Masarykova univerzita v Brně
Přírodovědecká fakulta
Katedra mikrobiologie
Laboratorní cvičení z fyziologie bakterií
Řešitelé: Horáková Dana, Němec Miroslav
Technická spolupráce: Szostková Monika
Podporováno Fondem rozvoje vysokých škol MŠMT č. 508, F4, 2003
2
Obsah
1 Růst a množení bakteriálních buněk.............................................................................. 4
1.1 Plotnová metoda............................................................................................................... 4
1.2 Bioscreen C - stanovení pH optima pro růst buněk ......................................................... 5
2 Bakteriální biomasa ......................................................................................................... 8
2.1 Stanovení bílkovin metodou podle Bradfordové ............................................................. 8
2.2 Stanovení bakteriální sušiny........................................................................................... 10
3 Půdní biomasa ................................................................................................................ 12
3.1 Stanovení půdní biomasy metodou ninhydrin-reaktivního dusíku ................................ 12
3.2 Fumigační extrakční metoda pro stanovení fosforu půdní mikrobiální biomasy........... 14
3.3 Stanovení ATP ............................................................................................................... 15
3.4 Stanovení půdní respirace .............................................................................................. 17
3.5 Stimulace půdní respirace přídavkem lehce využitelného substrátu.............................. 19
4 Studium bakteriofága .................................................................................................... 21
4.1 Stanovení jednostupňové růstové křivky fága metodou dvouvrstevného agaru............ 21
4.2 Stanovení průměrného fágového výnosu metodou single-burst experimentu ............... 23
4.3 Sledování lyze hostitelských buněk v adsorpční směsi.................................................. 24
4.4 Příprava fágového lyzátu  812...................................................................................... 25
5 Indukce lyze .................................................................................................................... 28
5.1 Optimalizace dávky UV záření metodou titrace uvolněných virionů............................ 28
5.2 Průběžné sledování lyze ozářených buněk lyzogena ..................................................... 29
6 Dehydrogenázová aktivita bakteriálních buněk.......................................................... 31
6.1 Stanovení dehydrogenáz s využitím umělého akceptoru vodíku a elektronů ................ 31
6.2 Stanovení aktivity malát dehydrogenázy ....................................................................... 33
7 Inducibilní enzymy u baktérií....................................................................................... 35
7.1 Kinetika indukce -galaktosidázy.................................................................................. 35
7.2 Změny v indukci -galaktosidázy v přítomnosti virulentního bakteriofága.................. 36
8 Fosfatázová aktivita ....................................................................................................... 39
8.1 Stanovení fosfatázové aktivity nativních bakteriálních buněk....................................... 40
8.2 Stanovení fosfatázové aktivity HEP............................................................................... 41
8.3 Stanovení vlivu teploty na fosfatázovou aktivitu buněk S. aureus SA 812 ................... 42
9 Oxidační aktivita bakteriálních buněk......................................................................... 44
1.1 Vliv složení kultivačního média na oxidační aktivitu bakterií....................................... 44
9.2 Stanovení vlivu teploty na oxidační aktivitu kvasinek................................................... 46
10 Lipolytická aktivita ........................................................................................................ 48
10.1 Izolace a aktivita lipáz u buněk S.aureus ..................................................................... 48
10.2 Stanovení exolipáz s využitím chromogenního substrátu............................................ 50
11 Enzymatická aktivita půdního vzorku......................................................................... 52
11.1 Stanovení proteázové aktivity...................................................................................... 52
11.2 Stanovení ureázové aktivity I....................................................................................... 54
11.3 Stanovení ureázové aktivity II...................................................................................... 55
11.4 Stanovení celulázové aktivity I .................................................................................... 57
11.5 Stanovení celulázové aktivity II................................................................................... 58
12 Stanovení biodegradability ropných látek................................................................... 60
3
12.1 Stanovení biologické rozložitelnosti hexadekanu s využitím metody Oxi-Top .......... 60
12.2 Využití mikroorganizmů k degradaci kontaminovaných půdních vzorků................... 61
13 Stanovení akutní toxicity ............................................................................................... 63
13.1 Stanovení změn akutní toxicity půdního výluhu v průběhu biodegradace ................. 63
4
1 Růst a množení bakteriálních buněk
Úvod
Množení bakterií sledujeme zpravidla podle počtu bakteriálních buněk, který lze stanovit
přímo, pomocí upravené počítací komůrky nebo nepřímo nefelometricky, výsevem na
agarové plotny s následným počítáním vyrostlých kolonií nebo užitím vhodných
fyziologických metod. Různé typy metod stanovení počtu bakteriálních buněk mají svoje
přednosti, ale na druhé straně i nevýhody. Výhodou nefelometrického stanovení, zejména
s využitím automatických systémů, je relativně rychlé a technicky málo náročné vyhodnocení,
poskytující získání poměrně přesných hodnot. Na druhé straně je však tato metoda zatížena
chybou vyplývající ze skutečnosti, že na zákalu buněčné suspenze se podílejí i mrtvé buňky.
Tento nedostatek může být do značné míry odstraněn stanovením počtu životaschopných
bakterií plotnovou metodou. Nevýhodou plotnové metody stanovení počtu buněk je však její
časová a materiálová náročnost.
1.1 Plotnová metoda
Princip metody
Životaschopné mikrobiální buňky na vhodných ztužených kultivačních médiích vytvářejí
kolonie, které jsou tvořeny potomstvem jedné mikrobiální buňky. Výsevem buněk na živné
médium v daných časových intervalech lze posouditzměnu v počtu buněk v tekutém médiu
v průběhu kultivace.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy :
Salmonella typhimurium LB 5000
ˇ Chemikálie a roztoky:
tekuté LB-médium , LB-agar
ˇ Přístroje:
vodní lázeň s třepačkou, termostat
Postup
Celý pracovní postup provádíme přísně sterilně ve flow-boxu. Do 10 ml LB-média
naočkujeme kličku bakteriální kultury uchovávané na šikmém LB-agaru. Kultivujeme
staticky 12 hodin při 37 °C. 2 ml narostlého inokula očkujeme do 100 ml LB-média (výsledná
koncentrace buněk cca 5.107
CFU /ml) a kultivujeme ve vodní lázni při 37 °C (150 kyvů/min.,
amplituda 7). Odběry vzorků provádíme v časových intervalech 0; 30; 60; 90; 120; 150; 180;
210; 240; 270; 300 minut. Sterilně odebraný vzorek (cca 2 ml) ředíme v tekutém LB-mediu.
Pro časové intervaly 0-150 minut doporučujeme ředění 10-4
, 10-5
a 10-6
, pro ostatní časové
intervaly ředění 10-5
, 10-6
, 10-7
. Z jednotlivých ředění vyséváme po 0,1 ml na Petriho misky
s LB-agarem a rozetřeme po povrchu agaru sterilní hokejkou. Pro každé ředění volíme
nejméně dvě opakování. Naočkované misky kultivujeme v termostatu při 37°C obrácené
dnem vzhůru. Po 24 hodinách kultivace odečteme vytvořené kolonie a provedeme hodnocení
růstu.
5
Vyhodnocení a závěr
Stanovení počtu buněk v bakteriální kultuře
Průměrný počet buněk ve vzorku odebraném v čase t:
CFU/ml = počet kolonií na misce × 1/použité ředění × 10
Sestrojení růstové křivky
Grafická závislost log CFU/ml na době kultivace buněk (t = 0-300 min.)
Růstové parametry
Výpočet doby lagu (L), průměrné konstanty rychlosti růstu (k), průměrné generační doby (g),
specifické růstové rychlosti ()
1.2 Bioscreen C - stanovení pH optima pro růst buněk
Princip metody
Plně automatické zařízení Bioscreen C umožňuje provádět velké množství testů v několika
dnech či týdnech. V jednom pokusu lze sledovat růst buněk až ve 200 vzorcích (na dvou
inkubačních destičkách). Testy je možné provést 10 až 20-krát rychleji než s použitím
běžných manuálních technik. Zařízení je schopno měřit pomocí speciálních filtrů zákal
mikrobiální kultury v tekutém růstovém médiu. Inkubační teplotu lze nastavit od 1 do 60°C.
Systém Bioscreen C se skládá z inkubační a měřící jednotky (Obr. 1) a z počítače, ve kterém
je instalován odpovídající software sloužící k zaznamenávání růstových křivek a jejich
vyhodnocení. Inkubace, míchání a kinetická měření probíhají automaticky podle nastavených
parametrů daného pokusu. Zařízení Bioscreen C lze využít pro běžné sledování růstu buněk,
sledování vlivu antibiotik, farmak nebo růstových inhibitorů na množící se buňky, stanovení
MIC, vývoj nových růstových medií, vlivu pH na růst buněk, sledování průběhu lyze buněk
apod.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Pseudomonas pictorum CCM 284
ˇ Chemikálie a roztoky:
masopeptonový bujon č.1 (MPB1)o různé hodnotě pH; masopeptonový agar č. 1 ( MPA1)
ˇ Přístroje :
Bioscreen C (software BioLink v DOS, export dat do MS EXCEL)
http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm
Postup
Celý pracovní postup provádíme přísně sterilně ve flow-boxu. Inokulum získáme
naočkováním 20 ml MPB 1 přibližně 108
CFU/ml Pseudomonas pictorum ze šikmého agaru
(MPA 1). Buňky inkubujeme 24 h v termoboxu za intenzivního třepání (128 kyvů/min.) při
teplotě 26 °C. Sterilní inkubační destička přístroje obsahuje 100 jamek (Obr. 2). Do 5 jamek
sterilně pipetujeme 330 l MPB 1 o odpovídající hodnotě pH (použijeme automatickou
pipetu). Např. jamky 1 až 5 plníme bujonem o hodnotě pH 5,5; jamky 6 až 10 ­ pH 6,5;
jamky 11 až 15 ­ pH 7,0; jamky 16 až 20 ­ pH 7,5. Do všech jamek přidáme 10 l čerstvého
inokula. Kultivaci provádíme při teplotě 26 °C po dobu 48 hodin. Měření zákalu při vlnové
délce  =600 nm probíhá každé 2 hodiny podle nastavení parametrů na Bioscreen C.
6
Obr. 1 Zařízení Bioscreen C
Nastavení parametrů přístroje (provádíme podle návodu za přítomnosti obsluhujícího
personálu):
Otevřeme program v systému MS DOS. Nastavíme nový program podle návodu.Vyplníme
kolonku pro bližší popis testu. Po zobrazení destičky zvolíme šipkami a mezerníkem ,,Simple
editor" a ,,Grafical well map". Zadáme konečný objem v jamce, zadáme jednotky, ve kterých
bude provedeno měření, zvolíme počet opakování pro daný vzorek a popis vzorku. Zvolíme
počet vzorků. Zadáme parametry měření (pomocí všech 4 šipek a potvrzujeme
Enter).Stisknutím tlačítek Ctrl + Enter odsouhlasíme parametry, kurzor umístíme na
Measurement a zahájíme měření stisknutím tlačítka Enter.
7
Obr. 2 Inkubační destičky
Vyhodnocení a závěr
Po zpracování výsledků softwarem Bioscreen C vytisknout hodnoty OD600 do tabulky.
Vypočítat průměrné hodnoty zákalu z 5 opakování a sestrojit růstovou křivku. Z průměrných
hodnot střední generační doby pro kultivační média o různé hodnotě pH (výpočet bude
proveden automaticky softwarem po převedení do MS Excel ) sestrojit graf závislosti
průměrné generační doby na zvolené hodnotě pH kultivačního média.
Literatura
http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm
8
2 Bakteriální biomasa
2.1 Stanovení bílkovin metodou podle Bradfordové
Úvod
Při některých pokusech, zaměřených zejména na studium enzymatické aktivity buněk, je
nutné vztahovat naměřené hodnoty na konstantní jednotku biomasy. Tímto přepočtem
obdržíme hodnoty, které lze mezi sebou srovnávat, třebaže jsou experimenty prováděny
v různých časových odstupech nebo na různých mikroorganizmech. V běžné laboratorní praxi
je enzymatická aktivita nejčastěji vztahována na sušinu, bílkovinu, dusík apod. Pro stanovení
koncentrace bílkovin může být využita celá řada metod, lišících se rozsahem stanovení a
dobou nutnou k jejich provedení. Mezi nejznámější používané metody stanovení bílkovin
v biologickém materiálu patří např. Biuretová metoda, Folinova metoda, Lowryho metoda,
metoda dle Bradfordové, fluorescence, polarografie a další. Mezi velmi přesné metody
stanovení bílkovin patří metoda dle Bradfordové, která je standardizovaná v programu
spektrofotometru Spectronic GenesysTM
5.
Princip metody
Při vazbě Coomassie Brilliant Blue G250 na bílkovinu dochází k posunu absopčního maxima
z 464 nm na 595 nm. Vzrůst absorbance při 595 nm může být použit jako měřítko
koncentrace bílkovin. K posunu absorpčního maxima dochází velmi rychle (2-5 min) a
vybarvení je stabilní nejméně jednu hodinu. Metoda je vhodná pro všechny proteiny, ačkoliv
počet vazeb s barvivem může být proměnlivý v závislosti na obsahu basických aminokyselin
v bílkovině. Je proto důležité, aby standardní roztok bílkoviny měl obdobné složení jako
testovaný vzorek. Hodnoty absorbance může zvyšovat přítomnost detergentů ve vzorku. Pro
každé stanovení je nutné sestrojení kalibrační přímky.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Micrococcus luteus, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis
(ze sbírky ústavu)
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1; pufr fosfátový (0,05M;pH = 7,2);zásobní roztok lidského albuminu (0,1 g v 10 ml
fosfátového pufru); činidlo Coomassie Brilliant Blue G250
ˇ Přístroje:
chlazená centrifuga; fotometr Spekol 11; spektrofotometr Spectronic GenesysTM
5
9
Postup
Příprava vzorku.100 ml MPB 1 v promývací láhvi naočkujeme 1 kličkou zásobní kultury ze
šikmého agaru. Kultivujeme 24 h při 30°C za intenzivní aerace. Takto připravené kultury
různých mikroorganizmů centrifugujeme v chlazené centrifuze při 6000 ot.min-1
(teplota
+4°C) po dobu 20 min. Supernatant opatrně slijeme, buněčný sediment resuspendujeme ve
fosfátovém pufru a znovu centrifugujeme v chlazené centrifuze. Tento proces opakujeme
nejméně dvakrát (tzv. promývání buněk), abychom z povrchu buněk odstranili balastní
organické látky. Bakteriální sediment ředíme fosfátovým pufrem tak, aby zákal suspenze při
 = 600 nm odpovídal cca 80%. Přesnou hodnotu zákalu suspenze zaznamenáme. Sušinu
bakteriální suspenze stanovíme podle postupu v kapitole 2.2.
Příprava standardů. Ředěním zásobního roztoku lidského albuminu (0,1 g /ml)destilovanou
vodou připravíme 5 standardních koncentrací pro sestrojení standardní přímky : 200; 400;
600; 800; 1000 g albuminu /ml .
Měření (program Bradford-standard, Genesys)
Sestrojení standardní přímky.
K 0,1 ml standardu v měřící kyvetě přidáme 5 ml činidla Coomassie Brilliant Blue G250.
Promícháme a měříme při vlnové délce 595 nm.
Posice v zásobníku:
Pozice 1 0,1 ml dest. vody + 5 ml činidla (Blank )
Pozice 2 0,1 ml dest .vody + 5 ml činidla (0 g/ml)
Pozice 3 0,1 ml 200 g/ml + 5 ml činidla (200 g/ml)
Pozice 4 0,1 ml 400 g/ml + 5 ml činidla (400 g/ml)
Pozice 5 0,1 ml 600 g/ml + 5 ml činidla (600 g/ml)
Pozice 6 0,1 ml 800 g/ml + 5 ml činidla (800 g/ml)
Pozice 7 0,1 ml 1000 g/ml + 5 ml činidla (1000 g/ml)
Stanovení koncentrace bílkovin ve vzorku. K 0,1 ml vzorku přidáme 5 ml činidla,
promícháme a měříme. Vzorek vkládáme na pozici 2. Na pozici 1 ponecháme kyvetu ,,Blank"
z předchozího měření.
Vyhodnocení a závěr
Porovnat studované kmeny na základě obsahu bílkovin vztažených na hmotnost sušiny
vzorků.
Literatura
Holme D.J.,Peck,H.(1994). Analytical biochemistry.J.Wiley and Sons, Inc., New York
Bradford,M.(1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72:248-
254.
10
2.2 Stanovení bakteriální sušiny
Úvod
Při některých pokusech, zaměřených zejména na studium enzymatické aktivity buněk, je
nutné vztahovat naměřené hodnoty na určitou jednotku biomasy. Tímto přepočtem obdržíme
hodnoty, které lze mezi sebou srovnávat, třebaže jsou experimenty prováděny v různých
časových odstupech nebo na různých mikroorganizmech. V běžné laboratorní praxi je
enzymatická aktivita nejčastěji vztahována na sušinu, bílkovinu, dusík apod. Stanovení
bakteriální sušiny patří k nejjednodušším metodám umožňujícím porovnání metabolické
aktivity mikrobiálních buněk. Tato metoda je však nevhodná pro mikroorganismy s vysokým
obsahem lipidů, např.pro některé kvasinky.
Princip metody
Sušení biologického materiálu za zvýšené teploty
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Micrococcus luteus, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis
(ze sbírky ústavu)
ˇ Materiál:
vysušené váženky s víčkem uložené v exikátoru
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1; pufr fosfátový ( 0,05M; pH = 7,2);
ˇ Přístroje:
chlazená centrifuga; fotometr Spekol 11;analytické váhy s přesností 0,1 mg; sušárna
Postup
Příprava vzorku.100 ml MPB1 v promývací láhvi naočkujeme 1 kličkou zásobní kultury ze
šikmého agaru. Kultivujeme 24 h při 30°C za intenzivní aerace.Takto připravené kultury
různých mikroorganizmů centrifugujeme v chlazené centrifuze při 6000 ot.min-1
(teplota
+4°C) po dobu 20 min. Supernatant opatrně slijeme, buněčný sediment resuspendujeme ve
fosfátovém pufru a znovu centrifugujeme v chlazené centrifuze. Proces promývání buněk
opakujeme nejméně dvakrát. Bakteriální sediment ředíme fosfátovým pufrem tak, aby zákal
suspenze při  = 600 nm odpovídal hodnotám cca 80% , 85% a 90%. Přesné hodnoty zákalu
buněčné suspenze zaznamenáme. Do připravených vysušených, označených a zvážených
váženek pipetujeme po 2 ml buněčné suspenze o odpovídající hustotě ve dvou opakováních.
Do dvou váženek pipetujeme pouze fosfátový pufr. Váženky s odklopenými víčky umístíme
do sušárny a sušíme při 106°C. Po 24 h váženky vyjmeme, uzavřeme víčko a necháme
chladnout při pokojové teplotě v exikátoru. Po zvážení provedeme výpočet podle vztahu:
S = (Vs-V)/2 - (Vp-V)/2 (mg/ml),
kde
Vs je hmotnost váženky s 2 ml bakteriální suspenze
V je hmotnost použité váženky
Vp je hmotnost váženky s 2 ml fosfátového pufru
S je hmotnost bakteriální sušiny v mg/ml bakteriální suspenze
11
Vyhodnocení a závěr
Sestrojíme tabulku získaných hodnot.V závěru se zaměříme na odpověď, zda existuje lineární
vztah mezi zákalem bakteriální suspenze, koncentrací bílkovin (viz 2.1.) a sušinou.
Literatura
Hoďák,K.,Němec,M.(1985). Praktikum z fyziologie baktérií. Skriptum UJEP Brno
12
3 Půdní biomasa
3.1 Stanovení půdní biomasy metodou ninhydrin-reaktivního dusíku
Úvod
Mikrobiální biomasa může být definována jako část organické hmoty v půdě, která je tvořena
živými mikroorganizmy menšími než 5-10 m3
. Nejčastěji bývá vyjádřena v miligramech
uhlíku obsaženém v jednom kilogramu půdy.Půdní biomasa hraje významnou roli při tvorbě
struktury půdy a její stabilitě. Je rovněž významným ekologickým markerem. Ke stanovení
půdní biomasy je využívána celá řada metod. Některé jsou založeny na barvení a počítání
mikrobiálních buněk, jiné na fyziologických parametrech jako je ATP, respirace a výdej tepla
nebo na aplikaci extrakčních technik. Při stanovení biomasy v půdě může být prováděno
jednak z hlediska sledování indikátoru mikrobiální biomasy- např. produktu mikrobiálního
metabolizmu, který může být kvantitativně extrahován z půdy, jednak z hlediska
kvantitativního stanovení celkového dusíku, organického uhlíku, fosforu a dalších složek
extraktu získaného z půdního prostředí po usmrcení a lyzi mikrobiálních buněk, jejichž
cytoplazma se uvolňuje do prostředí. Z prostředí jsou uvolněné složky biomasy extrahovány.
V extraktu lze rovněž stanovit různými kalibračními metodami celkový dusík, anorganický a
organický dusík a ninhydrin-reaktivní dusík.
Princip metody
Ninhydrin tvoří purpurově zbarvený komplex s molekulami obsahujícími -aminonodusík,
podobně jako s amoniem a jinými sloučeninami s volnou -aminoskupinou (aminokyseliny,
peptidy, proteiny). K vytvoření barevné reakce s amoniem je nutná přítomnost redukovaného
ninhydrinu. Množství ninhydrin-reaktivních sloučenin uvolněných z mikrobiální biomasy
působením par CHCl3 a následně extrahovaných 0,5M K2SO4 je přímo úměrné koncentraci
mikrobiální biomasy v půdě.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
vzorek půdy, suchá hmotnost je 50 g
ˇ Chemikálie a roztoky:
ninhydrin; CHCl3 (obě látky jsou toxické!); 0,5M K2SO4; pufr citrátový; sorbent vody; 95%
etanol s vodou (1:1), standard ke stanovení ninhydrin-reaktivního dusíku
ˇ Zařízení:
vakuová sušička,vývěva, třepačka, mraznička, papírové filtry (Whatman 42), spektrofotometr
Postup
Všechny práce provádíme v digestoři s odtahem!
Vzorek vlhké půdy o hmotnosti sušiny 50 g rozvážíme po 25 g .
Kontrolní vzorek půdy v 250 ml baňce extrahujeme 100 ml 0,5M K2SO4 (poměr extraktantu
k hmotnosti vzorku půdy je 4:1 v/w) na třepačce (200 kyvů/min). Po 30-ti minutové extrakci
vzorek filtrujeme přes papírový filtr (W42).
13
Další vzorek půdy navážíme do speciální skleněné ampulky o objemu 50 ml a umístíme do
sušičky, která je obložena mokrou buničinou. Do prostoru sušičky umístíme lahvičku se
sorbentem vody a kádinku obsahující 25 ml CHCl3 se skleněnými kuličkami. Sušičku
napojíme na vakuovou pumpu, kterou vypneme cca po 2 min. silného varu CHCl3 . Potom
inkubujeme uzavřenou sušičku v temnu při pokojové teplotě po dobu 24 h. Po fumigaci je
prostor zavzdušněn a provedeno několikanásobné odsátí zbylých par CHCl3. Vzorek půdy je
přenesen do 250 skleněné baňky a podroben extrakci 0,5 M K2SO4 a dalšímu zpracování
(stejně jako u kontrolního vzorku). Oba extrakty jsou uchovávány při teplotě -15°C.
