Laboratoř imunologie hmyzu
Pavel Hyršl
Laboratoř imunologie hmyzu
Pavel Hyršl
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta
Masarykova Univerzita v Brně
http://www.sci.muni.cz/ksfz/imuno_hmyz.html
IMUNITNÍ SYSTÉM HMYZU
BUNĚČNÁ IMUNITA HUMORÁLNÍ IMUNITA
-pohyblivé krevní buňky ­ hemocyty
(počet a aktivita hemocytů je modulována
humorálními faktory a neuroendokrinním
systémem)
- molekuly v hemolymfě
- antigenem indukované antibakteriální a
regulační faktory
- koagulace
- fagocytóza (oxidativní vzplanutí?)
- nodulace
- enkapsulace
- aglutininy
- koagulační kaskáda
- fenoloxidásová kaskáda
- baktericidní peptidy
- antimikrobiální faktory (lektiny,
hemolin)
- lysozym
stresové faktory
Svobodová 1995
Hemocyty B. mori podle Yamashita & Iwabuchi, 2001.
- prohemocyty
- plasmatocyty
- granulocyty
- spherulocyty
- oenocyty
- fagocytóza
- enkapsulace
- nodulace
- koagulace
Hmyzí hemocyty:
Imunitní reakce hemocytů:
podle Turner 1994
Obr. 1 : Navržené schema působení indukovaných antibakteriálních proteinů a
peptidů na buněčnou stěnu bakterií (Hultmark 1993)
ˇ gely vznikají polymerací akrylamidu a N',N'-methylenbisakrylamidu
ˇ SDS (sodium dodecylsulfát) se váže shodně na všechny proteiny
v poměru 1,4 g / 1g proteinu a předává jim silný záporný náboj
ˇ mercaptoethanol - rozštěpí disulfidické můstky v molekulách proteinů
Elektroforéza SDS ­ PAGGE
(sodium dodecylsulfat polyacrylamide gradient gel electrophoresis)
ˇ vertikální elektroforéza SE 600 (Hoefer Scientific Instruments)
ˇ 5 % koncentrační gel a separační gel (14 x 10,5 cm) s gradientem
akrylamidu 7,5 ­ 20,0 %
ˇ dělení proteinů probíhalo ve dvou gelech, každý z nich pro 15 vzorků
ˇ standard (SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range,
Bio-Rad; 6,5 - 200 kDa)
ˇ gely byly barveny stříbrem podle Kirkeby et al. (1993)
- videodensitometr GS-670 a software Molecular Analyst (Bio-Rad)
Vyhodnocování gelů:
Profilová analýza:
ˇ kvalitativní:
MW jednotlivých proteinových frakcí hemolymfy
ˇ kvantitativní:
poměr zastoupení jednotlivých proteinových frakcí
mezi samci a samicemi během vývoje
ˇ rozdělené vzorky na polyakrylamidovém gelu
ˇ absorbční křivka (osa x ­ vzdálenost od startu, osa y ­ optická hustota)
ˇ tabulka s určenou molekulovou hmotností frakcí (MW) a plochou píku
Profilová analýza:
Proteinové spektrum hemolymfy
bource morušového (Bombyx mori )
Proteinové spektrum hemolymfy
bource morušového (Bombyx mori )
Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae)
bulharský monovoltinní hybrid AS x KK
Bombyx mori ­ samice
S ­ standard; 1. - 9. den V. instaru; PR ­ prepupa 1. den;
Z ­ kukla začátek; S ­ kukla střed; K ­ kukla konec.
Z S K
Proteinové spektrum hemolymfy
zavíječe voskového (Galleria mellonella )
Proteinové spektrum hemolymfy
zavíječe voskového (Galleria mellonella )
Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae)
Galleria mellonella - housenky VII. instaru
ˇ v hemolymfě starých kukel (tmavé oči) byl detekován male specific
protein (MSP), popsaný r. 1998 (Lee et al.)
