nukleové kyseliny jsou elektroaktivní n A, C a G podléhají redoxním přeměnám na rtuťové elektrodě n G a A jsou oxidovány na uhlíkových elektrodách n cukerné složky NK jsou katalyticky oxidovány na měděných elektrodách Singhal, P.; Kuhr, W. G.: Anal. Chem. 1997, 69, 3552-3557; Anal. Chem. 1997, 69, 4828-4832. A a C jsou redukovány na rtuťové elektrodě G je na rtuťové elektrodě redukován při vysoce negativním potenciálu… …a jeho redukční produkt při elektrooxidaci poskytuje anodický signál G a A poskytují specifické oxidační signály na uhlíkové elektrodě redukční signály C a A na rtuťových elektrodách jsou silně ovlivněny strukturou DNA n souvisí to s lokalizací elektroaktivních center uvnitř dvoušroubovice DNA redukční signály C a A na rtuťových elektrodách jsou silně ovlivněny strukturou DNA oxidační signály na uhlíkových elektrodách jsou méně citlivé ke struktuře DNA n oxidační místa G a A jsou přístupná přes žlábky dvoušroubovice oxidační signály na uhlíkových elektrodách jsou méně citlivé ke struktuře DNA Na rtuťových elektrodách v mírně alkalickém prostředí lze detekovat adsorpčně-desorpční děje (signály) n v závislosti na podmínkách a na struktuře DNA se těchto dějů mohou účastnit jednotlivé složky DNA -dvouřetězcová DNA poskytuje pík 1 v souvislosti s adsorpcí DNA prostřednictvím cukrfosfátové páteře jednořetězcová (denaturovaná) DNA poskytuje pík 1 (cukrfosfátová páteř) a pík 3 související s adsorpcí/desorpcí segmentů DNA prostřednictvím volně přístupných bazí Biomakromolekuly jsou silně adsorbovány na površích elektrod n akumulace na povrchu elektrody Adsorpce DNA na povrchu elektrod je natolik pevná, že vydrží výměnu média Elektrochemická detekce poškození DNA Proč je důležitá analýza poškození DNA? (a detekce DNA poškozujících, „genotoxických“ látek?) DNA: genetický materiál n uchování genetické informace n její předávání potomstvu n její přepis a překlad do struktury bílkovin Poškození DNA: n může vést ke změně genetické informace (mutace) n zamezení její správné exprese n závažné zdravotní důsledky Metody využívané pro detekci poškození DNA • Metody založené na kompletní hydrolýze DNA a následném stanovení modifikovaných bazí pomocí chromatografických metod nebo hmotové spektrometrie Metody využívané pro detekci poškození DNA Metody využívané pro detekci poškození DNA • Metody založené na kompletní hydrolýze DNA a následném stanovení modifikovaných bazí pomocí chromatografických metod nebo hmotové spektrometrie • Sledování změn vlastností „celých“ molekul DNA (elektroforetické a imunochemické metody) Elektrochemické metody lze využít v rámci obou skupin metod: a) elektrochemická detekce ve spojení s HPLC nebo jinou separační metodou b) monitorování změn elektrochemických vlastností „celých“ molekul DNA elektroda s povrchem modifikovaným DNA: biosenzor pro poškozeníDNA/látky poškozující DNA Detekce zlomů v DNA Štěpení na DNA na povrchu elektrod lze elektrochemicky „modulovat“ Štěpení na DNA na povrchu elektrod lze elektrochemicky „modulovat“ Intenzita píku 3 (tj. stupeň poškození DNA, množství vytvořených zlomů) závisí na vloženém potenciálu: Lze citlivě detekovat zlomy v DNA pomocí jiných elektrod než HMDE? Detekce poškození bazí DNA Adukty DNA s elektrochemicky aktivními látkami n poškození DNA vs. značení DNA (vnášení elektroaktivních markerů do molekul DNA) n adukty nukleových kyselin s přechodnými kovy n redox přechody kovových iontů n katalytické vylučování vodíku na rtuťových a amalgamových elektrodách cisplatina cisplatina cisplatina cisplatina Komplexy OsO[4] jako elektroaktivní markery DNA Obstojí elektrochemická detekce poškození DNA ve srovnání s jinými metodami? srovnání citlivostí: n hmotová spektroskopie: 20-50 femtomolů TT dimeru/1 poškození na 10^5 bazí (I.D. Podmore, et al. Photochem Photobiol 1996, 64, 310-5). n ELISA: okolo 1 fmol TT dimeru (M.S. Cooke, I.D. et al, Journal of Immunological Methods 2003, 280, 125-133) n HPLC: po hydrolýze DNA – obvykle uváděná citlivost 1 poškozená baze mezi 10^7 nepoškozených n 32P postlabeling: jednotky femtomolů aduktu ^n stanovení ssb (nebo poškozených bazí po jejich enzymatickém převedení na ssb) elektrochemicky na rtuťové elektrodě: 1 zlom na 2x10^5 nukleotidů; vzhledem k použitému množství DNA (50 ng 3 kb plasmidu) jde o méně než 1 fmol produktu poškození Obstojí elektrochemická detekce poškození DNA ve srovnání s jinými metodami? další výhody: n rychlost analýzy n relativně nenákladné zařízení n snadno kvantifikovatelná data Hybridizace DNA Komplexy OsO[4] jako elektroaktivní značky při analýze hybridizace DNA • Os-bipy značené signální sondy • Os-bipy značené signální sondy pro elektrochemické hybridizační senzory n elektrochemické signály DNA-Os,L obsahující jiné ligandy než bipy: n rozdílů v potenciálech lze využít při hybridizaci DNA: analýza více sekvencí současně Pomocí Os,L lze v principu značit jakoukoli signální sondu Biokatalytická (enzymová) amplifikace signálu n Přímá hybridizační analýza s genomovou DNA? ^n to vyžaduje (v případě jednokopiových sekvencí) rozlišit a úsek DNA dlouhý několik málo desítek nukleotidů mezi třemi milardami bp (v lidském genomu), tj. cca 1:10^8 n v biologické matrici je to velmi obtížné n Amplifikace DNA pomocí PCR n klíčová technika současné molekulární biologie analýza exprese genů Analýza exprese genů Elektrochemické stanovení délky repetitivní sekvence v DNA (počtu opakování základní jednotky) Detekce bodových mutací a jednonukleotidových polymorfismů n „DNA minisequencing“ závěrem… budoucnost… Poděkování Poděkování Děkuji za pozornost