Do testovací ampulky o objemu 20 ml přidáme tzv. standardní roztoky ke stanovení
ninhydrin-reaktivního dusíku, K2SO4- půdní extrakt nebo kontrolní vzorek (0,6 ml). Poté
přidáme citrátový pufr (1,4 ml). Po kapkách přidáváme 1 ml ninhydrinu a promícháváme.
Nádobka musí být uzavřena hliníkovou zátkou. Testovací nádobku vaříme 25 minut ve vodní
lázni. Za tuto dobu by mělo dojít k rozpuštění všech sraženin vzniklých po přidání reagencií.
Poté přidáme 4 ml směsi etanol:voda, opět promícháme a měříme zbarvení při vlnové délce
570 nm.
Vyhodnocení a závěr
ˇ Výpočet extrahovaného ninhydrin-reaktivního dusíku (Nnin)
Nnin(g.g-1
půdy) = (S ­ B) : L × N × (K:DW + W) × 1000
S.....absorbance vzorku
B.....absorbance blanku
L.....molární absorpční koeficient leucinu
N....14 (molekulová hmotnost dusíku)
K....objem extraktu
DW..hmotnost sušiny vzorku v gramech
W....vlhkost půdy (%hmotnosti sušiny:100)
ˇ Výpočet ninhydrin-reaktivního dusíku v mikrobiální biomase
Bnin = (Nnin extrahovaný z fumigované půdy) ­ (Nnin extrahovaný z kontrolního vzorku)
ˇ Výpočet uhlíku v mikrobiální biomase
C = Bnin × 20,6
Pozn.: Uvedený faktor byl vypočten ze vztahu obsahu uhlíku v mikrobiální biomase a hodnot Bnin u 12 vzorků
zpracovaných výše uvedenou fumigační extrakční metodou.
Literatura
Brookes, P.C., Landman, A., Puden, G., Jenkinson D.S. (1985). Chloroform fumigation
and the release of soil nitrogen: a rapid direct extraction method to measure microbial
biomass nitrogen in soil. Soil Biol. Biochem 17: 837-842.
Vance, E.D., Brookes, P.C., Jenkinson D.S. (1987). An extraction method for measuring
soil microbial biomass C. Soil Biol. Biochem. 19: 703-707.
Amato, M., Ladd, J.N. (1988). Assay for microbial biomass based on ninhydrin-reactive
nitrogen in extracts of fumigated soil. Soil Biol. Biochem. 20: 107-114.
Joergensen, R.G., Brookes P.C., Jenkinson, D.S. (1990). Survival of the soil microbial
biomass at elevated temperatures. Soil Biol. Biochem. 22: 1129-1136.
14
3.2 Fumigační extrakční metoda pro stanovení fosforu půdní
mikrobiální biomasy
Úvod
Viz kapitola 3.1.
Princip metody
K výpočtu obsahu fosforu v půdní mikrobiální biomase používáme rozdílu mezi množstvím
fosfátu stanoveného ve fumigované a nefumigované půdě (Fumigace půdy je popsána
v kapitole 3.1). Vzhledem k tomu, že některé fosfáty zůstávají po fumigaci sorbovány na
koloidní půdní částice, je nutné provádět korekci naměřených hodnot.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
vzorek půdy (s malým obsahem jílu), suchá hmotnost 30g
ˇ Chemikálie a roztoky:
CHCl3 (látka je toxická!); roztok 0,5M NaHCO3 ; pufr citrátový; sorbent vody; 95% etanol
s vodou (1:1); roztok KH2PO4 (250 mg fosforu .l-1
); činidlo A ; činidlo B; 4,5 M H2SO4; 10M
NaOH
ˇ Zařízení:
vakuová sušička,vývěva, třepačka, mraznička, papírové filtry (Schleicher a Schuell 595 ),
spektrofotometr, centrifuga
Postup
Fumigace a extrakce. Vlhkou půdu (30 g suché hmotnosti) rozdělíme do tří vzorků po 10 g
suché hmotnosti.
První vzorek bude sloužit jako nefumigovaná kontrola. Tento vzorek umístíme do
centrifugační zkumavky o objemu 250 ml a extrahujeme 200 ml roztoku 0,5M NaHCO3 po
dobu 30 min za intenzivního třepání (150 kyvů . min-1
). Výslednou suspenzi centrifugujeme
(2000 g) a pak filtrujeme přes papírový filtr (Schleicher a Schuell 595 ).
Druhý vzorek (druhá nefumigovaná kontrola výtěžku) umístíme do centrifugační zkumavky o
objemu 250 ml a extrahujeme 200 ml roztoku 0,5M NaHCO3 s 1 ml roztoku KH2PO4 , čímž
dosáhneme ve vzorku půdy zvýšenou koncentraci fosforu (o 25 g.g-1
). Podobně jako
v prvním případě připravíme pro další měření filtrát vzorku.
Třetí vzorek fumigujeme podle postupu uvedeného v kapitole 3.1.. Po fumigaci vzorek
zpracujeme jako nefumigovanou kontrolu bez přídavku fosforu.
Měření fosfátu. 75 ml půdního extraktu v baňce o objemu 250 ml okyselíme přídavkem 5 ml
4,5M H2SO4 a necháme stát 24 h při +4 °C. Pomocí papírku stanovíme hodnotu pH extraktu.
Při hodnotě přesahující pH=1,5 je nutné extrakt dále okyselit 4,5 M H2SO4.
Extrakt filtrujeme přes papírový filtr bezprostředně před stanovením anorganického
fosforu. Zákal odstraníme centrifugací vzorku. Odebereme 5 ml filtrátu do odměrné baňky o
objemu 25 ml. Přidáme 0,4 ml činidla A a 0,8 ml činidla B a doplníme do 25 ml destilovanou
vodou. Promícháme a necháme stát cca 10 min při pokojové teplotě. Vytvořené modré
zbarvení je stabilní po dobu 24 h. Zbarvení měříme při vlnové délce 882 nm na kalibrovaném
fotometru.Vzorek porovnáme s kontrolou.
15
Vyhodnocení a závěr
Výpočet fosforu v mikrobiální biomase (P) provedeme podle následujícího vztahu:
P = EP/kEP,
EP = (F-U) : (Z-U),
kde EP je extrahovaný fosfát, F je PO4-P extrahovaný z fumigované půdy, U je PO4-P
extrahovaný z nefumigované půdy, Z je PO4-P extrahovaný z nefumigované půdy
s přídavkem fosforu a kEP = 0,40 (konstanta). Kalibrace je provedena přidáním známého
množství mikroorganizmů do půdy, fumigací a měřením poměru extrahovaného
mikrobiálního P.
Literatura
Joergensen, R.G. (1995). The fumigation extraction method for microbial biomass
phosphorus. In: Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Eds. Alef, K.,
Nannipieri, P., Academic Press London, UK. 394-396.
Brookes, P.C., Powlson, D.S., Jenkinson, D.S. (1982). Measurement of microbial biomass
phosphorus in soil. Soil. Biol. Biochem. 14: 319-329.
3.3 Stanovení ATP
Princip metody
ATP se vyskytuje ve všech organizmech a je možné je využít pro stanovení aktivity
mikroorganizmů.Tato látka je přítomná v živých organizmech, ale ne v organizmech mrtvých
nebo v neživé hmotě. ATP může být extrahován jak z buněk, tak i půdy nebo vody a jeho
obsah se stanoví systémem, luciferin-luciferáza. Obsah ATP může být, za určitých podmínek,
využit jako parametr mikrobiální biomasy v přirozených vzorcích ­ půda nebo i voda.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
vzorky půdy
ˇ Chemikálie a roztoky :
Pufr EDTA-magnesium arzenátový, extraktant TCA-fosfát-paraquant, směs luciferin-
luciferáza (Sigma), standardní roztok ATP 10-3
M v EDTA-magnesium arsenátovém pufru
ˇ Přístroje :
Luminometr m90a, pH metr, centrifuga, ultrazvukový dezintegrátor Bandelin UW 200
Postup
Příprava vzorku : Vzorek vysušené půdy protlačíme přes síto o velikosti ok 2 mm. Do
polypropylenové zkumavky (objem 50 ml) odvážíme 2,5 g homogenizované půdy a vložíme
do ledové lázně. Do každé zkumavky přidáme 25 ml studeného extraktantu TCA-fosfát-
paraquant. Extrakce se provede v ultrazvukovém dezintegrátoru (100W, 2 min, v ledové
lázni). Po ozvučení zkumavky vložíme zpět do ledové vodní lázně a po 20 minutách stání
v ledové lázni filtrujeme (filtrační papír Whatman No.4). Filtrát dále centrifugujeme (při
10000 rpm min-1
, 0o
C) po dobu 15 min. Supernatant se potom použije ke stanovení ATP. ATP
stanovujeme ihned po centrifugaci nebo vzorek rychle zmrazíme na -15 o
C. Ve zmraženém
stavu je stabilní po dobu 4 týdnů.
16
Stanovení ATP : V polypropylenové zkumavce (objem 20 ml) smícháme 5 ml EDTA- Mg
arzenátového pufru s 50 l supernatantu a vložíme do ledové lázně. Do měřící kyvety
napipetujeme 50 l směsi luciferin-luciferáza a umístíme do inkubačního bloku Luminometru
vytemperovaného na teplotu +25o
C a po 10s změříme "relativní světelné jednotky" (RLU).
Potom přidáme 250 l připraveného supernatantu a po 10s stanovíme RLU. Měření
opakujeme třikrát v jednominutových intervalech. Jako blank slouží kyveta obsahující 50 l
EDTA- Mg arzenátového pufru a 250 l naředěného supernatantu. Měření RLU je prováděno
stejným způsoben jako při měření vzorku.
Stanovení ATPs : V polypropylenové zkumavce smícháme 5 ml EDTA- Mg arsenátového
pufru + 50 l supernatantu + 50 l ATP a vložíme do ledové lázně. Do měřící kyvety
napipetujeme 50 l směsi luciferin-luciferáza a umístíme do inkubačního bloku Luminometru
vytemperovaného na teplotu +25o
C a po 10s změříme RLU. Potom přidáme 250 l
připraveného supernatantu s ATP a po 10s stanovíme RLU. Měření opakujeme třikrát
v jednominutových intervalech. Jako blank slouží kyveta obsahující 50 l EDTA- Mg
arsenatového pufru +250 l naředěného supernatantu+ 50 l ATP. Měření RLU je prováděno
stejným způsobem jako při měření vzorku.
Kalibrační křivka : Pro sestrojení kalibrační křivky použijeme standardních roztoků ATP
připravených ředěním ATP v EDTA- Mg arzenátovém pufru v rozsahu 10-5
až 10-8
M (pro
sestrojení kalibrační křivky použijeme nejméně 5 koncentrací ATP, přičemž každá
koncentrace je ve třech variantách). Měření je prováděno stejným způsobem jako měření
vzorku půdy.
Vyhodnocení a závěr
Výpočet : Koncentraci ATP ve vzorku půdy stanovíme odvozením z kalibrační křivky a
vyjádříme jako množství ATP v g na g vysušené zeminy.
Obsah ATP v půdě je možné stanovit i výpočtem s využitím vnitřního standardu
A × ATPs × 40
ATP (g . g ­
1 dwt ) = ------------------ , kde
B ­ A
A ­ RLU/10 půdního extraktu,
B ­ RLU/10 půdního extraktu s přidaným vnitřním standardem ATP (v g)
ATPs ­ přidané ATP k půdnímu vzorku jako vnitřní standard (v g)
dwt ­ suchá hmotnost 1 g mokré zeminy
40 ­ ředící faktor.
Literatura :
Martens, R. (2001). Estimation of ATP in soil : extraction methods and calculation
extraxtion efficiency. Soil.Biol.Biochem., 33 : 973-982
17
3.4 Stanovení půdní respirace
Úvod
Půdní respirace je charakterizována spotřebou kyslíku (O2) nebo uvolňováním oxidu
uhličitého (CO2) v důsledku její mikrobiální aktivity. Zahrnuje výměnu plynů z procesů
aerobního a anaerobního metabolizmu. Půdní respirace nás informuje o degradaci biologicky
dostupných organických látek a o průběhu jejich mineralizace. Za normálních podmínek
existuje ekologická rovnováha mezi půdními organizmy a jejich aktivitou. Jde o tzv. bazální
respiraci půdy. Jestliže je tato rovnováha porušena (např. přídavkem degradovatelné
organické sloučeniny), dochází k výraznému zvýšení růstu mikroorganizmů a jejich
mineralizační aktivity, což se projeví změnou půdní respirace. Půdní respirace může
vypovídat o biologické degradaci nejrůznějších látek v půdě, toxicitě některých polutantů
v kontaminovaných půdách, o množství mikrobiální biomasy atd..
Princip metody
Metoda je založena na měření změn tlaku uvnitř uzavřeného systému v důsledku
mikrobiologické respirační aktivity.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
vzorek půdy
ˇ Chemikálie a roztoky:
čočky NaOH
ˇ Přístroje:
zařízení OxiTop-Control (WTW, Germany), termobox
Obr.3 Zařízení OxiTop- Control (WTW)
18
Postup
Příprava a uchovávání půdního vzorku
Zpracováváme čerstvé vzorky půdy o vlhkosti 50 10%. Vzorek protlačíme přes síto o
velikosti ok 2 mm a homogenizujeme. Část homogenizovaného vzorku použijeme pro
chemické analýzy (stanovení objemu, iontů apod.).
Stanovení objemu vzorku
Odměrný válec naplníme 100 ml destilované vody a přidáme 100 g půdního vzorku. Objem
vody vytlačený půdním vzorkem představuje objem půdy.
Měření půdní respirace
Navážíme 200 g půdního vzorku do vzorkové láhve (Duran) o objemu 500 ml. Do víkového
adaptéru vložíme gumovou absorbční nádobku s pěti čočkami NaOH a nádobu uzavřeme.
Našroubujeme měřící hlavici. Láhev umístíme do termoboxu vytemperovaného na teplotu 20
°C. Půdu temperujeme po dobu dvou hodin. Poté nastartujeme měření vynulováním měřící
hlavice současným stisknutím tlačítek S a M. Měření provádíme po dobu 20 dnů jednou
denně. Naměřené hodnoty se zobrazí po stisknutí tlačítka M.
Vyhodnocení a závěr
Stanovení objemu půdního vzorku vypočteme ze vztahu:
V = m/
Naměřené hodnoty zaznamenáme do tabulky a vynásobíme faktorem 11. Hodnoty představují
mg O2. kg-1
půdy. Provedeme výpočet půdní respirace SR.
kde
SR je půdní respirace,
M(O2) je molekulová hmotnost kyslíku (32000 mg/mol),
R je plynová konstanta (83144 l-mbar/mol-K),
Tinc je inkubační teplota (293,15 K),
Vges je objem reakční nádoby (0,609 litrů),
Vsample je je objem vloženého půdního vzorku,  je hustota půdy,
digit je naměřená hodnota spotřeby kyslíku.
Půdní respiraci vyjádříme v mg O2 /kg sušiny.
Literatura
Anderson, J.P.E., Domsch,K.H. (1978a). Mineralization of bacteria and fungi in
chloroform-fumigated soils. Soil Biol.Biochem. 10:207-213.
Anderson, J.P.E., Domsch,K.H. (1978b). A physiological method for the quantificative
measurement of microbial biomass in soil. Soil Biol.Biochem.10:215-221.
19
3.5 Stimulace půdní respirace přídavkem lehce využitelného
substrátu
Úvod
Viz kapitola 3.1.
Princip metody
Přítomnost půdní biomasy lze prokázat stimulací její respirace přídavkem lehce využitelného
substrátu, nejlépe glukózy. Metoda přímo vychází z fyziologie půdních mikroorganizmů.
Spotřeba kyslíku je průběžně měřena respirometrem.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
Vzorky půdy z různých lokalit
ˇ Chemikálie a roztoky
Roztok stimulační, čočky NaOH, roztok glukózy (16 mg. ml-1
)
ˇ Přístroje:
Zařízení OxiTop -Control (WTW,Germany), magnetická vícemístná míchačka, termobox
Postup
Úprava a preinkubace půdy.
Čerstvě odebranou půdu protlačíme přes síto o velikosti ok 4 mm. Prosátou půdu
homogenizovanou promícháním nasypeme do inertních nádob ( zaplníme asi 1/3 nádoby)
překrytých plastovou fólií. Nádoby s půdou umístíme do temna a inkubujeme po dobu dvou
týdnů při teplotě 20°C. Po preinkubaci si vzorky půdy zachovávají bazální respirační
aktivitu.
Stimulace půdní respirace.
Ke stimulaci půdní respirace použijeme půdní vzorek s bazální respirační aktivitou. U vzorku
stanovíme hustotu  (viz 3.1.) Do vzorkové láhve s bočním ramínkem (Duran) o objemu 500
ml ( reálný objem láhve 0,609 litru) navážíme půdní vzorek tak, aby objem odpovídal 6,7 ml
a přidáme 15 ml stimulačního roztoku. Kontrolní vzorek připravíme obdobně. Do láhve
s vytvořeným půdním kalem vložíme teflonové magnetické míchadlo. Do víkového adaptéru
vložíme gumovou adsorpční nádobu s pěti čočkami NaOH. Nádobu uzavřeme měřící hlavicí.
Láhve umístíme do termoboxu a temperujeme po dobu 1 h na teplotu 20°C. Poté nastartujeme
měření respirace stisknutím tlačítek S a M. Měření provádíme po dobu 4 h a potom do láhve
se vzorkem vstřikneme bočním ramínkem 1 ml roztoku glukózy a do kontrolního vzorku 1 ml
destilované vody. Měřící hlavu vynulujeme a dále zaznamenáváme spotřebu kyslíku po dobu
10 h.
Vyhodnocení a závěr
Vytvoříme tabulku kumulované spotřeby kyslíku. Hodnoty odečtené na displeji vynásobíme
faktorem 100 (faktor je určený pro použitý objem kalu a rozmezí spotřeby kyslíku 0-4000
mg . l-1
). Půdní respiraci vyhodnotíme podle kapitoly 3.1. Graficky zpracujeme průběh
respirace vzorku a vypočteme rychlost respirace půdy po přidání glukózy.
Pozn. Metodu lze modifikovat přídavky glukózy o různé koncentraci, přídavky toxických látek
nebo některých polutantů.
20
Literatura
Van der Werf, H., Genouw, G., Van Vooren, L., Verstraete, W.(1995). The determination
of active microbial biomass by the respiration simulation method. In: Methods in Applied Soil
Microbiology and Biochemistry, Eds. Alef, K., Nannipieri, P., Acad. Press, London, UK:
405-408.
Robertz,M., Muckenheim,T., Eckl,S., Webb,L. (2000). Cost-effective method of
determining soil respiration in contaminated and uncontaminated soils for scientific and
routine analysis.In Remediation engineering of contaminated soils. Wise,D.L. et al. (Eds.),
Marcel Dekker, Inc. New York-Basel, 573- 583.
21
4 Studium bakteriofága
Úvod
Bakteriofágy jsou viry infikující bakteriální buňky. Každý bakteriofág má širší nebo užší
rozmezí hostitele. Někdy je rozmezí hostitele tak specifické, že se určitý bakteriofág množí
jen v některých kmenech určitého druhu bakterií. Infekce bakteriální buňky fágovým
virionem sestává ze dvou dějů: z adsorpce virionu na povrch buňky a ze vstupu (penetrace)
jeho genomu do cytoplazmy. Jestliže po infekci následuje replikace fágového genomu,
syntéza bílkovin fágového kapsidu a sestavování nových virionů s následnou lyzí buňky,
hovoříme o lytické infekci. Fágy, které způsobují pouze lytickou infekci, označujeme jako
virulentní. Kromě virulentních fágů existují tzv. temperované fágy, které vyvolávají buď
lytickou infekci hostitelské buňky nebo její lyzogenizaci. Během lytické infekce dochází
k uvolňování fágového potomstva v procesu lyze buňky a získáváme tzv. fágový lyzát. Počet
nově vytvořených virionů či počet virionů ve fágovém lyzátu lze stanovit odvozením od počtu
vytvořených plak na indikátorovém kmeni (PFU/ml). Proces uvolňování fágového potomstva
z infikovaných hostitelských buněk můžeme sledovat v závislosti na době inkubace adsorpční
směsi fág-hostitelská buňka metodou dvouvrstevného agaru nebo sledování procesu lyze
hostitelských buněk a vzniku fágového lyzátu.
4.1 Stanovení jednostupňové růstové křivky fága metodou
dvouvrstevného agaru
Princip metody
Množení virulentního fága na hostitelských buňkách je možné dokumentovat stanovením
jednostupňové růstové křivky fága. Sledování uvolňování fágového potomstva je umožněno
využitím metody dvouvrstevného agaru. Tato metoda vychází z předpokladu, že počet plak
vytvořených po infekci buněk indikátorové kultury odpovídá přibližně počtu virionů ve
fágovém lyzátu. Pro úspěšné stanovení jednostupňové růstové křivky fága je nutné dodržet
podmínky ve vytvářené adsorpční směsi fág-hostitelské buňky.Významným faktorem, který
se podílí na úspěšném provedení experimentu je přítomnost adsorpčnho kofaktoru (Ca2+
nebo
Mg2+
),použití hostitelských buněk z časné exponenciální fáze růstu a správné nastavení
hodnoty tzv. vkladového poměru (IR-input ratio), který vyjadřuje poměr vložených virionů
k počtu hostitelských buněk v adsorpční směsi. Hodnotu IR je vhodné zvolit v rozmezí 0,1-
0,01. Při vyšších hodnotách IR může docházet k lyzi buněk ihned po adsorpci na hostitele
(lyze zvenčí-lysis from without) aniž by proběhl proces virové reprodukce. Jednostupňová
růstová křivka fága umožňuje stanovit počet nově uvolněných virionů připadajících na jednu
vloženou fágovou částici (BS-burst size). Přesný počet virionů uvolněných z jedné infikované
buňky a multiplicitu infekce může detekovat pouze metodou single- burst distribuce (viz 4.2.).
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmus a bakteriofág:
Staphylococcus aureus SA812, lyzát virulentního stafylokového fága  812 (titr cca
108
PFU/ml)
ˇ Chemikálie a roztoky :
tryptonový bujón (TB) 2% a 0,7% tryptonový agar (TA), pufr Tris-HCl (0,05M , pH=7,2),
0,22% CaCl2
22
ˇ Zařízení :
vodní lázeň, ultratermostat, termostat
Postup
Příprava hostitelských buněk.
Inokulum S. aureus SA812 připravíme naočkováním 20 ml TB cca. 108
buněk ze šikmého 2%
TA (jedna plná očkovací klička). Kultivujeme staticky 24 h při 37 °C. Pro přípravu
hostitelských buněk SA812 z časné exponenciální fáze růstu očkujeme 3 ml inokula do 200
ml TB. Kultivujeme cca. 4 hodiny při 37 °C za intenzivního provzdušňování tak, aby
výsledná hustota bakteriální suspenze odpovídala A620= 78%. Bakteriální kulturu 100x
zředíme v TB a stanovíme počet bakteriálních buněk výsevem na 2% TA (CFU/ml).
Příprava indikátorové kultury SA812
K 20 ml inokula S.aureus SA812 přidáme 2 ml 0,22% CaCl2
Příprava 0,7% TA s indikátorovou kulturou SA812
Ke 150 ml 0,7% TA , který temperujeme po celou dobu experimentu na 45°C ve vodní lázni,
přidáme 15 ml indikátorové kultury SA812 s adsorpčním kofaktorem Ca2+
Příprava adsorpční směsi
K 18 ml buněk SA812 (cca 107
CFU/ml) přidáme 2 ml 0,22% CaCl2. Buňky s adsorpčním
kofaktorem temperujeme ve vodní lázni 30°C. Poté přidáme 0,2 ml  812 (cca 108
PFU/ml),
promícháme a odebereme vzorek pro stanovení PFU/ml v čase t=0. Adsorpční směs fág-
hostitelské buňky kultivujeme po dobu 120 min při teplotě 30°C.Vzorky pro stanovení
PFU/ml odebíráme v čase t= 20;40;60;80;100 a 120 min. Počet uvolňovaných virionů
v adsorpční směsi stanovíme metodou dvouvrstevného agaru na indikátorovém kmeni
S.aureus SA 812.
Metoda dvouvrstevného agaru
0,1 ml zředěného vzorku (odebraného v čase t=0;20;40;60;80;100;120 min) pipetujeme na
Petriho misku s 2% TA. Vzorek převrstvíme 2,5 ml 0,7% TA, který jsme předem
vytemperovali na 45°C a zaočkovali indikátorovou kulturou SA812 s adsorpčním kofaktorem
Ca2+
. Kývavým pohybem vytvoříme tenkou vrstvu 0,7% agaru a necháme v chladnu
utuhnout. Po utuhnutí 0,7% TA misky obrátíme dnem vzhůru a kultivujeme v termostatu při
teplotě 30°C. Po 24 h kultivace odečítáme vytvořené plaky a vypočteme titr fágových částic
v odebraném vzorku. Pro každý časový interval a vhodné ředění vyséváme fága na 2-3 misky.
Vyhodnocení a závěr
a)Výpočet PFU/ml ve vzorku odebraném v čase t=0-120 min provedeme ze vztahu :
Průměrný počet plak na misce × 1/ ředění ×10 = PFU/ml
b) Sestrojíme tabulku hodnot závislosti PFU/ml na době inkubace adsorpční směsi
c) Sestrojíme jednostupňovou křivku závislosti log PFU/ml na době inkubace adsorpční směsi
d)Vypočteme hodnotu IR pro adsorpční směs
e)Vypočteme hodnotu BS
Literatura
Hoďák,K.,Němec,M. (1984).Praktikum z fyziologie baktérií.SkriptumUJEP Brno
23
4.2 Stanovení průměrného fágového výnosu metodou single-burst
experimentu
Princip metody
Stanovení průměrného fágového výnosu na principu Poissonovy distribuce
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy a bakteriofág:
kmen Staphylococcus aureus SA812; lyzát virulentního stafylokového fága  812 (titr lyzátu
cca 1010
PFU/ml),lyzát mutantního stafylokokového fága  812a (titr lyzátu cca 1010
PFU/ml)
ˇ Chemikálie a roztoky:
tryptonový bujón (TB), 2% a 0,7% tryptonový agar (TA), pufr Tris-HCl (0,05M ,pH=7,2),
0,22% CaCl2
ˇ Zařízení :
vodní lázeň, termostat
Postup
0,1 ml 24-hodinové kultury S.aureus SA812 bylo inokulováno do 20 ml TB. Kultivujeme po
dobu 18 h při 30°C. Potom buňky 10-krát zředíme v TB (koncentrace buněk cca 107
CFU/ml-
přesný počet stanovíme výsevem na 2% TA) a přidáme adsorpční kofaktor (do výsledné
koncentrace 0,22% w/v) a vytemperovaný fágový lyzát 812 nebo 812a naředíme tak, aby
hodnota vkladového poměru IR se pohybovala v rozmezí 0,03-0,04 (PFU/ml stanovíme titrací
fágového lyzátu metodou dvouvrstevného agaru (viz 4.1.) Adsorpční směs fág-hostitelské
buňky kultivujeme při 30°C po dobu 20 min, čímž zajistíme dokonalou adsorpci fága na
hostitelské buňky. Adsorpční směs zředíme 10-5
v TB a rozplníme po 0,1 ml do 100 malých
sterilních zkumavek a inkubujeme ve vodní lázni při 30°C po dobu 120 min. Po této době
pipetujeme do zkumavek 2,5 ml 0,7% TA (45°C) s indikátorovou kulturou SA812 (viz 4.1.) a
ihned vyléváme na Petriho misky s 2% TA. Po utuhnutí 0,7% TA misky kultivujeme při 30°C
v termostatu obrácené dnem vzhůru. Po 24 h kultivace hodnotíme počet plak na všech
miskách.
Hodnocení
Většina misek je bez plak nebo s jednou plakou, která je vytvořena neadsorbovaným fágem.
Misky s větším počtem plak ukazují fágový výnos z jedné, dvou nebo více buněk. Sestavíme
tabulku se vzestupným počtem plak pro celkový počet 100 misek. Na základě hodnocení
celkového počtu plak odečtených na 100 miskách a počtu buněk v adsorpční směsi lze
stanovit celkový počet infikovaných buněk a průměrný fágový výnos z jedné buňky.
Výpočet.Počty plak na jednotlivých miskách se pohybují v širokém rozmezí. Z tohoto počtu
je třeba vymezit misky, které představují výnos z jedné buňky, potom ze dvou buněk atd.
Vycházíme z Poissonovy distribuce a výrazu, že podíl zkumavek Po, kde nejsou žádné plaky,
je dán rovnicí :
Po = e-m
,
kde m = průměrný počet infikovaných bakterií, připadajících na jednu zkumavku
(resp.misku).
24
Jestliže
no = počet zkumavek neobsahujících žádné infikované bakterie (resp.počet misek bez plak),
n = celkový počet zkumavek (resp.celkový počet misek), pak za Po můžeme dosadit poměr
no/n a vypočítat m podle vztahu :
m = -lnPo = - ln no/n
potom očekávaný počet misek bez fágového výnosu je Zo = nPo, tedy
Zo = 100 × e-m
počet misek s fágovým výnosem z jedné buňky Z1 = m/1! × 100 × e-m
počet misek s fágovým výnosem ze dvou buněk Z2 = m2
/ 2! × 100 × e-m
počet misek s fágovým výnosem ze tří buněk Z3 = m3
/ 3! × 100 × e-m
Průměrný fágový výnos vypočteme ze vztahu :
Celkový počet plak (na 100 miskách) / (100 × m)
Všechny vypočtené hodnoty zaznamenáme do tabulky. Porovnáme průměrný fágový výnos
fágů 812 a 812a
Literatura
Rosypal,S.,Rosypalová,A. (1970).A spontaneous mutant of polyvalent phage 812 capable of
growth on Staphylococcus aureus NCTC 8511 carrying prophage 53. Folia
Fac.Sci.Natl.Univ.Purk.Brunensis XI:37-47.
Hoďák,K.,Horáková,D., Kazdová,M. (1987). Homogeneous magnetic field effects on the
distribution of yield of virulent staphylophage 812.Folia Fac.Sci.Natl.Univ.Purk.
Brunensis,Biologia 85:17-32.
Luria,S.E., Darnell,J.E.Jr., Baltimore,D.,Campbell,A. (1978). General virology. J.Willey
and Sons, New York.
4.3 Sledování lyze hostitelských buněk v adsorpční směsi
Princip metody
Množení virulentního fága na hostitelských buňkách je možné dokumentovat sledováním
jejich lyze a vznikem fágového lyzátu. Pro sledování rychlosti projasňování bakteriální
kultury v důsledku lyze buněk virulentním fágem s následnou volbou vhodného hostitele,
popř. ke stanovení parametrů v adsorpční směsi, plně vyhovuje automatické sledování změny
zákalu bakteriální kultury na zařízení Bioscreen C (viz 1.2.).
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy a bakteriofág :
Kmeny Staphylococcus aureus SA812; NCTC 8511; S26; PA, lyzát virulentního
stafylokového fága  812 (titr lyzátu cca 1010
PFU/ml), lyzát mutantního stafylokokového fága
 812a (titr lyzátu cca 1010
PFU/ml).
ˇ Chemikálie a roztoky :
tryptonový bujón (TB), 0,22% CaCl2
ˇ Přístroje:
Bioscreen C, vodní lázeň , multikanálová automatická pipeta
25
Postup
Příprava hostitelských buněk.
Inokula vybraných kmenů S. aureus (SA812;NCTC 8511, S26,PA) připravíme naočkováním
20 ml TB cca. 108
buněk ze šikmého 2% TA (jedna plná očkovací klička). Kultivujeme
staticky 24 h při 37 °C. Pro přípravu hostitelských buněk z časné exponenciální fáze růstu
očkujeme 3 ml inokula do 200 ml TB Kultivujeme cca. 4 hodiny při 37 °C za intenzivního
provzdušňování tak, aby výsledná hustota bakteriální suspenze odpovídala A620= 78%.
Příprava adsorpční směsi
K 18 ml hostitelských buněk SA812 (cca 109
CFU/ml) přidáme 2 ml 1% CaCl2. Buňky
s adsorpčním kofaktorem vytemperujeme na 30°C ve vodní lázni Poté přidáme 0,2 ml
vytemperovaného  812 resp.  812a (titr lyzátů cca 1010
PFU/ml), promícháme a pipetujeme
automatickou pipetou po 300l do jamek sterilní inkubační destičky (5 jamek pro každou
adsorpční směs). Podle nastavených parametrů přístroje vzorky inkubujeme při 30°C, zákal
vzorků měříme po 30 min při vlnové délce 600 nm. Před odběrem a mezi odběry (po 15 min)
jsou vzorky krátce protřepány, aby nedocházelo k usazení buněk. Zákal adsorpčních směsí
sledujeme po dobu 24 h. Metodu můžeme modifikovat změnou koncentrace adsorpčního
kofaktoru, změnou hodnoty pH kultivačního media TB v rozmezí hodnot 6- 7,5 nebo volbou
nižšího či vyššího vkladového poměru IR, či volbou jiných kmenů S.aureus pro přípravu
hostitelských buněk.
Vyhodnocení a závěr
Hodnoty OD600 vytiskneme do tabulky. Vypočteme rychlost lyze hostitelských buněk. Na
základě výsledku experimentu stanovíme vhodný hostitelský kmen pro zvolené fágy, popř.
modifikací metody vhodné podmínky pro nastavení parametrů adsorpční směsi.
Literatura
http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm
4.4 Příprava fágového lyzátu  812
Princip
Virulentní a polyvalentní stafylofág 812 se velmi intenzivně množí na hostitelském kmeni
S.aureus SA 812. Pro adsorpci na hostitelské buňky vyžaduje adsorpční kofaktor Ca2+
. Fágy
pro uskutečnění lytického cyklu s vysokou hodnotou BS vyžadují hostitelské buňky
v exponenciální fázi růstu. Tyto podmínky jsou proto dodržovány v metodě přípravy
fágového lyzátu v tekutém médiu. Metody uvolnění fága z vytvořených plak patří mezi méně
používané metody k získání fágového lyzátu pro další experimenty. Takto připravené fágové
lyzáty bývají používány zejména pro fagotypizaci a k ,,záchraně" infikovaných fágových
štoků.
26
Materiál
ˇ Mikroorganizmus :
Staphylococcus aureus SA 812 (hostitelský kmen pro fága  812; lyzát virulentního
stafylofága  812 v TB
ˇ Chemikálie a roztoky :
tryptonový bujón (TB), 2% tryptonový agar (TA), 0,7% tryptonový agar (TA),chloroform p.a.
ˇ Přístroje a zařízení:
termostat s vzdušnícím zařízením, vodní lázeň, chlazená centrifuga, lednice
Postup
Pomnožení virionů v tekutém prostředí.100 ml TB v provzdušňovací láhvi naočkujeme 1 ml
18-ti hodinové kultury hostitelského kmene SA 812. Kultivujeme při teplotě 30°C po dobu 4-
5h za intenzivní aerace média. Koncentrace buněk SA 812 obvykle dosahuje 108
CFU/ml.
Přidáme 10 ml 0,22% (w/v) CaCl2 a 10 ml fágového lyzátu 812 (titr fága musí být zvolen tak,
aby hodnota IR odpovídala 0,1-0,01). Po 1 h kultivace adsorpční směsi SA812-fág  812 při
30°C (jemné provzdušňování) láhev vyjmeme z termostatu a uložíme do temna při pokojové
teplotě. Vyčeřenou bakteriální suspenzi centrifugujeme v chlazené centrifuze při 10000
ot.min ­1
po dobu 10 min. Supernatant představuje fágový lyzát 812. Sterilizaci lyzátu
provedeme několika kapkami chloroformu, který po 1-2 h působení odstraníme.Titr fága
v lyzátu stanovíme metodou dvouvrstevného agaru (viz 4.1.) Lyzát uchováváme v zatavených
skleněných ampulích při teplotě +4°C. Titr fága 812 je velice stabilní a v průběhu jednoho
roku poklesne maximálně o půl řádu.
Uvolnění fága z vytvořených plak. Zásobní fágový lyzát  812 orientačně titrujeme a počet
PFU/ml stanovíme metodou dvouvrstevného agaru (viz 4.1.). Pro přípravu fágového lyzátu
zvolíme ředění fága tak, aby se po výsevu 0,1 ml na Petriho misku vytvořilo cca 104
plak (titr
cca 105
PFU.ml-1
). Fága vyséváme na 10-20 Petriho misek s 2% TA. Převrstvíme 0,7% TA
(45°C) s indikátorovou kulturou SA812 a adsorpčním kofaktorem. Kultivujeme 24 h při
teplotě 37°C. Misku s plaky převrstvíme 3 ml TB a necháme stát při pokojové teplotě. Po 1
hodině vrstvu 0,7% TA s vytvořenými plakami seškrábeme sterilní skleněnou hokejkou do
připravené sterilní kádinky překryté alobalem. Kádinku umístíme přes noc do lednice (+4°C).
Poté kašovitou agarovou hmotu centrifugujeme ve sterilní centrifugační zkumavce
s teflonovým povlakem při teplotě +4°C. Pro tuto první centrifugaci volíme nižší otáčky
centrifugace (cca 5000 ot.min-1
). Odlitý supernatant opět centrifugujeme při vyšších otáčkách
(10 000 ­12 000 ot.min-1
) po dobu 10 min. Vzniklý supernatant představuje fágový lyzát
812. Fágový lyzát sterilizujeme několika kapkami chloroformu, který odstraníme po 1-2 h
působení.Titr lyzátu stanovíme metodou dvouvrstevného agaru. (viz 4.1.). Fágový lyzát
rozplníme po 2 ml do sterilních ampulí a zatavíme. Uchováváme v lednici při teplotě +4°C.
Odpichem z jedné plaky. Zásobní fágový lyzát 812 zředíme v TB na 103
PFU.ml-1
a
vyséváme metodou dvouvrstevného agaru na indikátorový kmen SA812. Do vytvořených
plak provedeme opakovaný vpich očkovací jehlou. Mezi jednotlivými vpichy jehlu
,,opláchneme" v malém objemu sterilního TB. Pro získání fágového štoku 812 s dostatečným
počtem virionů vycházíme z předpokladu, že jedna plaka je tvořena cca 108
fágových částic.
Tuto metodu přípravy fágového lyzátu volíme většinou v případě, že zásobní fágový štok byl
infikovaný. Takto připravený fágový lyzát je vhodné použít pro běžnou přípravu fágového
lyzátu uvolněním z vytvořených plak. Méně vhodný je tento lyzát pro pomnožení virionů
v tekutém prostředí (možnost přerůstání infekce).
27
Vyhodnocení a závěr
Zhodnotíme metody přípravy fágového lyzátu a uvedeme titr připravených fágových lyzátů.
Literatura
Rosypal,S., Horáková,D. (1968). The loss of sensitivity of Staphylococcus aureus NCTC
8511 to the polyvalent and virulent phage 812 following lysogenization with the phage 53.
Publ.Fac.Sci.Nat.Univ.J.E.Purk.Brun., 496:313-326.
28
5 Indukce lyze
Úvod
Podle průběhu infekčního procesu se fágy rozlišují na virulentní a temperované. Při infekci
buněk virulentním fágem proběhne lytický cyklus, jehož výsledkem jsou nové fágové částice,
které jsou nejčastěji v procesu lyze hostitelské buňky uvolňovány do prostředí. Po infekci
hostitelských buněk temperovaným fágem může, podobně jako po infekci virulentním fágem,
proběhnout lytický cyklus nebo se fágový genom včlení do chromozómu hostitelské buňky a
dostává se tak do stavu profága. Tento proces přeměny hostitelské buňky na lyzogenní
označujeme jako lyzogenizace. Lyzogenní kmeny získávají nové vlastnosti, které jsou
podmíněny přítomností profága.
1. Jsou imunní vůči superinfekci homologickým fágem, neboť profág kóduje syntézu
tzv. imunitního represoru, který specificky blokuje syntézu bílkovin potřebných
k replikaci fágové DNA.
2. Lyzogenní buňky mohou za určitých podmínek uvolnit fága ze stavu profága a
vstoupit do lytického cyklu, který je většinou zakončen lyzí buňky hostitele. Uvolnění
profága z chromozómu lyzogena lze indukovat působením fyzikálních nebo
chemických faktorů, např. ozářením suspenze lyzogenních bakteriálních buněk UV
zářením, paprsky X, -zářením, působením organických peroxidů, mitomycinu C aj.
Při velmi nízké frekvenci může dojít ke spontánní lyzi lyzogenních buněk, takže
v lyzogenní bakteriální kultuře můžeme vždy identifikovat volné fágové částice, které
se podílely na její lyzogenizaci hostitelských buněk.
5.1 Optimalizace dávky UV záření metodou titrace uvolněných virionů
Princip metody
Inaktivace imunitního represoru UV zářením a navození lytického cyklu .
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Lyzogenní kmen Staphylococcus aureus NCTC 8511 (53+), Staphylococcus aureus NCTC
8511 (indikátorový kmen pro temperovaného 53)
ˇ Chemikálie a roztoky :
tryptonový bujón (TB), tryptonový agar (TA), (2%), tryptonový agar (TA), (0,7%), pufr
fosfátový (0,05M, pH= 7,2), YE konc, MPB konc., fyziologický roztok, 0,22% (w/v), CaCl2
ˇ Přístroje :
uzavřený box s UV-výbojkou (30W), horizontální třepací zařízení se stolkem (70 kyvů.min-1
),
chlazená centrifuga, termostat, vodní lázeň,vzdušnící zařízení, stopky
29
Postup
Kličku buněk kmene S.aureus NCTC 8511 (53+
) přeneseme do 20 ml TB a kultivujeme při
37°C v termostatu. Z narostlého inokula přeočkujeme 6 ml buněk lyzogena do 500 ml TB
v provzdušňovací láhvi. Při jemnobublinné aeraci média buňky kultivujeme po dobu 4 h při
teplotě 37°C. Bakteriální kulturu centrifugujeme při 10 000 ot..min-1
po dobu 5 min. Sediment
resuspendujeme v 50 ml fosfátového pufru (pH= 7,2).Vytvořenou suspenzi rozdělíme po 10
ml do sterilních Petriho misek (průměr 100 mm) a misky uzavřeme víčkem. Jednotlivou
misku položíme do ozařovacího boxu na stolek horizontální třepačky. (UV výbojka je
vzdálena od stolku třepačky 60 cm, žhavení výbojky alespoň 30 min před ozařováním vzorku,
pracovat v rukavicích !). Zapneme třepačku a zvedneme víčko. Současně měříme čas
ozařování buněk. Buňky ozařujeme 30, 45, 60, 90 nebo 120 s. Po uplynutí požadované doby
ozáření zakryjeme misku víčkem, zastavíme třepačku a misku v alobalu přeneseme do temné
komory (nebezpečí fotoreaktivace!). Zde buňky přeneseme pipetou do provzdušňovací láhve,
přidáme připravené objemy složek výsledného média pro množení a lyzi buněk, tedy 5 ml
koncentrovaného YE, 5 ml koncentrovaného MPB a 35 ml fyziologického roztoku. Buňky
kultivujeme 1 h za velmi mírného provzdušňování v termostatu při teplotě 37°C. Po této
krátké kultivaci láhev vyjmeme z termostatu a uložíme v temnu při pokojové teplotě. Po 24 h
obsah promývací láhve centrifugujeme při 12000 ot. min­1
a v supernatantu stanovíme
titračně počet fágových virionů 53 (viz 4.1 metoda dvouvrstevného agaru, indikátorový
kmen NCTC 8511).
Vyhodnocení a závěr
Sestavíme tabulku závislosti titru 53 na době ozáření lyzogenních buněk S.aurerus NCTC
8511(53+
). Označíme nejvhodnější dobu ozáření lyzogena pro získání fágového lyzátu 53.
Literatura
Rosypal,S.,Horáková,D.(1968). The loss of sensitivity of Staphylococcus aureus NCTC
8511 to the polyvalent and virulent phage 812 following lysogenization with the phage 53.
Publ.Fac.Sci.Univ.J.E.Purkyně 496: 313-326.
5.2 Průběžné sledování lyze ozářených buněk lyzogena
Princip metody
Inaktivace imunitního represoru UV zářením a navození lytického cyklu se projevuje
projasňováním bakteriální kultury. Rychlost tohoto procesu můžeme sledovat kontinuálně
s využitím automatického zařízení Bioscreen C.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Lyzogenní kmen Staphylococcus aureus NCTC 8511 (53+),
ˇ Chemikálie a roztoky :
TB, pufr fosfátový (0,05M, pH= 7,2), YE konc., MPB konc., fyziologický roztok, 0,22%
(w/v) CaCl2
ˇ Přístroje :
uzavřený box s UV-výbojkou (30W), horizontální třepací zařízení se stolkem (70 kyvů.min-1
),
chlazená centrifuga,vzdušnící zařízení, stopky, Bioscreen C (software BioLink,MS EXCEL)
http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm
30
Postup
Buněčnou suspenzi lyzogenních buněk ve fosfátovém pufru připravíme podle 5.1. a ozáříme
po různou dobu UV. Ozářené buňky v temnu 10x zředíme ve fosfátovém pufru. Do sterilní
Erlenmayerovy baňky (200 ml) odebereme 10 ml buněk a přidáme 5 ml koncentrovaného YE,
5 ml koncentrovaného MPB a 35 ml fyziologického roztoku. Připravenou buněčnou suspenzi
pipetujeme po 300 l do jamky sterilní inkubační destičky přístroje Bioscreen C. Pro každou
dobu UV expozice pipetujeme vzorek do 5 jamek. Jako kontrolu použijeme neozářené buňky.
Kultivaci buněk provádíme po dobu 48 h při teplotě 37°C, míchání vzorků opakujeme vždy
po 30 minutách , měření po 60 min, před měřením naprogramujeme míchání vzorků.
Vyhodnocení a závěr
Zobrazíme vybrané křivky, vytiskneme, vytvoříme tabulku pro hodnocení v MS Excel a
vyhodnotíme rychlost lyze buněk v závislosti na době jejich ozáření UV.
Literatura
http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm
31
6 Dehydrogenázová aktivita bakteriálních buněk
Úvod
Dehydrogenázy jsou enzymy katalyzujícící přenos vodíku v dýchacím řetězci. V živé buňce
se vyskytují ve dvou typech, lišících se mezi sebou koenzymem. U prvého enzymu je
koenzymem dinukleotid, jehož složkou je nikotinamid (NAD ­nikotinamiddinukleotid nebo
NADP-nikotinamiddinukleotidfosfát), u druhého typu je to flavin (FMN ­flaminmonukleotid
a FAD-flavinadenindinukleotid). U baktérií, podobně jako u rostlin a živočichů, jsou
dehydrogenázy pojmenovány podle substrátu, jehož dehydrogenaci katalyzují. Metody
stanovení jednotlivých dehydrogenáz jsou založeny na změně molekuly akceptoru vodíku.
Akceptor vodíku může být přirozený nebo umělý.
6.1 Stanovení dehydrogenáz s využitím umělého akceptoru vodíku a
elektronů
Princip metody
Umělé akceptory vodíku a elektronů jsou látky, které po redukci přecházejí z bezbarvé
oxidované formy na barevnou nebo naopak. Měření aktivity enzymu se pak provádí
kolorimetricky. Pro stanovení dehydrogenáz u baktérií je nejčastěji používána metylenová
modř, tetrazoliové soli nebo fenazinmetosulfát. Metylenové modři se využívá především při
orientačních pokusech nebo při tzv. Thumbergově metodě. Tato metoda je založena na
stanovení rychlosti, jakou se barevná forma odbarvuje v přítomnosti substrátu, tedy donoru
vodíku a elektronů. Aby nedocházelo ke zpětné oxidaci, musí celá reakce probíhat
v anaerobních podmínkách. Další nevýhodou použití metylenové modři je vedle autooxidace i
její značná toxicita pro bakteriální buňku. Při běžně používané koncentraci je během 5 min
usmrcena většina buněk v bakteriální suspenzi. Výhodnějším umělým akceptorem vodíku a
elektronů pro stanovení dehydrogenázové aktivity mikroorganizmů se jeví sloučeniny
tetrazolia, zvláště pro jejich velmi nízkou toxicitu. Nejčastěji se používá tetrazoliumchlorid
nebo tetrazoliumbromid, který se redukuje na červený formazan. Vzniklé červené zbarvení se
pak stanoví kolorimetricky. Nevýhodou reakce je citlivost tetrazoliových solí na přímé světlo.
Fenazinmetosulfát byl využíván zejména v minulosti ke stanovení dehydrogenáz
manometrickými metodami. Za aerobních podmínek podléhá snadno autooxidaci.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Staphylococcus aureus NCTC 8511, Staphylococcus aureus S26, Staphylococcus aureus SA
812, Kocuria varians CCM 1046, Bacillus cereus CCM 98
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB 1, pufr fosfátový (0,067M, pH=7,2), substráty ve formě 1% (w/v) roztoku ve
fosfátovém pufru (sacharóza, laktóza, maltóza, glukóza, pyrohroznan, mléčnan, jantaran,
glycerol), 0,1% (w/v) vodný roztok trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), 96% etanol.
ˇ Přístroje:
termostat s provzdušňovacím zařízením, centrifuga, vodní lázeň, fotometr.
32
Postup
Příprava bakteriální suspenze. Ze zásobní kultury naočkujeme jednu kličku (cca 108
buněk) do
20 ml MPB 1 (ve 100 ml baňce) a kultivujeme při teplotě 30°C po dobu 24 h. Do 200 ml
čerstvého MPB 1 přeneseme asepticky 4 ml narostlého inokula a pokračujeme v kultivaci 18
h při 30°C za intenzivního provzdušňování média. Narostlé buňky oddělíme od média
centrifugací. Buňky resuspendujeme ve stejném objemu fosfátového pufru a opět
centrifugujeme. Tento proces ,,promývání buněk" opakujeme alespoň dvakrát. Hustotu
bakteriální suspenze nastavíme nefelometricky na hodnotu A620 = 85%. Hustotu bakteriální
suspenze vyjádříme sušinou (viz 2.2.) v mg/ml.
Příprava reakční směsi pro stanovení dehydrogenázové aktivity. Reakci provádíme ve
Wassermannových zkumavkách vymytých destilovanou vodou. Pro každý substrát a časový
interval připravíme 2 opakování. Reakce probíhá při teplotě 37°C v uzavřené vodní lázni.
1.Reakční směs pro stanovení celkové dehydrogenázové aktivity buněk obsahuje : 0,5 ml
bakteriální suspenze, 0,15 ml fosfátového pufru, 0,25 ml substrátu. Po vytemperování reakci
odstartujeme přídavkem 0,1 ml 0,1% TTC. Reakci zastavujeme po 0 10,20,30,40 a 50 min
inkubace přídavkem 5 ml 96% etanolu.Vytvořený formazan vytřepeme do etanolu a buňky
odstraníme centrifugací (5000 ot.min-1
po dobu 5 min). Červeně zbarvený supernatant slijeme
do čistých zkumavek a měříme na faktorizovaném fotometru (proti 100 g formazanu.ml-1
)
při vlnové délce 485 nm.
2.Reakční směs pro stanovení dehydrogenace endogenního substrátu obsahuje: 0,5 ml
bakteriální suspenze, 0,4 ml fosfátového pufru. Po vytemperování reakci odstartujeme
přídavkem 0,1 ml 0,1% TTC. Další postup je shodný s postupem uvedeným pro 1. reakční
směs (stanovení celkové dehydrogenázové aktivity).
Hodnocení
Z naměřených hodnot sestavíme tabulku, do které zaznamenáme koncentraci vytvořeného
formazanu v přítomnosti jednotlivých substrátů vztaženého na mg sušiny zvoleného
kmene.Vytvoříme graf závislosti koncentrace vytvořeného formazanu na době inkubace.
Graficky zpracujeme i hodnoty koncentrace vytvořeného formazanu u kmenů s pozitivní
dehydrogenací endogenního substrátu. Vypočteme dehydrogenázové jednotky pro daný
substrát a kmen (g formazanu.mg-1
sušiny.min-1
). Složitou analýzou variance může porovnat
dehydrogenázovou aktivitu jednotlivých kmenů v přítomnosti různých substrátů. Mimo to lze
porovnat i tzv. relativní dehydrogenační rychlost. Ta je vyjádřena jako % aktivity vztažené na
aktivitu glukózadehydrogenázy (tuto považujeme za 100%). Hodnoty pro výpočet relativní
dehydrogenační aktivity představují množství vytvořeného formazanu v přítomnosti daného
substrátu po odečtu endogenní dehydrogenace.
Literatura
Hoďák,K.,Němec,M. (1984). Praktikum z fyziologie baktérií. Skriptum UJEP Brno.
33
6.2 Stanovení aktivity malát dehydrogenázy
Úvod
Malát dehydrogenáza (MDH, EC 1.1.1.37) katalyzuje vnitřní přeměnu L-malátu a oxalacetátu
a vyžaduje přítomnost NAD jako koenzymu:
L-malát + NAD+
oxalacetát + NADH + H+
Byly popsány malát dehydrogenázy, které jsou NADP dependentní. Optimální pH reakce
MDH se pohybuje kolem hodnoty 7,4. Enzym byl popsán u eukaryotických buněk i u baktérií.
MDH je enzymem cyklu kyseliny citronové.
Mírou malátdehydrogenázové aktivity je změna optické denzity při 340 nm za jednotku času.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
divoký kmen kvasinky Yarrowia lipolytica CCM 4510
ˇ Chemikálie a roztoky:
MEB, pufr fosfátový (0,1M, pH= 7,5), 15mM oxalacetát, 12 mM NADH
ˇ Přístroje:
spektrofotometr Genesys 5, vodní lázeň s třepačkou, ultrazvukový dezintegrátor Bandelin
UW 200 s nadstavcem SH213G a sondou TT13 (řídící jednotka D200)
Postup
Příprava kvasinek. Do 100 ml MEB media v Erlenmayerových baňkách (250 ml) přidáme 2,5
ml 24-hodinového inokula. Buňky kultivujeme 20 h za intenzivního třepání při teplotě +25°C.
Buňky promyjeme 0,1M fosfátovým pufrem (pH = 7,5). Sediment resuspendujeme v 15 ml
0,1M fosfátového pufru (pH=7,5) a rozbijeme ultrazvukem. Sonikaci vzorků provádíme ve
skleněné kyvetě napojené na ultratermostat a chlazené na +4°C . Dezintegrace probíhá po
dobu 12 min čistého času s cyklem plnění 60% pomocí sondy TT13 ponořené 2 cm
v kapalině. Výkon ultrazvuku nastavíme asi na 80% celkového výkonu zařízení (200W).Po
ukončení sonikace odstraníme zbytky buněčných stěn centrifugací při 10000g (10 min, +4°C)
V supernatantu stanovíme koncentraci rozpustných bílkovin podle Bradfordové (viz 2.1.).
Reakční směs. Do kyvety temperované na 25°C pipetujeme 2,83 ml 0,1M fosfátového pufru
(pH = 7,5), 0,1 ml 15 mM roztoku oxalacetátu a 0,05 roztoku 12mM NADH. Reakci zahájíme
přídavkem 0,02 ml vzorku. Vytvořenou směs promícháme a odečteme optickou denzitu při
340 nm po 1,2,3 a 5 min. Vypočteme hodnoty E/min.
Jednotka enzymu oxiduje 1 mol NADH za minutu při 25°C a hodnotě pH= 7,5.
Výpočet. Z lineární části křivky vypočteme
a)objemovou aktivitu enzymu vyjádřenou v jednotkách na ml vzorku :
 A340 /min
Objemová aktivita =
6,22 mg enzymu/ml reakční směsi
MDH
34
b) Specifickou aktivitu vyjádřenou v jednotkách na mg bílkoviny vzorku:
objemová aktivita
Specifická aktivita =
koncentrace
Literatura
Hayashi,M.,Unemoto,T. (1967). The presence of D-malate dehydrogenase (D-Malate:NAD
Oxidoreductase) in Serratia marcescens. Biochim.Biophys.Acta ,139:16-21.
35
7 Inducibilní enzymy u baktérií
7.1 Kinetika indukce -galaktosidázy
Úvod
Metabolické procesy v bakteriální buňce jsou řízeny regulačními mechanizmy, které ovlivňují
tvorbu enzymů. Klasickým příkladem pro pozorování regulačního mechanizmu je tvorba -
galaktosidázy a láktát permeázy. Regulační systém byl podrobně studován u buněk E.coli při
využívání laktózy, která je buňkami štěpena na glukózu a galaktózu. Nejvhodnějšími
induktory -galaktosidázy jsou fosforylované -galaktosidy, zejména galaktózo-6-fosfát.
