iviecnanismy jsou preametem vyzKumu Je proKázáno, že vysoKy príjem Kalorií a tvorba tuKovych zásob je rlzlKovym faKtorem. Príjem, absorpce a metabolismus velKého množství potravy vyžaauje oxiaatlvní metabolismus a proauKuje více reaKtlvních KyslíKovych raaiKálů, Které pošKozuií DNA. Ukázalo se nádorů. Epide itivní korelaci A. *J louhé historii studií tuků a nádorů, zůstává nejen i rostlinné oleje a rybí olej, zejména a tuků h raje důležitou roli, a že se platnují vysoce nenasycené mastn kyseliny (VNMK, PUFAs) t ríd n-3 a i Tm živočišné a rostlinné Mastné kyseliny ► s krátkým řetězcem - 6-12 C (SCFA) kys. máselná,propionová ► nasycené - 12 a více C kys. palmitová, stearová ► mononenasycené -16 a 18 C, 1 dvojná vazba ys. palmitoolejová, olejová ► polynenasycené (PUFA) - 18 a více C, 2 a ví dvojných va kys linoleo vazba ěny membránových fosfolipidů VMM syntézu lipidových mediátoru typu eikosanoidu sekundárních přenašečů diacylglycerolu a ceramic. Lipidové mediátory ovlivňují produkci a funkci cytokinů. To má důležitý dopad na řadu imunitních a _ buněčných funkcí včetně proliferace, diferenciace a apoptózy >\\w\\\ * 11ttf íl IngLyccndc sEruclurc lihawing ..: ii _i 11 . i ^ i.:.- ..L:..Jl_\l M Imbalance v lÍDÍdovém metabolismu hraje roli u mnoha závažný ► Vysoká hladina cholesterolu je spojena s kardiovaskulárním chorobami, které jsou nejčastější příčinou úmrtí v populaci. ► Lipidy produkované buňkami imunitního systému j zahrnu dní inětli vé onemocnění střeva. ají úlohu také v psychických a neurodegenerativních zofrenie, Alzheimerova choroba) nádorových onemocnění chi ipidy ovlivňují počátek a rozvoj Relativní procento různých mastných kyselin v potravě a změny způsobené průmyslovým zpracováním potravin —i-1 ~ 10,000 i,S00 1,900 ^00° Years Fig. I. Hypothetical scheme of fat fatty acid [3, trans and total) intake (as percentage of calories from fat) and intake of vitamins E and C (mg.-d). Dam were extrapolated from crass-sectional analyses of contemporary hunter-gatherer populations and from lomiilLidhial ohnervations and their putative changes during the preceding 100 years [75]. VYSOCE NENASYCENÉ MASTNE KYSELINY (Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. u Tři hlavní skupiny PUFAs: n-3 (omega-3), n-6 a n-9, podle polohy dvojné vazby nejbližší ke koncovém metylovanému uhlíku. Tyto jsou metabolizovány stejným způsobem alternativními desaturačními a elonsačními enzym RA: NOMENKLATU Např. kyselina arachidonová, 20:4, n-6 u govaných dvojných vazeb í dvojné vazby od metylovaného konce molekuly né vazby jsou ve víceméně stabilní cis - konfiguraci. ntetizovat n-3 a n-6 PUFAs de novo ani nedovedou přeměnit nu sérii v dru Tyto ESENCIÁLNÍ MASTNÉ KYSELINY musí být obsaženy v potravě podobně ožka všech membrán a permeabilní bariéry cožky a jako prekursory eikosanoidů a s nimi souvisejících látek, které hrají důležitou úlo Živočichové nedovedou hu ve tkáních eie (n-6 PUFA) a rybí olei (n-3 PUF VYSOCE NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (VNMK) (Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Esenciální prekurzorové kyseliny řady n-6 a n-3 CIWtA^\AM rostl.oleje 18:2n-6 COOII _/WWWVW\ CH^ COOH cfyvwwwwvCOOH 20:3 n-6 Diliomcvy-linolenic acid (DGLA) A5 desaturase c:ooh \ 20:4n-6 \ 20:5n-3 Arachidonic acid (AA) OOH t 22:4n-ó i 22:5n-6 Eicosapentaenoic acid (EPA) . /WWWWWVX ■U' coon Elongase Docosapenlaenoic acid (DPA) Elongase, Aódesaturase and peroxisomal ^-oxidation -*-- 22:5n-3 ^rybí oleje I 22:6n-3 /WWWWWWV ._Lil*. COOH Docosahexaenoic acid (DHA) Důležitý je poměr n-3: n-6 VNMK!!! Kvs. linolová (18:2, w-6) kyselina arachidonová (AA, 20:4), rostlinné oleje zdroj eikosanoidů (prostaglandiny, leukotrieny) význam u různých nádorů. V experimentálních systémech často podpůrný účinek pr vznik a rozvoj nádorů