Proteinové spektrum hemolymfy
mandelinky bramborové
(Leptinotarsa decemlineata)
Proteinové spektrum hemolymfy
mandelinky bramborové
(Leptinotarsa decemlineata)
Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera, Chrysomelidae)
- 36 samic a 35 samců jako potomstvo 18 různých samic
- odběr hemolymfy - 5 dní stará imaga
- celkem byla hemolymfa L.
decemlineata rozdělena na 25
proteinových frakcí v rozmezí 6,5 -
202 kDa
- lipophoriny
- zásobní proteiny
variabilita v populaci ­ každý vzorek je potomek jiné samice
Aktivita lysozymu v hemolymfěAktivita lysozymu v hemolymfě
y = 7,245x + 88,087
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
lysozym mg/ml
radíální difúze v agaróze
EntomopatogennEntomopatogenníí hlhlíístovkystovky (EPN)(EPN)
třída: Nematoda (Nematoda)
řád: Háďata (Anguilata)
čeleď: Steinernematidae
Heterorhabditidae
ˇ vyskytují se volně v půdě
ˇ selektivita - výhradně entomopatogenní
ˇ nízké teplotní optimum - do 20°C
ˇ využívají se jako prostředek biologického boje
EntomopatogennEntomopatogenníí hlhlíístovkystovky (EPN)(EPN)
Detekce enkapsulace EPN u G. mellonella,
Amphimallon sp. a Hoplia sp.:
1. Heterorhabditis bacteriophora
2. Steinernema glaseri
3. Steinernema scarabaei
DJ - H. bacteriophora DJ - S. glaseri DJ - S. scarabaei
1. Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae)
2. Amphimallon sp. (Coleoptera, Scarabaeidae)
METODY
1. Přirozená invaze EPN:
- larvy G. mellonella nebo larvy Amphimallon sp., Hoplia sp. + 25 EPN, 10% vlhkost
- inkubace 20 ­ 24 hodin za laboratorní teploty
- celkem bylo použito 70 ks G. mellonella, 23 ks Amphimallon sp. a 23 ks Hoplia sp.
Enkapsulace byla detekována u G. mellonella po přirozené invazi
H.bacteriophora
NENENENENENES.S. scarabaeiscarabaei
NENENENENENES.S. glaseriglaseri
NENENENEANOANOH.H. bacteriophorabacteriophora
HopliaHoplia sp.sp.AmphimallonAmphimallon sp.sp.G.G. mellonellamellonella
Enkapsulace: ANO / NE
A / přirozená invaze
B / injikace EPN
NENEANOANONENES.S. scarabaeiscarabaei
NENENENENENES.S. glaseriglaseri
NENEANOANOANOANOH.H. bacteriophorabacteriophora
HopliaHoplia sp.sp.AmphimallonAmphimallon sp.sp.G.G. mellonellamellonella
Shrnutí:
Témata bakalářských a diplomových prací týkajících se
entomopatogenních hlístovek jsou zaměřena na:
ˇ testy patogenicity jednotlivých EPN
ˇ srovnání invaze EPN do hostitele v různých prostředích
ˇ obrana hostitele vůči EPN
ˇ možnosti biologického boje s hmyzími škůdci
Výsledkem jsou:
- bakalářské a diplomové práce
- postery a přednášky na konferencích
- publikace
ˇ Biofyzikální ústav AV ČR (Brno, Laboratoř patofyziologie
volných radikálů ­ měření RKM, fagocytóza)
ˇ Výzkumný ústav včelařství a hedvábnictví (Dol)
ˇ Entomologický ústav AV ČR (České Budějovice, oddělení
Patologie hmyzu, Fyziologie hmyzu ­ antioxidační enzymy...)
ˇ Ústavem zoologie SAV (Bratislava, oddělení Entomologické)
ˇ problematika entomopatogenních hlístovek je napojena na
evropský program COST 850
ˇ Socrates Erasmus: Turku, Bari, Zonguldak
Spolupráce: