Vliv enzymatického natrávení krvinek BROMELINEM na citlivost serologického stanovení antigenů krevního systému ABO. Teoretický úvod: Antigeny krevního systému ABO jsou molekuly glykoproteinů vázané v membránách červených krvinek. krevní skupina antigen v membráně erytrocytů A A B B O H AB A i B Podstatou sérologického stanovení těchto antigenů je aglutinace – shlukování erytrocytů, kdy reaguje antigen v membráně erytrocytů s příslušnou protilátkou označovanou jako anti A, anti B nebo lektin v případě antigenu H. Výsledkem vzájemné reakce erytrocytárního antigenu a příslušné protilátky je aglutinace a reakci hodnotíme jako pozitivní, když shluk krvinek je pevný a nelze ho roztřepat. Bromelin hydrolyzuje peptidické vazby v membránách erytrocytů a tímto způsobem membránu „natráví“. Z fyzikálního hlediska se jedná o snížení povrchového napětí membrány. Důsledkem je zesílení některých interakcí antigen – protilátka, v našem případě by se účinkem bromelinu měla zvýšit intenzita aglutinace erytrocytů. Krvinky natrávené bromelinem by tedy měly být citlivější k působení příslušných protilátek, tj. aglutinace by se měla projevovat i při větším zředění protilátek, než tomu bude u krvinek neovlivněných bromelinem. Cíl práce: srovnat míru aglutinace erytrocytů ovlivněných bromelinem s aglutinací neovlivněných erytrocytů Postup, pomůcky: Pracujeme v rukavicích !!! Dbáme na pečlivé značení všech zkumavek – krevní skupinu i číslo zkumavky (ředění), pro potřeby inkubace je nutno zkumavky značit navíc také vlastní značkou své pracovní skupinky. 1. fyziologický roztok pro červené krvinky – 0,85% NaCl 2. 3% suspenze erytrocytů krevních skupin A, B, O ve fyziologickém roztoku – již připraveno 3. 3% suspenze erytrocytů hydrolyzovaných (natrávených) bromelinem – nutno připravit: - do malých eppendorfek s 20 μl 0,5% bromelinu přidáme 180 μl erytrocytární suspenze (z bodu 2). - zkumavky inkubujeme 10 – 15 minut při 37^OC. - centrifugujeme při 1000 ot., cca 30 sec, opatrně odsajeme supernatant, k sedimentu erytrocytů na dně eppendorfky přidáme 180 μl fyziologického roztoku, opět centrifugujeme a odsajeme, celkem 3 x, čímž ze suspenze erytrocytů důkladně vymyjeme bromelin. Po posledním promytí přidáme 180 μl fyz. roztoku a tímto máme připravenou 3% suspenzi natrávených erytrocytů. 4. připravíme si zkumavky s protilátkami, ve kterých budeme provádět aglutinaci. Protilátky anti A, anti B ředíme geometrickou řadou 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 Lektin ředíme 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 celkem připravíme 2 sady po 15 aglutinačních zkumavkách: anti A (5 zkumavek), anti B(5 zkumavek), lektin (5 zkumavek) pro krvinky bez bromelinu anti A (5 zkumavek), anti B(5 zkumavek), lektin (5 zkumavek) pro krvinky s bromelinem Zkumavky značíme vždy A 1 až A 5, B 1 – B 5, H 1 – H5. Zásobní roztoky pro anti A, anti B i lektin (anti H) jsou již připraveny, způsob ředění protilátek pro krvinky s bromelinem i bez bromelinu je stejný. Anti A 1 2 3 4 5 Ředění 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Pipetovat 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl zás. r. zás. r. r. 2 r. 3 r. 4 + + + + 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl fyz. r. fyz. r. fyz. r. fyz.r. Anti B 1 2 3 4 5 Ředění 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Pipetovat 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl zás. r. zás. r. r. 2 r. 3 r. 4 + + + + 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl fyz. r. fyz. r. fyz. r. fyz.r. Lektin 1 2 3 4 5 Ředění 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Pipetovat 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl zás. r. zás. r. r. 2 r. 3 r. 4 + + + + 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl fyz. r. fyz. r. fyz. r. fyz.r. Z 5. zkumavky vždy odebereme 200 μl, aby objem byl ve všech zkumavkách stejný a to 200 μl, 5. do takto naředěných protilátek přidáme vždy po 20 μl příslušné erytrocytární suspenze: do prvních tří řad bez bromelinu, do druhých tří řad s bromelinem Dáváme erytrocyty A do anti A, B do anti B, 0 do lektinu (anti H) 6. zkumavky inkubujeme 10 minut při 37°C, poté centrifugujeme půl minuty při 1000 ot. Po lehkém protřepání odečítáme aglutinaci. 7. do závěru vyhodnotíme citlivost reakce, (tj. uvedeme při kterém ředění byla reakce ještě pozitivní) a zhodnotíme vliv bromelinu na citlivost reakce.