním značené látky ve stopovém chemickém množství). III.5. Příklady užití RA látek ke sledování metabolických problémů III.5.l. Hladina a tvorba cholesterolu resp. mastných kyselin ve vztahu k věku u krys Ateroskleroza se u lidí i některých živočišných druhů (např. pra- se) spontánně vyskytuje ve vyšším procentu s postupujícím věkem. Proto jsme chtěli vědět, jak se u krys různého stáří mění aterogen- ní látky, jak se liší hladina a tvorba mastných kyselin a cholestero- lu. Pokusy jsme prováděli na zvířatech přesně definovaného věku. Výsledky jednoznačně prokázaly, že zatím co hladina mastných kyselin stejně jako cholesterolu se ve tkáních resp. v séru s věkem zvyšuje, klesá naopak jejich tvorba ve tkáních. Stejné výsledky jsme dostali v pokusech in vivo jako in vitro - viz tab. č. 6. V literatuře je překvapivě málo prací, které by systematicky stu- dovaly tento problém, pouze ojediněle nacházíme porovnání hladin buďv séru či v jedné tkáni u mladých ve srovnání se starými jedin- ci. Z našich výsledků jasně vyplývá, že na kumulaci aterogenních lipidů s věkem ve tkáních, včetně aorty, se neprojevuje zvýšení je- jich tvorby ale naopak snížení jejich odbourávání. III.5.2 Hladina a tvorba cholesterolu resp. mastných kyselin ve vztahu ke změnám pohybové aktivity u krys Při zvýšeném ukládání lipidů ve tkáních s věkem se nesporně uplatňuje i pokles v pohybové aktivitě, ke kterému u starších jedin- ců dochází. Proto jsme podrobněji sledovali, jakým způsobem se snížená či naopak zvýšená pohybová aktivita odráží v lipidovém me- tabolismu. Důležitým stimulen pro náš výzkum byla skutečnost, že pro člověka naší doby se omezení pohybové aktivity v pracovní i mimopracovní činnosti projevuje čím dále tím výrazněji. V řadě dřívějších prací jsme ukázali, že se s hyperaktivitou snižu- je množství celkových lipidů v těle a to při zvýšené jejich tvorbě. Da- leko méně jasná je však situace, pokud jde o hladiny cholesterolu v séru a tkáních. Např. u cholesterolemie dosáhli různí autoři na- prosto odlišných výsledků, což je dáno především velkými metodic- kými rozdíly (stáří pokusných modelů, velikost a délka změny pohy- bové aktivity) - přehled viz Pařízková (1977). V našich pokusech, na krysách definovaného stáří (těsně po od- stavu), při užití střední intenzity nucené fyzické aktivity (18 m/min. po dobu 3 hodin denně) jsme nalezli jasně vyjádřené snížení choleste- rolemie i kumulace cholesterolu ve tkáních po 60 i 120 dnech adap- tace - viz obr. č. 82 - horní část. U zvířat hypokinetických byl obraz zrcadlový - hodnoty byly zvýšené proti kontrolním zvířatům. Situace pokud jde o tvorbu cholesterolu - viz obr. č. 82, dolní část, je naopak taková, že při dlouhodobě zvýšeném pohybu je nej- vyšší tvorba, při dlouhodobém omezení pohybu pak nižší. Zcela stejně je tomu i pokud jde o tvorbu mastných kyselin. III.5.3 Hladina a tvorba lipidových frakcí při změnách spon- tánní aktivity u krys V dalších pokusech jsme prokázali, že kvalitativně stejné změny jako nucená fyzická aktivita v metabolismu mastných kyselin vyvo- lává i dlouhodobá změna ve fyzické aktivitě spontánní, způsobená nutričním zásahem v ranné ontogenezi. Zvýšením počtu mláďat ve hnízdě na 12 oproti kontrolním 6 mláďatům byly vyvolány následné změny ve spontánní fyzické aktivitě. Mláďata z těchto velkých vrhů se vyznačovala sníženými hodnotami pokud jde o mastné kyseliny v karkase, zatímco tvorba mastných kyselin je výrazně zvýšena - viz obr.