poptóza indukovaná E F ro RNDr. Alena Vaculová, Ph.D Laboratoř cytokinetiky Biofyzikálni ústav AV ČR E ct borci t nioFyiliälni úitnu flWCII, UNO Rodina TN Unikátní rodina proteinů - ligandů a receptoru které se významně uplatňuji v regulaci p rol if e race, diferenciace, apoptózy, zánětu zprostředkování rychlých, účinných a soecifickvch signálů a odpovědí buňkv receptory - transmembranove proteiny typu I, charakteristická přítomnost tzv. „cysteme-rich domains" a disulfidických můstku v extracelulární části molekul VA Iigandy - transmembranove proteiny typu II, vyskytují se ve formě membránově vázané ■ MJMjWJíjgjng Významné liaand • CD95L (FasL) - CD95, Fa • TNF-alfa - TNF-R1, TNF-R2 • TRAIL - DR4, DR5, DcRl, DcR2, OPG TNF-a, FasL, TRAIL -členové rodiny TNF -úloha v imunitních a zánětlivých reakcích organismu, v regulace proliferace, diferenciace a apoptózy -podobnost apoptotických signálních drah (oligomerizace receptoru, adapterový protein, death doména, iniciační kaspáza) - vazba na tzv „death receptory" (TNFR1, Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2) TNF-a. FasL. TRAIL cytotoxic ké řadu bu oliferační působě SjI Din ľTSjr i v^rK" ri irri alternativa postupům využívajícím ionizující záření »lllí^^ll edlejsi ucin zistence Svstémová aplikace - TNF-a, anti-Fas, TRAIL - TNF-a, anti-Fas - silná zánětlivá odpověď, poškození jaterních buněk - TRAIL - výhoda, selektivní toxicita, většina normálních buněk rezistentní k jeho účinkům, otázka - hepatocyty -in vivo - intravenózni infuze, vysoké dávky myši, primáti (šimpanzi) - bez toxických vedlejších efektů, co člověk? Receptory smrti Povrchové receptory, které přenášejí apoptotické signály vyvolané specifický" ,;~~~ Hraji khcovou roli v apoptoz Jejich prostřednictvím dochází k rychlé aktivaci iniciační ' ' "xl za několik sekund od navázání ligandu) Patří do rodiny TNF Nejznámější jsou TNFR1, CD95 (Fas), TRAIL-R1 (DR4) a UL-R2 (DR5) ..itracelulární doméně obsahují tzv. „death doménu ^DD)" - specifická sekvence, která je klíčová pro přenos umožni vazbu adaptérových proteinů (také obsahují tuto doménu) k receptoru > přes adaptérový protein se do DISCu váže pro-kaspáza (prostřednictvím DED domény) www.lin5.com/bloas/index plasma membrane Death Domain FA DD Pro-caspase 8 TNFa TNFR1 receptors TRADD TRAF-2 Apoptoiic Pathway Signalling Pathway DISC Death inducina si j complex • Signální komplex na úrovni receptoru • Aktivace iniciační kaspázy 8 -> Receptor + adaptérový protein (FAD Inhibice aktivace kaspá_ DISCu prostřednictvím proteinu FLIP ÍCaspase-lOt © Caspase-3> -5,-7 O O (executioner casceses) O J Eteatfi i subslraltts Aocptosla Natura Raulawa | Caricar TNF-a (tumor necrosis factor • multifunkční cytokin, významná úloha v imunitních a zánětlivých reakcích, kachexii, regulaci buněčného růstu a smrti, karcinogenezi • cytotoxické a antiproliferační účinky na řadu nádorových buněk avšak řada nádorovýc něk je rezistentních ApŮ|>lWIÍ (Ashkenazi, Dixit, 1998) Fas receptor identifikován v roce 1989 Purifikace ligandu v roce 1993, nakloňování v roce 1996, exprese převážně v aktivovaných T lymfocytech, N K buňkách a makrofázích Khcova role apoptozy zprostředkované přes FasL - FasR v imi- Liiiiiiwn eakcích CDÖCL EtfBCtor cnspasER Thorburn et al., 2004) Fas a imunitní svstém Í Fas je zodpovedný za eliminaci aktivovaných T lymfocytů po skončení imunitní odpovědi (10) • IR - aktivace T lymfocytů, proliferace, diferenciace - velké namnoženi efektorových buněk - zneškodnění patogenů ___^^^^^^^^^^^^^ • Poté nutná eliminace většiny těchto lym, nebo jinak poškození vlastních tkání organismu (autoimunitní onemocnění) a narušení homeostá > Up-regulace Fas na povrchu T lym, sekrece FasL -autokrinní (T lym) a parakrinní (cílová buňka) • Citlivost T lym k působení Fas však až po skončení 10, po několika dnech aktivace (klesá množství Bcl-2 proteinu) Fas - autoimunitní one rapeutické aplikace Fas - AIDS, diabetes, nádorová onemocnění.. a Di reel i m m une- rned iated k ii i ing b FasL- med i aTed autocrine cell suicide t>l end -org an ce H s- o r j uxtacrine fratricide T cell End-organ cell Apoptosis ot cell * End-organ cells V 4|0 m Fas ligand (FasL)-mediated apoptosis during inflammation Expert Reviews in Molecular Medicine©2001 Cambridge University Press Apoptosis (cell deal h J f« llCttdfel] WD JQ CD95L CE-Ce rami de PMACHX C-FLIP CASP-3 Bei--Bci-xL \ Apaf-1 Cyt c t CASP-g deaAh substrates r=j— apo ptosis type I type II TRAIL □ Tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand □ selektivní indukce apoptózy u celé řady nádorových buněk, ne však u většiny normálních TRAIL rĽttľ|>Lor und dcco\ ľťOčpiM If ■' j r.i r-i ■ ■: i y i' 11 Lr i| i r i y t> I Lrutr I i! i' i IL ■ i i 1: 111 if -| ■ 11 • fc», J > AU* jLUhU* * - - -+++~* -♦♦^ ***#* AiÁ*t UI (na rozdíl od TNF, Fas) • možnost interakce s pěti různými receptory TRAIL-R1 (DR-4, APO-2) TRAIL-R2 (DR-5, TRICK, Killer TRAIL-R3(DcR1) TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD) IGjš&ovfíSäsl http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/'- ages/trail, jpg Význam T RAIL u □ Velmi výhodné vlastnosti (selektivní působení na nádorové buňky, indukce apoptózy nezávisle na p53) využití v protinádorové terapii jako důležitá alternatíva ke konvenčním léčebným postupům využívajícím chemoterapii a ionizující záření (řada nádorů rezistentních, dráha přes mitochondrie, overexorese Bel-2^ □ Některé nádorové buňky jsou však rezistentní k apoptóze indukované TRAILem Popis signálních drah TNF-a, FasL a TRAILu je velmi důležitý pro pochopení mechanismu jejich působení, mechanismů rezistence a pro správné zacílení protinádorové terapie Důležitost srovnání citlivosti normálních a nádorových buněk - rozdíly v signálních drahách? Na kterých úrovních signální dráhy se projevuje rezistence? Přinese toto srovnání více informací o tom, proč TRAIL selektivně indukuje apoptózu u nádorových buněk a proč je většina nádorových buněk k jeho působení rezistentní? ktivace 2 základních typů drah: • Dráha na mitochondriích nezávislá - přímá aktivace kaspázy 3 pomocí kaspázy 8 caspase-8 activation Dráha na mitochondr'" závislá - ampli apoptotického úrovni mitocho roteinu Bid prostřednictvím aspázy 8 \?n\ň\ caspase-8 activation l-CQJpDSd S Eff «tw es TftAlL DM, ĎR5 ^»pr«i5 TRAIL „death receptor" DISC Prokaspaza-8 FADD Kaspáza-8 Efe kto rove kaspázy Bunečná membrána tBid Mcl-1 Bcl-2 Bax Bak 'tochrom c Mitochondrie ů F3 Kaspáza-6 Kaspáza-3 dATP Prokaspáza-9 Kaspáza-9 jádro Ovlivněni citlivosti / rezistence buněk k účinkům TRAILu: ovni receptoru - množství DRs a DcRs, jejich mutace na úrovni jednotlivých proteinů v si dráze - kaspáza-8, FLI - Bcl-2 rodina (Mcl-1, Bel-2, Bax, lAPs) BH -NF-K - kinázv - at nalni Mechanism ffa-issiii KW ezi o DcRl, 2 - decoy recepto )u ligandu s DR4, DcRl - nemá cytoplazmatickou doménu, 1?4 Mechanismy rezistence - kaspáza 8 ebo mutace této aspázy - blokace přenosu apoptotického Slilšl i lili I MSmSSimSííMI BEI kom inhibice aktivace SmfelrJMiilfclfrraiJfeltlll Mechanismy rezistence - IAPs IAP - inhibitor of apoptosis protei aktivitu kaspáz a tím apoptózu • IAPl, IAP2, XIAP.. O- I. IAP.. Viral OpiAP !lein '■ EinTIňŇg:268 Insect DIAP1 1dJŘ] R IMG. DIAP2 irr5ur~rľHg] r^ 438 TŘÍŇ^~498 Mammalian XIAP i rTBIFTÍ CIAP1 1 HÜEQ ŘiŇ^~ 497 RING ciAP2 1 r i buj] ĽBin: MLIAP n BRUCE1 Bin RING 604 618 RING ■298 "ŠIŘ luBčT: 4845 Nature Reviews | Molecular Cell Biology Mechanismy rezistence - Bcl-2 rodina -ve M regulaci rezistenci především u buněk typu II! MEK overexprese - rezistence k Proteiny rodin Bcl-2 Bcl-2-like survival factors BH4 BH3 BH1 membrane BH2 anchor ■ ■ I I I 1 1 _i----------1 i----------1 I------------1 i----------1 ■ :> 1___1 -------II-------------- 1___1 --------1-----h- I___I —I-----h" I___I 1 —i—\-m Bcl-2 Bcl-x, Mcl-1 Regulace mitochondriální dráhy indukce apoptózy Bax-like death factors BH3 BH1 BH2 I I I I III Bax -----------------nz\—i izzi— -------CZh-EZ > Bak BH3-only death factors BH3 Bik Bad Bid Noxa PUMA Bmf Death blocker Bcl-2 Cell death signal Death inducer CHECKPOINT Bax Death signal blocked i CELL SURVIVAL Death signal promoted i CELL DEATH Mechanismy rezistence - „Pro survival <' 11C1Ü1 Důležitá úloha kináz v regulaci citli nádorových buněk k apoptózi zprostředkované přes receptory smrti • MAPK/ERK dráha » PI3K/Akt dráha Vvznamná úloha N r-üS Mechanismy rezistence - NF-kappaB Důležitý transkripcni faktor v jadre, podílí se mj. na regulaci proliferace mutace NF-kappa B - nekontrolovaná proliferace egulace transkripce ředy genů zapojených v apoptóze - FLIP, IAP, antiapoptotické proteiny Bcl-2 rodiny a mnohé další aktivace NF-kappa B indukovaná přes některé DRs - TNFR1, DcRs oro TRAIL! Uloha „pro-survival" drah v ulaci citlivosti nádorových buněk k apoptóze zprostředkované přes „death receotor Dráha MEK/ERK pathway V této dráze dochází k hierarchické forforylaa zapojených molekul a jejich aktivaci - Ras, Raf, MEK, Klíčová dráha přenášející signály z receptoru růstových naMiiiiiíMKifffsi • Molekuly této dráhy mají důležitou funkci v regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy • Deregulace této dráhy mají dalekosáhlé důsledky a byly n 07 o iitiYsiiraii r ŕ im VMS IBUf j p (MIS íl maai IB! iE] Konstitutivní aktivace této dráhy u vysokého procenta nádorů (včetně nádorů kolonu) Inhibitory těchto kináz jako protinádorově působící léčiva uzn My^ŽBBIfllBlH^EMSB _________i-'„ -_________i: Ml- Tha organisation and function or the Ras-Rai-MEK-ERK pathway Fjif^rt H^tfrw* irt MMCUlAr H*fliCri*0 POO? Círnbndgř- Unřvfrjily ň*íí ERK - extracellular siqnal-requlated protein kinase, MAPK (mitoaen-activated orotein kinase) Regulace - proliferace - diferenciace - apoptózy The ERK MAP Kinase Pathway Receptor Ty r Kinase plttm* m*n»brflht ELK1 niicltuu TVini-ürlptiün, ^roli'cation.i-urvivai DIPTŕľ*rtlltluh Konstitutivní aktivace MAPKs je častým jevem u řady nádorových buněčných linií včetně kolonu (Hoshino et al., 19ÍT PI3K/A PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) - lipidova kinaza, vch receptoru •iyjgwj»3^iirjiiii| j \tvMUkt*\s\\t\M\r*TA»\ Buffil M IEBI ^ italytická a regulační podjedi Stimulace proliferace, inhibice apoptózy ivni aktív. roti nádorová terapeuti ka Aktivní PI3K fosforyluje a tím aktivuje kinázu Akt (PKB), která má dále celou řadu substrátů, jenž se podílejí na regulaci proliferace a apoptózy IčMMailiiiil '-TSni« Akt (PKB - Akt je jednou z nejčastěji aktivovaných protein kináz u nádorů, Akt může fosforylovat širokou škálu substrátů, z nichž některé hrají důležitou úlohu v karcinogenezi - Hyperaktivace Akt je spojena s rezistencí k apoptóze a zvýšenou buněčnou proliferací - buněčný homolog virového onkogenu vAkt - Akt spoušti radu antiapoptotickych signálu - inaktivuje proapoptotický protein Bel-2 rodiny - Bad, inaktivuje kaspázu 9, brání vylití cytochromu c z mitochondrií, reguluje hladinu proteinu FLIP, fosfory I uje N F-kappa B - Akt se podílí na stimulaci buněčného cyklu - reguluje stabilizaci některých cyklinů a transport inhibitorů kináz do jádra RPTK Inhibition of a po ptosis iTlTOR % Cel I growth and proliferation (Meier et 3T72005) fosforylace Akt Fosforylace (Ser9) GSK3beta aktivní inaktivní Fosforylace Bad, kaspázy-9, některých TFs ... Kináza důležitá v indukci apoptózy GSK Suffl substrát áza. 2 izo. . molekula v regulaci řady procesů v buňce jgulace metabolismu, apoptózy Fosforyluje více než 40 různých proteinů v buňce Významná role v apotóze (overexprese - podpora buněčné smrti, inhibice - suprese BS) Deregulace GSK - onemocnění - diabetes, nádory PSg—GSK-3 (inhibited) * Glycogen synthesis * Prolsin synthesis ■ p-catenin accumulation * Cell survival ■ Dorsal axis patterning in Xenopüs ■ Transcription factors activation TRAIL ... nejen indukce apoptózy, ale i ... - podpora růstu a přežívání u nenádorových buněk - např. lidské endoteliální buňky (Secchiero et al., 2003) - účast v regulaci homeostázy ve tkáních - simultánní aktivace proapoptotických i antiapoptotických signálních drah po ligaci TRAILu na receptory nádorových buněk (Baader et al., 2005) - regulace proliferace nádorových buněk (A, P, AP, 0 cells) - TRAILem indukovaná proliferace nádorových buněk může být nebezpečná u nádorů rezistentních k apoptóze indukované TRAILem - posílení nádorového růstu - nutné sledovat interakce těchto drah, mít možnost klasifikovat buňky z hlediska reakce na tento cytokin a předvídat tak účinek protinádorové terapie využívající TRAIL TRAIL jako aktivátor pro-survival drah Po působeni TRAILu byla rovnez popsaná aktivace nebo nárůst exprese řady molekul zapojených v regulaci přežití* • MEK/ERľ • Mcl-1 • NF-kappaB atd. ana jen jako induktor apoptózy, ale rovněž faktor \f \f F F F Důležitost rovnováh V modulaci citlivosti buněk k apoptoti rovnováha mezi pro- a anti-apoptotickými sianálními drahami!!! Modulace apoptózy indukované TRAILem v podmínkách inhibice MEK/ERK dráhy ibitorv: J0126 - inhibitor MEK1/2 LY294002 - inhibitor PI3K 3 Buňky p re t rea to ván treatment s TRAILem a studiu apoptoz Posílení apoptózy indukované TRAILem v podmínkách specifické inhibice dráhy MEK/ERK Štěpení PARP (Vaculova et a L, Štěpení CK18 (M30cytodeath, FCM) U0126 10 1.4+0.3% IF■I■■ M30cytodeath TRAIL 102 103 M30cytodeath 10' CD ■:-j ■i:- ^-TRAIL+UÍ>126^ 38.5±4.8%*-Hx 10' 10^ 10l M30cytodeath 10" 10" IQ1 10' 10" M30cvtodeath 10" Posílení apoptozy indukované TRAILem v podmínkách specifické inhibice dráhy PI3K/Akt (Vaculova et al., 2006) í 60 3 50 ^40 o c 30 > E 20 IM o 10 Štěpení CK18 (FCM) *• ^v v" sfr NT Kaspáza-8,( > Bel-2 rodina - • Mitochondrie • NF-kappa [ >GSK - Mcl-1, Bad, Bcl-2 - vylití mediátorů apoptozy Survival FbcIotel Growth Fadors. Cytokmaa.etc. Death Stimuli: Survival Factor Withdrawal HSP60 [■ Cell Signaling www.cellsianal.il reference/oath Wc /mito ctrl.Dh APOPTOSIS DNA dainage Ganolouc £lre&a Rovnováh V podmínkách inhibice dra důležitých pro přežití buňky (MEK/ERK, PI3K/Akt) dochá posílení apopť 5£H linulo ľn^ IÉJJJc tlus Zl\/Z Kombinovaná teraoie i hrnutých v regulaci proliferace a rüst Kombinovaná teraoie - kinázové inhibitory jsou v současné dobe intenzívně studovány Slibné využití v protinádorové terapii Děkuji za pozornost! ctborcit flioFy» kalni üsfcciv nVCfl.