ys. eikosapentaenová (20:5) a dokosahexaenová (22:6) bích a některých rostl. olejů (pupalka, len, ral V experimentálních systémech často i vznik a rozvoj nádorů n, r íú nhibiční účinek pro J ntercelulární me signalizační sUě ěčn enciá ních vvsoce ne n mastných kyselin (VNMK) vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipid Tvto změny pak ovlivňují vazbu cytokinů, aktivitu receptorů i I (G protein fosfolipáz atd.). h unkci na membránu í kaboratory ^taof ytokinetic r Patologické změny v produkci a funkci cytokinü a ikosanoidů přispívají k rozvoji nádorových onemocně zejména ovlivnění m imu nitního systému a buněčné k tiky Metabolismus a obrat fosfolipidů v membránách i oxidativní metabolismus nádorových buněk se zásadně liší od buněk nenádorových. Nádorové I buňky oncentraci VNMK ve srovnání s normální tkání ♦ zvýšenou periferní utilizaci VNMK z potravy ♦ změny v oxidativním metabolismu a antioxidační ochraně ♦ zvýšenou aktivitu enzymů metabolismu kys. arachidonové (COX2, 12-LPO...) a produkci eikosanoidů ♦ sníženou citlivost k endogenním inhibitorům růstu (TGF-p1), induktorům apoptózy (TNFa, FasL, TRAIL) a diferenciace (butyrát) í kaboratory ^taof ytokinetic Table 1. Possible mechanisms for the protective action of dietary fibre on colorectal oncogenesis Physical Increased bulk and dilution of carcinogen Decreased contact time due to more rapid transit Binding of carcinogen Binding of bile salts Pre hi otic and metabolic action of flora Alteration of colonic microflora; numbers and species balance Inhibition of carcinogen activation Stimulation of flora to increase bulk Alteration of bile salt metabolism to reduce conversion to secondary bile salts Fermentative L owe r i n g o f p H Reduced solubility of bile salts Increased production of SCFAs, especially butyrate Mem ho He Reduced insulin resistance and hypennsulinaemia stné kyseliny s krátkým řetězcem- BU ukován anaerobní mikrobi n iny ve střev ca; Dt ^11 Možné mechanismy působení SC na proliTeraci a Tunkci střevních buněk anaerobic fermentation of colonic carbohydrate direct provision of energy blood vessels (3D"' dilatation and increased blood flow SCFA enterohormones pancreatic acinar cells autonomic nervous system paracrine effects intestinal cell proliferation direct effects systemic effects rhe effects of butyrate in the colon epithelial celk during adenoma-carcinoma transition Normal Mucosa I Hyper-proliferation T Early Adenoma Intermediate Adenoma Late Adenoma Carcinoma Metastases Stimulation of proliferation in the basal CTypt Inhibition of proliferation in the upper cry p I Induction of apoptosis Inhibition of proliferation Stimulation of differentiation Hype racetyl at i on o f h 1 ston cs Alterations in gene expression V.flFccts on extracellular matrix Regression of carcinomatosis in vivo (acetate:, propionate, butyrate) (butyrate) (butyrate) (butyrate, propionate) (butyrate) (bin y rate) (butyrate) (iiiterleukiii-2 + butyrate) Účinky butyrátu na nádorové buňky: Inhibice proliferace - blok v G1 nebo G2/M, indukce p21, Cyklin D1,D3, downregulace c-myc Indukce diferenciace a apoptózy - genové arrays Inhibitor histon deacetyláz - změny exprese genů Ovlivnění specif. kináz, aktivace PPAR gamma, inhibice NFkB Inhibice c-Src, FAK, iNOS, CO (-2 TIME OF BUTÝRATE TREATMENT SliDTl-diEiin frilly titjids S Fig. 4. Overview of the different pathways leading to inhibition of cell proliferation and the blocking of the G1 stage of the cell cycle (for details, see p. 104). NF-kB, nuclear factor kappa B; Rb, retinoblastoma protein; cdk, cyclin-dependent kinases; p21/cip11 a member of the Cip/Kip family which bind to the cyclin-cdk complex to inhibit its activity; Tob1 (APR06), a member of the anti-proliferative family APRO, members of which control cyclin D1 transcription. NÁDORY KOLOREKTA (CRC) Výskyt industrializované země (životní styl, výživa) ČR (třetí nejčastější příčina úmrtí na rakovinu) věková distribuce (muži nárůst případů od 60 let; ženy Epitel kolore střevní krypty výměna epite (detachme nt-ind od 70 ist proliferační a diferenciační) ^zrání buněk, o uced apopto konci více I oncentrace rustovycn Taktom v kryptáci e buněk prod ukujících GF) lorektální karcinogéne ušení rovnováhy mezi prolifera cí a diferen apoptózou-anoikis roliferační č ciaci pta, adenom, adenokarcinom,, Germany Austria Portugal Denmark Italy France Belgium European Union The Netherlands United Kingdom Sweden Luxembourg Ireland Spain Finland Greece Incidence Mortality 0 ■ 1 ■J 20 40 60 Incidence per 100,000 people 80 Figure 1 | Colorectal cancer incidence in males in the European Union. Rates of colorectal cancer by incidence, per 100,000 people, and mortality during 1996. Data were collected from Eucan — a service that provides data on the incidence and mortality of 24 key cancers in 15 member states of the European Union2. Struktura hlášených onemocnění novotvary bez dg. C44. A - muži; B - ženy (podle ÚZIS) J Cell shedding Fig. 1. The anatomy of the small intestinal epithelium. The epithelium is shaped into crypts and villi (left). The lineage scheme (right) depicts the stem cell the transit-amplifying cells, and the two differentiated branches. The right branch constitutes the enterocyte lineage; the left is the secretory lineage. Relative positions along the crypt-villus axis correspond to the schematic graph of the crypt in the center. Obnova střevní výstelky LUMEN OF GUT |epithelial eel! migration from "birth" at the bottom |of the crypt to loss at the top of the villus Ktransit time is p-5 days) lepithelia bells |crypt loose Iconnective tissue villus (no cell divisioi cross sectn of villus cross section of crypt villus absorptive brush-border cells mucus-secreting goblet cells direction of movement (A) nondividing differentiated Paneth cells nondividing differentiated- cells rapidly dividing cells (cycle time - 2 hours slowly dividing ste cells {cycte time > 24 hours crypt JFigure 22-19 part 1 of 2. Molecutar Bioíogy of the Cell, 4th Edit Střevní krypta a profil růstových faktorů Crypt (a) Model (b) Growth factor profile (c) 20 c E 10 CC '-5 °-£5 E i 8 CL U c o o Cl "ô o -l-U-L- 0.8 0.6 0.4 0.2 Growth factor 0.0 DIFFERENTIATION APOPTOSIS (anoikis) terminal cells Prd if e rati ng f d ifferenti ating ceils Stem cells APOPTOSIS [damaged cells) Endogenous regulators PROLIFERATION o REPLICATION STAGES O o kmenové buňky ♦ kontinuálně se obnovující buněčné populace ♦ řada zásadních fyziologických funkcí ♦ dynamická rovnováha mezi přírůstkem buněk na bázi krypty (proliferace) a úbytkem (anoikis -„detachment induced apoptosis") na povrchu. ♦ regulace endogenními faktory (hormones and cytokines), ale rovněž složkami diety přítomnými v lumen střeva RioFyihälní Lrxfcciv nVČflF MNO Apical surface Direction of migration Basal surface Spontaneous apoptosis Lamina propria mu ocularis externa Zone of differentiation Zone of proliferation * Stem cell region Epitheltal/ mesenchymal interactions Lymph nodule Sub-mucosa r 1 Vliv různé intenzity apoptózy na homeostázu Rychlost buněčné proliferace Intenzita (rychlost) apoptózy ř kaboratory ^taof ytokinetic INICIACE MUTAGENY RADIACE VIRUSY.... GENOTOXICITA PROMOCE NEGENOTOXICKÉ KARCINOGENY PROGRESE GENOTOXICKÉ +NEGENOTOXICKÉ FAKTORY O NORMÁLNÍ BUŇKA 1 G INICIOVANÁ BUŇKA PRENEOPLASTICKÉ PORUCHY [C/TOD] MALIGNÍ NÁDOR INVAZE METASTÁZY AKTIVACE PROTO-ONKOGENŮ INAKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENŮ INAKTIVACE ANTIMETASTAT. GENŮ Mnohostupňový proces karcinogeneze K baboratory ^taof ytokinetic Vliv narušení (stimulace/inhibice) průběhu apoptózv v rámci procesu vícestupňové karcinogeneze j r Karcinogeneze však znamená víc než jen mutagenezi Kromě genových a chromozomálních mutací (genotoxicita) zahrnuje i NEGENOTOXICKOU SLOŽKU (EPIGENETICKÉ DĚJE) změny v expresi genetické informace na transkripční, translační nebo postranslační úrovni Geny jsou zapínány a vypínány ► během vývoje ► během buněčného cyklu, když buňka proliferuje ► když buňka diferencuje ► když je diferencovaná buňka stimulována k adaptivní odpovědi Iniciovaná kmenová buňka ie omezena v dalším růstu okolními normálními buňka Po expozici nádorovým promotorem nebo promočními podmínkam (buněčná smrt nebo odstranění buněk) supri buněk prostřednictvím kontaktní inhibice mi í kaboratory ^taof ytokinetic Homeostáza ve tkáních je udržována integrovaným systémem komunikačních mechanismů (mimo-, vnitro- a mezibuněčných) a reguluje chování buněk především s ohledem na schopnost proliferace, diferenciace, adaptivní odpovědi a apoptózy. niciované preneoplastické buňky jsou udržovány v latentním stavu v Jůsledku působení těchto "přirozených" regulačních mechanismů. půr né (promoční) fázi rozvo cí negeno necnanismy, tzv. nád k v důsledku deregula pigenetickými y, kt e zmíněných proc Zásahy, které vedou ke změnám v expresi genů a k poruchám homeostázy í kaboratory ^taof ytokinetic r Hlavní mechanismy charakterizující negenotoxickou karcinogenezi ■ ovlivnění mechanismů signálové transdukce ■ aktivace specifických receptoru ■ produkce reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, RNS) ■ změny GJIC ■ změny v metylaci DNA nebo v acetylaci histonů ■ ovlivnění exprese onkogenů, nádorově supresorových genů a genů buněčného cyklu ■ změny buněčného cyklu ■ změny proliferace (regenerativní nebo mitogenní) ■ změny v apoptóze ■ změny v rovnováze vyúsťující ve změnu obratu buněk ve tkáni í kaboratory ^taof ytokinetic CYTOKIN ížité endogenní f Viktory ovliv kolorektál ní karcinogenezi -family (TNF-a, F as ligand, TRAIL _ — TNF re lating apoptosis in amily (TGF-0) o cm F- a) interleukiny etu a dietetickými faktory — mastné kyseliny í kaboratory ^taof ytokinetic výživový status proteiny lipidy vitamíny minerály infekce zánět neoplazie produkce a uvolňováni cytokinů lipidové mediátory PG LT atd. biologická funkce cytokinů imunitní odpověď odpověď akutní fáze horečka anorexie změněný metabolismus é vztahy mezi výživou a infe obami zprostredkov hor INTERACTIONS OF DIETARY FACTORS AND ENDOGENOUS REGULATORS SUPPOSED TO AFFECT CYTOKINETICS OF COLONIC EPITHELIAL CELLS GUT-LUMEN APOPTOTIC CELLS DIETARY PUFAs (n-3, n-6) t 1 \ EPITHELIAL CELLS DIETARY FIBRE i EICOSANOIDS BUTYRATE CRYPT ? CYTOKINES (TNF-a, FasL, TRAIL) PROLIFERATIVE PART Hofmanová J. et a. Eur J Nutr 2005 Hofmanová J. et al. Cancer Letters 2005 Vaculová et al. Cancer Letters 2005 v Labor ♦ ÚČINKY VNMK kys. arachidonová, AA, 20:4, n-6 kys. dokosahexaenová, DHA, 22:6, n-3 BUTYRÁTU (NaBt) samostatně nebo v kombinaci na cytokinetiku epiteliálních buněk kolonu a detailnější poznání mechanismů Účastnících se těch _.,..™_,JNIMI INDUKTORY APOPTOZY (TNFa, Fas, TI jejich vlivu na epiteliální buňky kolonu - mechanismy • změny buněčných lipidů v souvislosti s modulací cytokinetiky ^^■of yt aboratory "okinetics > Základ ni v\ zk YSTUP > Klini protinádo oblast nu opti ekl m one ový cíleného rých výživ pro určité diagnózy "), zejména u pacientů m R - „Tukové slož CLciborcitoř Vlokinelikv níoFv»hälni úilnw I1VČII, BI1NO Linie lidských epitelialnich buněk kolonu FHC normální tetami střevo |©ATCC High Density HT-29 diferencující neinvazívní Adenokarc Scale Bar ^ 1 ffi^rn I High Den Síty Scale Bari iů{]-|jrn HCT-116 nediferencující invazívní om kolonu High Density Scale Bar= 1{H}|jnn SW 620 - lymf. uzlina METODOLOGIE CYTOKINETIKA Detekce pro a zapojenýc e- reau inů, ěčného cvklu diferenciace -buněčná morfologie, aktivita specifických enzymů, exprese specifických proteinů apoptózy -detekce charakteristických zm úrovni jádra, mitochondrií, membrán, cytoskeletu, exprese regulačních proteinů štěpení specifických enzymů a substrátů h změn n o nzvm ZMĚNY LIPIDOVÉHO METABOLISMU A VLASTNOSTÍ BUNĚČNÝCH MEMBRÁN -změny spektra MK v bun. lipidech, „lipid packing" v membránách, akumulace riglyceridů, detekce kardiolipinu, membránový potenciál a dusíku, lloldová oeroxl dace, ytometrie, fluo molekulární biologie mikroskopi laboratory nylokinelics DETEKCE APOPTOZY S VYUŽITÍM PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE - SROVNÁNÍ VYBRANÝCH METOD Vaculová Alena, Hofmanová Jiřina, Souček Karel, Horváth Viktor, Kozubík Alois Laboratoř cytokinetiky, Biofyzikálni ústav Akademie věd ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno; e-mail: vaculova@ibp.cz etekce apoptozy různým UVOD Apoptóza, geneticky kontrolovaný proces buněčné smrti, je charakterizována specifickými morfologickými a biochemickými znaky. Mezi ně patří bobtnání cytoplazmatické membrány, ztráta >uněčné adheze, reorganizace cytoskeletu, kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu a tvorba tzv. apoptotických tělísek. Zároveň dochází k akitvaci kaspáz, změnám itochondriálního membránového potenciálu, změnám v symetrii rozložení lipidů v membránách a aktivaci endonukleáz, která je doprovázena internukleozomální fragmentací DNA. TRAIL je ligand z rodiny TNF (tumor necrosis factor), který indukuje apoptózu u celé řady nádorových buněk, zatímco většina normálních buněk je k jeho účinkům rezistentní. V současné době je intenzívně studována možnost využití TRAILu v protinádorové terapii. Úspěšnému využití TRAILu v klinické praxi musí předcházet detailní studium jeho signální dráhy. TRAIL indukuje apoptózu po vazbě na tzv. „death receptory" DR4 (TRAIL-R1) a DR5 (TRAIL-R2). Na úrovni receptoru dochází k tvorbě signálního komplexu zvaného DISC a k aktivaci iniciační kaspázy-8. Aktivovaná kaspáza-8 může dále přenášet apoptotický signál dvěma cestami. Dochází jednak k přímé aktivaci kaspázy-3, jednak ke štěpení proteinu Bid, který přenáší signál do mitochondrií. V regulaci průběhu tzv. mitochondriální dráhy indukce se významně uplatňují einy rodiny Bcl-2, reaktivní metabolity kyslíku, změny itochondriálního membránového potenciálu a vylití pro-apoptotických proteinů do cytoplazmy. Následuje aktivace iniciační kaspázy-9, která dále aktivuje kaspázu-3. Tato efektorová kaspáza se pak podílí na štěpení celé řady tzv. „death substrátů" jako jsou např. poly(ADP-ribosyl) polymeráza (PARP) nebo cytokeratin 18 (CK18). 3Ší práci jsme se zaměřili na studium signální dráhy a změn v průběhu apoptozy indukované TRAILem u modelové buněčné linie lidského adenokarcinomu kolonu HT-29. Při studiu jsme využili řadu metod průtokové cytometrie, fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie western blotingu s následnou imunodetekcí. Získané výsledky, jejich srovnání a interpretace jsou obsahem tohoto sdělení. CÍLE PRÁCE popis signální dráhy TRAILu u lidských nádorových buněk kolonu HT-29 detekce charakteristických parametrů apoptozy nádorových buněk kolonu HT-29 s využitím několika moderních metod průtokové cytometrie a srovnání dosažených výsledků interpretace těchto výsledků s ohledem na další výsledky získané pomocí metod fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie a western blotingu s následnou imunodetekcí ZAVERY Detekce apoptozy indukované TRAILem u buněk linie HT-29 - srovnání vybraných metod Po působení TRAILu docházelo k významným změnám na úrovni cytoskeletu a plazmatické membrány buněk HT-29 • v důsledku aktivace kaspáz (potvrzeno pomocí detekce aktivity kaspáz a štěpení prokaspáz) docházelo ke specifickému štěpení CK18 u 25,7% buněk • u stejného