č. 83. Naproti tomu pokud jde o cholesterol, nevyvolávají změny ve spon- tánní aktivitě žádnou či velmi malou odezvu v metabolismu choleste- rolu. V každém případě však naše nálezy přispívají k hypotéze, před- pokládané i Kannelem a Dawlerem (1972), že ranné vlivy se mohou odrazit ve změnách lipidového metabolismu a mohou tak přispět i k vývinu ateromatózních změn. III.5.4. Vliv cvičení matek a vlastního cvičení na lipidovou přeměnu jejich potomků Některé údaje (Szabo a sp. 1975, Dancis 1975) svědčí o tom, že metabolické změny, ke kterým pod vlivem různých podnětů dochá- zí v organismu gravidních matek, se mohou odrážet i u jejich potom- ků. Sami jsme již ve svých dřívějších pokusech prokázali, že pokud jde o mikrostrukturu srdce potomků, má pozitivní vliv zvýšená fyzic- ká aktivita gravidních matek. Proto jsme se pokusili prokázat i případný vliv na lipidovou pře- měnu potomků, a to jednak bez ovlivnění jejich vlastní zvýšenou či sníženou fyzickou aktivitou, jednak s ovlivněním (toto vlastní ovliv- nění fyzické aktivity probíhalo od odstavu mláďat, tj. od 35dnů vě- ku). Jak v případě gravidních matek, tak i jejich potomků, byla apli- kována nižší úroveň běhání na koberečku (15 m/min. v trvání 1 ho- diny denně). Ve věku 90 dnů se vyznačují potomci hyperkinetických matek zvýšenými hodnotami celkových lipidů a mastných kyselin (u samičích potomků) a cholesterolu v játrech (u obou pohlaví). Úroveň lipogeneze v játrech je přitom u samičích potomků snížena, změny u samčích potomků jsou malé - viz obr.č. 84. Při vlastní zvýšené fyzické aktivitě pozorujeme rovněž změny u potomků matek vystavených fyzické aktivitě a to odlišné od po- tomků necvičících matek - výrazné jsou tyto změny zejména u sa- mičích potomků. Po 60 dnech vlivu hyperaktivity reagovali samičí potomci aktivních matek odlišně od potomků matek kontrolních (viz obr.č. 85), jak pokud jde o hladiny tak i o tvorbu lipidových frakcí. Výklad těchto změn, které probíhají poněkud odlišně než v dříve uvedených pokusech (možná i v důsledku poněkud změně- né intenzity pohybové zátěže), je dosti obtížný. V každém případě však výsledky dávají podnět k dalšímu studiu vlivu pohybové aktivi- ty na následující generace. III.5.5 Hladiny lipidů v séru a tkáních a jejich syntéza u miniprasat v průběhu experimentální aterosklerózy vyvolané cholesterolovým žírem U miniprasátek po 2 resp.10 měsících přívodu vysokotukové die- ty s 2% cholesterolu byly sledovány změny hladiny cholesterolu, tri- glyceridů a volných mastných kyselin - viz obr. č.86. Zatímco hladi- na triglyceridů se v průběhu uvedených časových intervalů praktic- ky neměnila, cholesterolemie se zvýšila již po prvních 3 dnech a ma- xima zvýšení dosáhla cca po 2 měsících uvedeného žíru. Je zajímavé, že hladina volných mastných kyselin stoupala u obou skupin zřejmě v důsledku zvýšeného obsahu lipidů v dietě. Hladina cholesterolu přitom stoupala u skupiny s vysokým přívodem choles- terolu jak v játrech, tak ve svalu i aortě. U zvířat s vysokým přívodem tuků a cholesterolu v dietě je možné pozorovat snížení endogenní syntézy cholesterolu v játrech i intimě aorty, což svědčí o zpětné kon- role syntézy cholesterolu ve tkáních - viz následující obr. č. 86. Naproti tomu endogenní syntéza mastných kyselin v intimomedi- ální části aorty je jak u zvířat po 1 tak po 10 měsících zvýšena. Je a- le zajímavé, že v případě syntézy cholesterolu i mastných kyselin jsou hodnoty tvorby po 10 měsících nižší u kontrolních i pokusných zvířat, ve srovnání s 2 měsíčními prasaty. To nasvědčuje tomu, že úroveň obou pochodů se s věkem snižuje (jak jsme již v jiných po- kusech na jiném zvířecím modelu - kryse - zjistili). III.5.6 Transport cholesterolu plasmatických lipoproteinů do aorty miniprasat v průběhu experimentální aterosklerózy Úroveň hladiny cholesterolu v aortě a stupeň jejího aterosklero- tického poškození je ve vztahu ke hladině cholesterolu v plasmě. Permeabilita endotheliální vrstvy intimy je změněna velmi brzy po dietním navození hypercholesterolémie. Proto jsme měřili velikost kost in vitro transportu cholesterolu lipoproteinů z plasmy do hrud- ní aorty a to pomocí homologně biologicky značených 3 H lipopro- teinů. Velikost transportu byla vypočtena ze specifické aktivity cho- lesterolu v inkubovaném mediu a z aktivity v inkubovaném vzorku aorty. Ukázalo se, že již po 2 měsících pokusu se zvyšuje velikost transportu hypercholesterolemických zvířat cca o 5O% - viz obr. č. 87. Tento rozdíl setrvává i po 1O měsících pokusu, i když absolut- ní hodnota transportu poklesá u obou skupin. Důvodem tohoto je- vu je zřejmě opět již dříve zmíněný pokles obecné metabolické ú- rovně u starších jedinců. III.5.7 Závěry o výsledcích pokusů zaměřených na problematiku patogeneze aterosklerózy Změny lipidového metabolismu, především cholesterolu, jsou uváděny ve vztahu k vzniku a průběhu aterosklerotických procesů v organismu. Je přirozené, že faktory, které vedou k zvýšenému u- kládání tzv. rizikových lipidů v organismu (zejm. LDL cholesterol), se mohou v tomto ději uplatnit. V první řadě mezi tyto faktory patří vyšší věk, který obecně vede k poklesu celkové úrovně přeměny látkové, jak o tom svědčí i na- še výsledky, pokud jde o velikost lipogenetických a cholesterologe- netických pochodů ve tkáních u krys. Nejde přitom pouze o rozdíl mezi mláďaty a dospělými zvířaty, jak je někdy uváděno (Lockwo- od a sp. 197O), ale o patrný postupný pokles se stoupajícím věkem, který se uplatňuje jak v pokusech in vivo tak ve sledováních in vitro. Kumulace lipidů ve tkáních, která se v průběhu ontogeneze proje- vuje, musí být tedy dána relativně vyšším poklesem odbourávání li- pidů s věkem proti jejich syntéze. Důvodů poklesu úrovně přeměny látkové s věkem je celá řada, mezi jiným se však nesporně uplatňu- je i pokles fyzické aktivity u starších jedinců. Svědčí o tom skuteč- nost, že stejné výsledky - nižší tvorba a vyšší kumulace lipidů včet- ně cholesterolu - jsme nalezli u zvířat adaptovaných na omezení po- hybu. Naopak zvířata hyperaktivní se vyznačují podobnými paramet- ry jako zvířata biologicky mladší. V našich pokusech došlo u těchto zvířat k výraznému snížení cho- lesterolemie, ve shodě s některými epidemiologickými a klinickými nálezy (přehled viz Pařízková 1977). Užili jsme střední intensitu fyzic- ké aktivity, po 60-ti a více dnech byly zjištěny nižší hodnoty krevních i tkáňových lipidů, zejm. cholesterolu. Zdaleka tak jednoznačně nedopadly naše pokusy s vlivem zvýšení spontánní aktivity, zřejmě proto, že rozdíly v počtu mláďat a tím i v dalších parametrech, nebyly tak velké, aby se projevily výrazněji. A- však podobně jako v případech, kdy jsme sledovali vliv vlastního zvýšení fyzické aktivity na potomky kontrolních a hyperaktivních ma- tek (kdy byl užit slabší podnět - 15 m/min. po dobu 1 hodiny denně), byly výsledky poněkud překvapivé. Tyto pokusy přispěly k představě, že obdobně jako jiné vlivy (K- nittle a Hirsch 1968, Johnson a sp. 1973, etc.), i vliv fyzické aktivity působící na matku se uplatňuje v ovlivnění organismu potomků. Vý- sledky jsou velice zajímavé, ale jejich interpretace je značně obtíž- ná. Detailnější studium této otázky by si vyžádalo spolupráce gene- tiků a sledování i dalších generací pokusných zvířat, než bezprost- ředně následující. Pouze tak by se jednoznačně prokázalo, že po- hyb může působit příznivě nejen na strukturu srdečního svalu (Pa- řízková a Petrásek 1976) ale i pokud jde o vznik či průběh ateroskle- rotických procesů. Krysy, které jsme užívali ke studiu vlivu různých aterogenních činitelů na lipidový metabolismus, se vyznačují poměrně značnou rezistencí pokud jde o vznik aterosklerózy. Naproti tomu prase ­ po- dobně jako člověk - patří mezi několik živočišných druhů, u kterých se ateroskleróza vyskytuje i spontánně s postupujícím věkem. U to- hoto druhu je rovněž možné vyvolat experimentální aterosklerózu v podstatě fyziologickým zásahem - nutričním přívodem vysokého po- dílu saturovaných tuků a cholesterolu (Florentin a sp.1968). Průběh morfologických změn u tohoto druhu je velice obdobný poměrům u počínajícího a rozvíjejícího se onemocnění u člověka. Ateroskleróza postihuje u obou druhů především aortu, koronární a intrakraniální arterie (Jones a Lugühl, 1965, Lumb a Hardy 1968). Tuto schopnost nutričního vyvolání aterosklerózy jsme si proto o- věřili na čs. nukleolu tzv. miniprasete, které je z důvodů ekonomic- kých i pokud jde o manipulaci výhodnější, než větší odrůdy. Zjistili jsme, že i u této odrůdy již při přívodu 2% cholesterolu po 10 měsících působení ve spojení se zvýšeným přívodem lipidů lze vyvolat hypercholesterolémii. Stejně tak i následné změny až k mor- fologickému obrazu počátečních stádií tvorby ateromatózních plá- tů (markantní ztluštění intimy s častým výskytem makrofágů obsa- hujících velké množství lipidů). Již po krátké době několika měsíců stoupá významně obsah cho- lesterolu v intimě hrudní aorty, po cca 10 měsíčním pokusném krme- ní stoupá tento rozdíl až na dvojnásobek úrovně u kontrolní skupiny. Za zajímavý považujeme nález zvýšení koncentrace plasmatických mastných kyselin, který dosud u prasete za obdobných pokusných podmínek nebyl popsán a který zřejmě přispívá ke vzniku pozorova- ných změn v cévách. Ve shodě s předchozími nálezy (Constantinides 1965) jsme pro- kázali zpětnovazebnou regulaci tvorby cholesterolu v játrech. Na- proti tomu nebyla dosud v literatuře popsána feed - back kontrola syntézy cholesterolu v intimě aorty, jak jsme ji v našich pokusech zjistili. Tím je i potvrzena důležitost endogenní syntézy cholestero- lu v cévě, jak bylo prokázáno již v prvních pracech Spitzera a sp. (1951); řada autorů však relativně nízké hodnoty tvorby choleste- rolu v cévě považovala spíše za artefakt (např. Hashimoto a sp. 1974) a změnám cholesterologeneze proto nepřikládala význam. Již před více než 50 lety bylo prokázáno, že stěna aorty je scho- pna syntetizovat mastné kyseliny (Chernick a sp. 1949). Somer a sp. (1974) prokázali u prasečí aorty, že k vyšší syntéze mastných kyselin dochází v oblastech sensitivnějších na ateromatózní změ- ny. V souhlase s tím jsou i naše nálezy, že u hypercholesterolemic- kých prasat je asi 5x zvýšena úroveň lipogeneze právě v aortální stěně. Některé nálezy z posledních cca 25-30 let (např. Florentin a sp. 1969, Adams a sp. 1970, Day a Proudlock 1974 atd.) prokazují, že permeabilita endotheliální vrstvy intimy, hrající v transportu plas- matického cholesterolu důležitou roli, je změněna záhy po vývinu hypercholesterolémie. S pomocí homologních biologicky značených lipoproteinů jsme zjistili, že podobně jako bylo zjištěno u králíka (Constantinides a Wiggers 1974), i u prasete dochází ke zvýšení transportu choleste- rolu z lumen cévy do cévní stěny. V dříve uvedené práci se tento výsledek připisoval zvýšenému gradientu cholesterolu u hypercho- lesterolemických zvířat. Použili jsme proto ke měření transportu cholesterolu in vitro shodného normo - cholesterolemického séra u obou porovnávaných skupin. Zjistili jsme přitom, a to již po 2 mě- sících, zřetelný vzrůst transportu cholesterolu u pokusných mini- prasat i za těchto podmínek. Celkově je možno říci, že naše výsledky přispěly k podpoře před- stavy o důležité roli změn lipidové přeměny při vývoji aterosklerotic- kých změn a přinesly některé výklady mechanismů, jakými se tyto změny v patogenetickém řetězci uplatňují. III.6 Užití RA izotopů při určení složení těla (poměr tukové a netukové složky) Zejména při sledováních vlivu různých výživových podně- tů, ale i vlivů dalších (intenzita cvičení, teplota a p.) je důleži- té znát, jakou odpověď tyto změny vyvolaly v organismu. Ze- jména jde o změnu poměru svalové a tukové složky těla, ne- boť případný úbytek svalové složky a naopak přírůstek cel- kových tuků v těle signalizuje nepříznivou odezvu. Především to platí u pacientů, u nichž poměr hmotnosti a jejich výšky ukazuje na nutnost přebytečný tuk redukovat. U- kazatelem jsou i tzv.kožní řasy, jejichž tlouštka vypovídá o množství tuku podkožního, který je v konstantním poměru s celkovým množstvím tuku v těle. S rozvojem izotopových technik se postupně objevovaly metody, které ke zjištění poměru tukové a netukové složky u- žily některé RA izotopy. V zásadě byl možný dvojí přístup: - buďpomocí RA izotopů stanovit kvantitu tukové složky a ne- tukovou složku vypočíst po odečtení tuků od celkové hmot- nosti těla - nebo stanovit naopak složku netukovou a podíl připadající na tuky zjistit po odečtení netukové složky od celkové hmotnosti těla Obě tyto metodiky vznikly na přelomu 60-70 let; zdá se, že postupně převládla spíše metoda zjišťování složky netukové. III.6.1 Zjišťování množství tuků v těle pomocí 85 Kr Tato metoda (viz např. Hytten a sp., 1966) využívá dilučního principu a zjišťuje absorbci RA značkovače v tukové tkáni. Ja- ko značkovač se užívá plynný 85 Kr, který cirkuluje v uzavře- ném okruhu (viz obr. č.l03 ). Vyšetřovaný objekt dýchá pomo- cí masky plynnou směs s 85 Kr (aktivita cca 5 uCi). Ze změny a- ktivity 85 Kr za 90-120 minut se vypočte tzv. kryptonový pros- tor. Je známo, že krypton se distribuuje v různých částech těla různě, podle své absorbce v nich. Nejvíce je rozpustný v lipi- dech, podstatně méně ve vodě a nejméně v proteinech. Pak je možné vypočíst množství celkových lipidů v těle a to za spl- nění předpokladu, že současně je stanoveno množství tělesné vody (deuteriovou či triciovou vodou), plynný objem plic (heli- em). Takto zjištěné množství tuku v těle dává srovnatelné výs- ledky s jinými způsoby určení tukového podílu na hmotnosti. III.6.2 Zjišťování podílu netukové složky těla pomocí 4O K Draslík je nejdůležitější intracelulární kationt u všech živých organismů. V extracelulární tekutině je pouze zanedbatelné množství draslíku, v kostech a jiných obdobných tkáních není draslík vůbec obsažen, stejně tak v tukové tkáni. Proto je mož- né použít stanovení jeho množství pro určení kvantity metabo- licky aktivní části těla. Metodika využívá skutečnosti, že všechen draslík v přírodě je přirozeně radioaktivní, protože obsahuje 0,012% 4O K, který má velice dlouhý poločas a to 1,25 x 109 let. Ke zjištění celko- vého množství draslíku v těle pak stačí zaznamenat rozpad 40 K na vhodném přístroji. Novak (1972) popisuje metodiku s užitím celotělového počí- tače s 10 detektory - 6 pohyblivých je umístěno nahoře a 4 sta- bilní jsou umístěny dole, tj. pod vyšetřovaným objektem (viz obr. č. 104). Aktivita 40 K byla měřena dvakrát 5 minut. Ze zjištěného množ- ství celkového tělesného draslíku se pak určí množství netukové složky těla podle vzorce Forbese a Hursha (1963), kteří chemic- kou analýzou určili konstantní množství draslíku v 1 kg netukové hmoty na 68,1 mEkv draslíku (toto množství je platné pro člověka i různé živočišné druhy). III.6.3 Alternativní metody pro zjišťování složení těla Izotopové metody mají, pokud jde o zjišťování podílu tukové a netukové složky velkou konkurenci v jiných metodikách, které je možné shrnout do několika základních typů: a) Stanovení denzity těla - Tato metoda, využívající Archimedova zákona, vychází z metody Behnkeho a sp. (1942). Při tomto způso- bu, nazývaném také vážení pod vodou, se denzita těla (D) vypočí- tává podle vzorce Keyse a Brožka (1953) takto: HS x Dv D = -------------------------- Hs - Hv - RPO Hs : hmotnost na vzduchu , Hv : hmotnost ve vodě, Dv : denzita vody (za standardních podmínek je rovna prakticky 1,0), RPO: reziduální plicní objem (zjišťuje se po propláchnutí plic 60 litry kyslíku na ana- lyzátoru plynů) Procento tuku v těle (% T) se vypočte podle Brožka a sp. (1955) - Keyse a Brožka (1953) takto: a) % T = 100 . 4570 - 4l42 D b) % T = 100 . 4201 - 38l3 D Zařízení pro vážení pod vodou viz obr.č.105. Tato metoda je prav- děpodobně z užívaných metod nejpřesnější - její nevýhodou je jed- nak delší doba potřebná pro stanovení denzity, jednak nutné prosto- rové a přístrojové vybavení (v ČR v současné době proto jsou pou- ze asi 3 zařízení pro vážení pod vodou). b) Stanovení celkového množství tuku v těle zjišťováním pod- kožního tuku kaliperem Při této metodě se vychází ze zjištění, že podkožní tuk tvoří kon- stantní část celkového tuku v těle. Proto se měří tlouštka kožních řas na různých místech těla, při tom se u různých autorů liší počet (a také lokalizace) těchto měřených míst. Ve většině studií se však užívá měření alespoń na 4-5 místech a to na tricepsu, na zádech pod lopatkou, vpředu hrudníku u podpaž- ní jamky, na břiše a případně na stehně. Jak uvádí Pařízková (1977), pro podrobnější studie je doporučeno měření na 10 místech dle Al- lena a sp. (1956)- viz obr. 106. Měření pomocí kaliperu je na první pohled nejvhodnější pro terén- ní studie, protože měřící zařízení - kaliper - je možné přenést do ja- kýchkoliv - třeba polních - podmínek. Obtíže vznikají především z toho, že různí autoři používají různé typy kaliperů (viz obr. č.l07 a obr. č.l08), lišících se silou stisku. Výs- ledky měření jsou také do značné míry ovlivněny tlouštkou a kvali- litou kůže. Konečně, jako u každé obdobné metodiky, záleží na zku- šenosti a praxi pracovníka, který s kaliperem měření provádí. V některých pracech se proto hodnotí tukové vrstvy ultrazvuko- vým zařízením, rentgenogrammetricky, nebo na základě elektrické vodivosti; tyto metody jsou však užívány spíše ojediněle. IV. ZÁVĚR Oblast sledování fyziologie látkové přeměny a jejích regulací je nemyslitelná v současné době bez využití radioaktivních izotopů. Jejich přínos je nesporný - umožňují sledovat nejen jednotlivé stup- ně této přeměny, ale stopovat celý řetěz reakcí a to v jejich dynami- ce. Radioizotopy resp.sloučeniny, které je obsahují, dávají i možnost zjišťovat koncentrace nejrůznějších biologicky účinných látek, ať již metabolitů, hormonů či vitaminů a to s daleko větší přesností a citli- vostí, než klasické metody vážkové či fotometrické (ve srovnání s o- bdobně citlivými přístupy, jako je HPLC, přitom ve větších seriích i rychleji a levněji). Metody využívající RA izotopy se kombinují i s jinými přístupy, na- př. imunochemickými, což jejich citlivost dále zvyšuje. Proto by bylo velkou chybou, aby ti, kteří se fyziologií v celé šíři a přeměnou látko- vou zvláště zabývají, neznali možnost využití radioizotopových me- tod pro své výzkumy. Skripta si nekladou tak vysoký cíl, jako by si kladla monografie pro tuto oblast (mimochodem řečeno, de facto nejen u nás, ale i ve světo- vé literatuře podobná komplexní monografie stále chybí!). Jejich cílem je pouze informovat o hlavních principech RA metodik a podrobně pak ukázat možnosti využití při výzkumu přeměny látkové u živočichů i u člověka. V jednotlivých kapitolách a podkapitolách skript jsou uvedeny publi- kace, ve kterých je možné nalézt podrobnější údaje o jednotlivých čás- tech probírané problematiky. Pokud nejsou u obrázků či tabulek uvedeny žádné prameny, byly u- dělány pouze pro potřeby této knihy (jinak i u našich vlastních nálezů u- vádíme publikace, ze kterých pocházejí). Pokusili jsme se vždy uvádět takovou dokumentaci, aby dobře ilustrovala probíranou tématiku - ne vždy se to asi povedlo - to však musí posoudit uživatelé skript sami. Není správná představa, že užití RA izotopů je vzhledem k finanční náročnosti těchto metod vyhraženo jen pro úzký okruh pracovišť. Po- kud jde o vybavení laboratoře, ve které je možné provádět většinu in vitro stanovení, nevyžaduje žádné zvláštní podmínky; zcela stačí běž- ná fyziologická či biochemická laboratoř s digestoří. Jedinou dražší položkou je aparatura na měření aktivity (ať již beta či gama záření); její cena je však téměř srovnatelná s cenou chlazené centrifugy či podobných přístrojů. Často existuje také možnost využít měřičů v blízkém okolí, ať již na odděleních nukleární medicíny či kli- nické biochemie. Rovněž cena RA značených sloučenin či RIA kitů je prakticky srovnatelná (většinou je ale levnější!) s cenou chemikálií po- třebných pro chemická stanovení. Rovněž není třeba se obávat následků záření při užití metod s RA i- zotopy - i při in vivo pokusech jde o dávky, které jsou srovnatelné se zá- řením, které přijímáme při sledování televize v jednom pořadu. Při me- todách in vitro, zejména při RIA metodách, jsou dávky RA tak malé, že ani nejsou uváděny jako zářič. Jde tedy pouze o to, aby v případech, kde užití RA izotopů může dát nové informace, k užití tohoto metodického přístupu skutečně došlo. Jak jde rozvoj našich znalostí a tím i metodických možností stále do- předu, je však třeba někdy uvážit, zda kromě radioizotopových metod by nebylo možné či vhodné užít i jiného přístupu. Proto také v jednotlivých kapitolách, ať již jde o zobrazování orgánů, stanovení koncentrací, slože- ní těla a pod., uvádím v těchto případech i alternativní neizotopové meto- diky. I ty se postupně rozvíjejí, takže na př.spektroskopie magnetické re- zonance dává rovněž možnost posouzení metabolické aktivity transplan- tovaných štěpů. Ten, kde se s látkou obsaženou ve skriptech seznámí, by měl dostat základní informace o tom, jak by mu při studiu přeměny látkové - ať již u u živočichů či člověka - mohly pomoci metody s RA izotopy i metodiky alternativní. Pro podrobnęjší informace se pak může obrátit do literatury, ať již do té, která je přímo ve skriptech uvedena, či do aktuálního bohaté- ho písemnictví. Snad ale tato skripta napomohou, jako "první čítanka", k bližšímu se- známení s problematikou a přispějí tak nepřímo i k dalšímu rozvoji studia fyziologie přeměny látkové.