počtu buněk (26,3%) byla detekována translokace PS v cytoplazmatické membráně Velmi dobrá korelace výsledků použitých metod byla také zaznamenána na úrovni mitochondrií . TRAIL indukoval významný pokles MMP u 14,6% buněk • jako pozitivní s ohledem na expresi proteinu Apo2.7 bylo detekováno 17,1% buněk Během apoptozy buněk HT-29 byla pozorována kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu u 15% buněk (fluorescenční mikroskop). Nebylo však detekováno internukleozomální štěpení DNA (TUNEL, agarózová gelová elektoforéza). Předpokládáme proto, že u buněk této linie probíhalo štěpení DNA pouze na malý počet fragmentů o vysoké molekulové hmotnosti, pro jejichž detekci pravděpodobně nebyla metoda TUNEL dostatečně citlivá. me todami USPOŘÁDÁNÍ EXPERIMENTŮ Buňky HT-29 byly vysévány v McCoyově médiu s 5% séra a kultivovány při standardních podmínkách. 24 hodin po vysetí byly buňky ovlivněny přidáním TRAILu (100 ng/ml, lidský rekombinantní His-TRAIL) na dobu 4 hodin. Následovalo hodnocení charakteristických parametrů apoptozy, především pomocí několika různých metod průtokové cytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson). Získané výsledky byly dále doplněny pomocí metod fluorimetrie (Fluostar Galaxy), fluorescenční mikroskopie (Olympus IX70) a metody western blotingu s následnou imunodetekcí. Všechna data (vždy 3 nezávislá opakování) byla statisticky vyhodnocena (ANOVA, Tukey test, p 0,05), (*) značí výsledek významný ve srovnání s neovlivněnou kontrolou. Průtoková cytometrie SHRNUTÍ Bylo provedeno srovnání výsledků získaných pomocí metod průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Hodnoty v tabulce představují výsledky (průměry ze tří nezávislých opakování) hodnocení vybraných parametrů apoptozy - štěpení CK18, translokace PS, exprese proteinu Apo2.7, pokles MMP, změny na úrovni jádra detekované pomocí metody TUNEL (průtoková cytometrie) a na základě hodnocení jaderné morfologie (fluorescenční mikroskopie). cytoskelet a mitochondrie jádro Ztráta MMP se hodnotí jako nepřímý důkaz megapórů a zvýšení permeability vnější mitochondriální membrány, které hraje úlohu při vyliti některých mediátorů apoptozy z těchto organel. Při analýze MMP se použivá fluorescenční lipofilní katión TMRE (tetramethylrhodamin ethyl ester), který se hromadí v mitochondriích v závislosti na MMP. S využitím průtokové cytometrie lze detekovat posun ve fluorescenci TMRE, podávající informaci o změnách MMP. Efektorové kaspázy mohou štěpit řa Na úrovni cytoskeletu se jedná především o CK18. F specifickém rozštěpení molekuly CK18 je odhalen epitop, který se nachází výlučně u apoptotických bi (M30cytoDEATH),konjugovanésFITC.P P Po působení TRAILu docházelo k specifickému štěpení CK18, pozitivní s oh studovaný parametr apoptozy bylo 25,7% bu PARP je jaderný protein (113 kDa), který se podílí na opravě zlomů DNA. Během apoptozy dochází ke specifickému štěpení PARP na fragmenty o velikosti 89 a 25 kDa. Detekce těchto fragmentů je považována za ciltlivý marker následné internukleozomální larakteristické znaky apoptozy. [ jejich 3'OH konců nukleotidy konjui FITC. Velmi výhodné je současné obarvení DNA propidium jodidem. Takto lze detekovat, zda indukce fragmentace DNA je specifická pro určité fáze buněčného cyklu. k HT-29 během apoptozy indukované TRAILem prokázána internukleozomální fragmentace DNA. i fragmentů DNA o velikosti 180 bp u apoptotických T-29 byla v naši laboratoři rovněž potvrzena pomocí vé gelové elektroforézy DNA. n Fluorimetri Fluorescenční estern blotting • změny v uspořádání membránových lipidů (AnnexinV) • aktivita a štěpení kaspáz • štěpení substrátů kaspáz (PARP, cytokeratin 18) • exprese proteinů rodiny Bcl-2 • mitochondriální membránový potenciál • kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu ^bctborcitoř »ioFV*í kôlni ústaw flVČnr MHO Z naky diferenciace in ALKALINE PHOSPHATASE E-CADHERIN PROTEIN F-ACTIN (Stress fibers) EXPRESE KARCINOEMBRYONÁLNÍHO ANTIGENU Proliferated cell Growth inhibition & arrest in G1-phase of the cell ► 3mM oT cmormory ytokinetics kys. arachidonoví ys. dokosahexaeno' NMK A, 20:4, , DHA, 22:6 n-6 BUTYRATU (NaBt) samostatně nebo v kombinaci ciborcitoř nivfVííhálni úifcnv flVČnF MNO VNMK (AA, n ly citlivost buněk HT-29 vané NaBt Eur J Nutr (2 005) 44:40-51 00110.1007/500394-004-0490-2 ORIGINAL CONTRIBUTION Jiřina Hofmanová Alejím Vaculová Antonín Lojek Alois Kozubík Interaction of polyunsaturated fatty acids and sodium butyrate during apoptosis in HT-29 human colon adenocarcinoma cells J. Hofmanová etaf. Potentíation of apoptosis by fatry acidsin colon cancer celis 45 A A htM} MaBt{mM| CHX (ng/mI) ■ subG0/G1 □ floating cetís ■ subG0/G1 □ floating cells I Ä í I QJĽ 5 5 20 5 5 Fi g, 5 Prod uc tron off reactive oxygens pecies IR051 m HT 2 9 eel Is non p re t rented or pre treated tor 4Ě h wit hi 0 ull of arachido nc ÍAA 5 0; ň\ or 2U \vA of d ocosahsaono: IDHA20; E] Kid and then incubated for 24 h inPUFA free medium without or with 5 rriM sodium butyrate fAA5Ú Na&X DrlA20 NaBtl. R05 were measured by FCMas dihy drorhodamine 123 |DHR 1231 fluorescence |FLl HI. The figures hows a representative resultof three independent experiments -T CHA 20 — TJHA2U+N*B1 MMF 10 io' ir TWREÍFL£-hO Fi g, í Mitochond rial nembrane potential |MM PI of HT 29 cd Is non pre treated o r pre treated tor 4S h wi th 5Ú uM of arachidon ic lA A 5 0 ÍDHA2D; El acid and then incubated for 2 4 h in PUFA free nedium without or with 5 rnM sodium butyrate |M50 NaBt, DHA20 NaBtl. MM methylrhodamine ethyl ester perchlorate ITMRE1 fluorescence |FL2 HI. .Wí region of collapsed MMP, AW region of dissipated MM P.. >WJ n shows a representative result of three independent experiments Zvýšená r M olekulární determinanty účin studovaných látek Wwfm Proteiny buněčného cyklu (p21, p27) Apoptické proteiny laboratory ytokinetics J /náni odpovědi nenádorových a i lorových a nádorových b 9C n 8C 7C 6C 5C I 4C 3C 2C 1C I C Apoptosis c Y 12CC n 1CCC 8CC 6CC 4CC 2CC c C ^ protein rodiny Bcl-2 podporující přežití buněk lokalizovaný na chromozomu 1q21 krátký „half life", rychlá regulace > hraje důležitou úlohu při rozhodování buněk mezi životem a smrtí v odpověd • chrání buňky pi enciac rání buňky před apoptózou v průběhu prese se snižuje při indukci apoptózy pen kaspázami na molekulu podporující apoptózu > ie štěpe zajíma ' li I ■ I m f i r ú ■ vý s hlediska protinádorove terapie of laboratory ytokinetics J Aktivita kaspaz po pus iich a ieiich ko 200 ~ ? 150 *? S 100 2.^ 50 0 24 h ^ ^ & * <$T ^ ^ 200 O* 150 o 100 55 50 48 h ^ ^ of DilTĽnĽnLiaLiiŤn 2004 The effects of TNF-a and inhibitors of arachidonic acid metabolism on human colon HT-29 cells depend on differentiation status • Baicalein (BA) - 12-LOX inhibitc • NDGA - LOX inhibitor • Niflumová kys. (NA) - COX inhibitor • Indometacin (INDO) - COX inhibitor ^ ETYA - kompetitor AA í Laboratory ^■■of ytokinetic B Ä o o TJ r C B I c3 ja U- c OJ "5! u 1- Diffe Navozením diferenciace (působením NaBt) i ví ér * r BJ_|B v ■ v # se buňky stávají citlivější antiproliferačním a apo účinkům TNFa a inhibitorů metabolismu Undifferentiated Differentiated cells cells COX-2 5-LOX Bcl-x Bak l if;. 2 Cell number (A) and apoptosis (B) (measured by fluorescence microscopy after DA PI staining) of undifferentiated and NaBt-diffcrcntiatcd HT-29 cells treated for 24, 48, or 72 hr (h) with TNF-a (15 ng/ml; TNF 15). V<0.05 versus TNF-ot-untreated controls (considered as 100%). 24 h 46 h 72 h 24 hi 43 h 72 h I ijj. I Expression of COX-2, 5-LOX. Bcl-x. and Bak proteins in undifferentiated and NaBt-diiYcrentiatcd HT-29 cells cultivated for 24 48, or 72 hr (h). 400 o £ 950 8 300 * 250 « 200 8 150 f 100 | 50 0 B _ I ° 20 0 15 1 Q, 10 8. O 5 ":— | 0 □ U ndif fe rentiated eel I s H D iffe re nt iated ce I Is i 0 JL rh 8s s u 5 « O IN 21 □ Undifferentiated cells □ Differentiated cells J o Is o 5 g as S3 □ Undifferentiated cells Differentiated cells 1 Tig.4 Quantification of floating cells (A), sub-Go/G] population (B). and morphologically detected a pop to sis (C) in undifferentiated or NaBt-diffcrcntiatcd I1T-29 cells treated for 48 hr with INDO (50 or 200 uM), NDGA (25 or 100 u\f), or BA (50 or 200 uM). +/*<0.05 (§ P< 0,001) versus inhibit or-untreated controls (considered as 100%), □ Undifferentiated cells ib Differentiated cells AH ffl z < o o < O B in < o I ig. 5 Cell number of undifferentiated and NaBt -differentiated HT-29 cells treated for 48 hr with TNF-a (TNF; 15 ng/ml) or its combinations with rNDO (50 or 200 ^lM), NDGA (25 or 100 ^lM). or BA (50 or 200 ^lM). 4P<0.05 (§ /><0J001) versus inhibitor- and TNF-3r_-untreated controls; n/p<0J05 versus TNF-s treatment. Of- of aboratory "okinetics Available online at www,sciencedirect,com IdllNCt^DIRtOT* ft NCER ELSEVIER Cancer [jcllcri 22U (2005) 4.V-4Ü ww w. c 1 sc vi c r. c onYl cc ale /canl c l TRAIL and docosahexaenoic acid cooperate to induce HT-29 colon cancer cell death Alena Vaculová13, Jiřina HofmanováJ. Ladislav Andcrab, Alois KozubíkJ * bLůbaraiftry nf Ceií Sifittzííittx zná Apcp1ůsisr ítvrtituie af Afaí&ruiar Gčnůiic.i, Vídeň-tká JťJÄJ, i 42 20 Prafaz 4r C&fh Repubíif Rcccivcdci November 21X54: rcccivcd in icviscd fbrm LO December 2004: acccplcd L3 December 2004 Pro caspase-8 Pro caspase'3 R id PARP kDa 55/57 41/43 32 22 113 89 .Awallůbfe online aft www.sclenoedtrKt.ccim ft kcer ELSEVIER Polyunsaturated fatty acids sensitize human colon adeiiocaicuioma HT-29 cells to death receptor-mediated apoptosis Jipina Hornfianovi'V Ak'iia Vacutova. Alois Kozubtk Laboratory ctf £\iriJ*wdrj; ItuffUMr B^JtiWcs. Attttknry tofStiaicB fjfibf C&tk AkjwUk, JfttfJtfj^dJWtrt i"'.*.* ttMnd I) JmZN.M.LLoJ./jL.-d LiL-hj:-LiJ tf Ji i^jLJi UUL4, JLU^Ccd :»* AJyilXU SO 80 70 go 8 *o o 40 20 10 0 ■ floating cell« □ subG0;G1 population X *r 1 i Ii r Iii MS SI m li ti t 1 1 AA ( M) TNF (ngJrnl) I anti-Fas (ngiml) CHX( g/rnl) ?0 2d - 20 30 W.1 U - 2qü 200 - S 5 S 5 B b öqo - 640 - 0'.- 48c o 320 - 16c - iü':' control DHA TNF DHA-TNF 10* DHR-123 (FL1-H) 10'" ---- control - DHA i J 1 ..... anti-Fas if 1 i' — DHA-anti-Fas L 1 1 -? f \ (\ 102 DHR-123 (FL1-H) 10" Fig. 4. Produclion of reaclive oxygen species (ROS) in HT-29 celis non-preireaLed oř prťLrťaLťd for 48 h wkh 20 j.lM of docosahex-aenoic (DHA) acid and ihen incubaLed for 24 h in PUFA-free mťdium without or wilh TNF-ot (30 n^/mL panel A) or anli-Fas (200ng/mL panel B). ROS weTe measured by FCM as d] hydro r ho -damine-123 (DHR-123) fluorescence (FL1-H). The figuře is a repre se ni au" ve re suli of ihree independent experimenls. 80 -70 50 20 10 0 ■ floating cells □ subr wilh TNF-ot or Ian Li-Fas. FxperimenLs with cycloheximide (CHX) added to the cells If or the lasl 27 h are presented in the right parts of panels. The values lare means-hSEM; je = 4; statistical significance: /J<0.05 (~) compared Lo non-treated control; ( + ) compared to TNF-ot or anti-|Fas and/or (X) to A A or DHA as single factors. K Laboratory ^■■of ytokinetic 113 89 40 Fig. 5. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (RARP} to its 89 kDa fragment detected by Western blotting. An eqLEal was verified usinjj fS-actin (40 kDa} antibody. HT-29 cells were nori-pre treated or pre treated for 48 h with 20jiM of docosahexaenoic (DHA) acid and then incubated for 24 h in PUFA-free medium without or with anti-Fas (200 ng/ml}. The figure is a representative result of three independent experiments.