Regulace metabolizmu a genetická podstata regulačních mechanizmů využívání laktózy u
buněk S.aureus jsou podobné jako u buněk E.coli. Rozdíly jsou patrné pouze ve stabilitě -
galaktosidázy, která je u stafylokoků poměrně labilní. Rovněž některé látky, které u E.coli
vystupují jako účinné induktory enzymu (např. isopropyltiogalaktosid), inhibují produkci
indukované -galaktosidázy u buněk S.aureus. U stafylokoků je všeobecně lepším
induktorem -galaktosidázy galaktóza ve srovnání s laktózou.
Princip stanovení
Jako přirozené substráty pro indukci -galaktosidázy může být použita např. D-laktóza nebo
D-galaktóza. Ke stanovení aktivity enzymu můžeme použít chromogenní substrát o-
nitrofenyl--D-galaktopyranosid (ONPG), který je v průběhu enzymatické reakce štěpen na
barevný o-nitrofenolátový anion a D-galaktózu. Uvolněný o-nitrofenol (ONP) kvantitativně
stanovíme v alkalickém prostředí při vlnové délce 420 nm.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmus :
Staphylococcus aureus SA 812
ˇ Chemikálie a roztoky :
MPB 1; Tris.HCl pufr (0,05M, pH=7,2); 20% (w/v) vodný roztok D-galaktózy (sterilní);
roztok ONPG v Tris-HCl (0,3 g/ 100 ml); 1M Na2CO3
ˇ Přístroje :
Termostat se vzdušnícím zařízením, vodní lázeň s třepačkou, spektrofotometr, sterilní
centrifugační zkumavky s teflonovým povrchem, chlazená centrifuga
Postup
Příprava bakteriální suspenze. Ze šikmého agaru zásobní kultury odebereme cca 108
buněk a
naočkujeme 20 ml MPB 1 (ve 100 ml Erlenmayerově baňce) a kultivujeme 18 h při 30°C.
Narostlé inokulum (10 ml) přeneseme do provzdušňovací láhve s 1000 ml MPB 1.
Kultivujeme za intenzivní aerace po dobu 14 h při teplotě 30°C.Vytvořenou bakteriální
suspenzi centrifugujeme při 6000 ot.min-1
po dobu 20 min v chlazené centrifuze.
K centrifugaci použijeme sterilní centrifugační zkumavky o objemu 500 ml. Buněčný
sediment sterilně resuspendujeme v menším objemu MPB 1 a hustotu bakteriální suspenze
nastavíme na A620 = 85%.
36
Příprava indukční směsi SA 812 s galaktózou a proces indukce. Připravíme 7
Erlenmayerových baněk se 100 ml buněčné kultury SA812 (A620 = 85%) a sterilně přidáme
D-galaktózu ze zásobního roztoku (20%) tak, aby kultivační médium s buňkami obsahovalo
2,5%; 2%; 1,5%; 1%; 0,5% galaktózy. Do 7. baňky nepřidáváme induktor a tento vzorek
použijeme k vyloučení konstitutivní produkce enzymu, tedy jako kontrolu.Vzorky a kontrolu
kultivujeme při teplotě 30°C na třepačce s vodní lázní (150 kyvů.min-1
, amplituda 3).
V časových intervalech 0;30;60;90;120;150;180 a 210 min odebíráme sterilní pipetou vzorky
o objemu 7,5 ml do plastových centrifugačních zkumavek (objem 10 ml). Centrifugujeme při
10 000 ot.min-1
po dobu 5 min v chlazené centrifuze. K buněčnému sedimentu přidáme 1,5 ml
Tris-HCl pufru a hustotu suspenze upravíme na fotometru při vlnové délce 620 nm na
hodnotu 97% (přesně!).
Enzymatická reakce. Do reakční zkumavky pipetujeme 0,6 ml Tris.HCl pufru , 0,1 ml
bakteriální suspenze (A620 = 97%) .Temperujeme po dobu 5 min ve vodní lázni na teplotu
37°C. Reakci odstartujeme přídavkem 0,3 ml ONPG. Po 30 min inkubace reakci zastavíme
přídavkem 1 ml 1M Na2CO3 (pH reakční směsi = 10,8). Buňky odstraníme centrifugací.
Supernatant, zbarvený žlutě uvolněným o-nitrofenolem, měříme při 420 nm na
spektrofotometru faktorizovaném na koncentraci ONP = 100 mol.ml-1
.
Vyhodnocení a závěr
Sestrojit křivku průběhu indukce enzymu (závislost mol ONP . ml-1
na době inkubace) pro
každou koncentraci induktoru.
Literatura
Creaser,E.H. (1955). The induced (adaptive) biosynthesis of -galaktosidase in
Staphylococcus aureus. J.gen.Microbiol., 12: 288-297.
Hengstenberg,W., Schrecker,O., Stein,R.,Weil,R.(1976). Lactose transport and metabolism
in Staphylococcus aureus.Zbl.Bact.Paras.Inf.Hygiene, 5:203-215.
Hoďák,K., Valentová,M. (1980). Studium produkce -galaktosidasy u vybraných kmenů
Staphylococcus aureus. Folia Fac.Sci.Natl.Univ.Purk.Brunensis,XXI: 15-25.
7.2 Změny v indukci -galaktosidázy v přítomnosti virulentního
bakteriofága
Úvod
Adsorpce bakteriofága na bakteriální buňku vyvolává četné změny v jejím metabolizmu.Po
infekci stafylokokových buněk virulentním a polyvalentním fágem 812 došlo k významnému
poklesu dehydrogenázové a oxidační aktivity hostitelských buněk S.aureus. Další studia
prokázala, že u buněk S.aureus dochází po přidání virulentního stafylofága 812 ke snížení
indukované syntézy -galaktosidázy. Stupeň inhibice tohoto procesu je u buněk citlivých
k fágu 812 do značné míry závislý na vkladovém poměru IR.Výsledky naznačují, že
indukovaná syntéza -galaktosidázy je v přímé závislosti na růstu buněk.
37
Princip stanovení
Jako přirozené substráty pro indukci -galaktosidázy může být použita např. D-laktóza nebo
D-galaktóza. Ke stanovení aktivity enzymu můžeme použít chromogenní substrát o-
nitrofenyl--D-galaktopyranosid (ONPG), který je v průběhu enzymatické reakce štěpen na
barevný o-nitrofenolátový anion a D-galaktózu. Uvolněný o-nitrofenol (ONP) kvantitativně
stanovíme v alkalickém prostředí (pH >10) při vlnové délce 420 nm.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmus :
Staphylococcus aureus SA 812 (hostitelský kmen pro fága 812; produkuje inducibilně -
galaktosidázu); lyzát virulentního stafylofága  812 v TB (příprava viz 4.3.)
ˇ Chemikálie a roztoky :
TB; Tris.HCl pufr (0,05M, pH=7,2), 20% (w/v) vodný roztok D-galaktózy (sterilní); roztok
ONPG v Tris-HCl (0,3 g / 100 ml); 1M Na2CO3
ˇ Přístroje :
Termostat se vzdušnícím zařízením, vodní lázeň s třepačkou, spektrofotometr, sterilní
centrifugační zkumavky s teflonovým povrchem, chlazená centrifuga
Postup
Příprava buněk. Ze šikmého agaru zásobní kultury SA812 odebereme cca 108
buněk a
naočkujeme 20 ml TB (ve 100 ml Erlenmayerově baňce) a kultivujeme 18 h při 30°C.
Narostlé inokulum (10 ml) přeneseme do provzdušňovací láhve s 1000 ml TB. Kultivujeme
za intenzivní aerace po dobu 14 h při teplotě 30°C.Vytvořenou bakteriální suspenzi
centrifugujeme při 6000 ot.min-1
po dobu 20 min v chlazené centrifuze. K centrifugaci
použijeme sterilní centrifugační zkumavky o objemu 500 ml. Buněčný sediment sterilně
resuspendujeme v menším objemu TB a hustotu bakteriální suspenze nastavíme na A620 =
85%. Odebereme vzorek pro stanovení počtu buněk (CFU.ml-1
).
Příprava indukční směsi a proces indukce -galaktosidázy. Naředěnou buněčnou suspenzi
rozplníme po 100 ml do sterilních Erlenmayerových baněk (objem 250 ml). K buněčné
suspenzi přidáme D-galaktózu ze zásobního roztoku do konečné koncentrace 1% (w/v).
Současně přidáme Ca2+
ve formě CaCl2 (do konečné koncentrace 2,2. 10-3
M) jako adsorpční
kofaktor. K takto upravené buněčné suspensi SA 812 přidáme lyzát  812 o známém titru tak,
aby vkladový poměr v jednotlivých baňkách dosáhl hodnot IR= 10-1
; 10 ­2
; 10-3
. Jednu baňku
neinfikujeme a bude nám sloužit ke sledování průběhu přirozené indukce (kontrola). Vzorky a
kontrolu kultivujeme při teplotě 30°C na třepačce s vodní lázní (150 kyvů.min-1
, amplituda 3).
V časových intervalech 0;30;60;90;120;150;180 a 210 min odebíráme sterilní pipetou vzorky
o objemu 7,5 ml do plastových centrifugačních zkumavek (objem 10 ml). Centrifugujeme při
10 000 ot.min-1
po dobu 5 min v chlazené centrifuze. K buněčnému sedimentu přidáme 1,5 ml
Tris-HCl pufru a hustotu vytvořené bakteriální suspenze změříme při = 620 nm. Potom
hustotu suspenze upravíme na fotometru při vlnové délce 620 nm na hodnotu 97% (přesně!).
Enzymatická reakce. Do reakční zkumavky pipetujeme 0,6 ml Tris.HCl pufru, 0,1 ml
bakteriální suspenze (A620 = 97%). Temperujeme po dobu 5 min ve vodní lázni na teplotu
37°C. Reakci odstartujeme přídavkem 0,3 ml ONPG. Po 30 min inkubace reakci zastavíme
přídavkem 1 ml 1M Na2CO3 (pH reakční směsi = 10,8). Buňky odstraníme krátkodobou
centrifugací při 12000 ot. min-1
. Supernatant, který je zbarvený žlutě uvolněným o-
nitrofenolem, měříme při 420 nm na spektrofotometru faktorizovaném na koncentraci
ONP=100 mol.ml-1
.
38
Vyhodnocení a závěr
Sestrojit křivku průběhu indukce enzymu (závislost mol ONP . ml-1
na době inkubace) pro
každou hodnotu IR.
Sestrojit křivky závislosti OD620 na době inkubace indukční směsi .
Literatura
Ghos,A.,Poddar,R.K. (1977). Reduced synthesis of -galaktosidase in Escherichia coli
infected with phage X174. Can.J.Microbiol.,23:1069-1077.
Hoďák,K., Horáková,D., Kazdová,M. (1980). Inhibice indukované syntesy -galaktosidasy
u Staphylococcus aureus po infekci virulentním fágem. I. Vliv vkladového poměru. Folia
Fac.Sci.Nat.Univ.Purk.Brunensis,XXI : 27-35.
39
8 Fosfatázová aktivita
Úvod
Fosfatázy jsou hydrolytické enzymy, které štěpí estery kyseliny fosforečné (fosfolipidy,
fosfoproteiny apod.). Jsou hojně zastoupeny v prokaryotických a eukaryotických buňkách,
kde jsou součástí regulačních a syntetických procesů. Podle mezinárodní nomenklatury
enzymů patří fosfatázy do třetí hlavní třídy enzymů, tedy mezi hydrolázy a do první podtřídy,
ve které jsou hydrolázy katalyzující štěpení esterových vazeb. Jsou označeny kódem EC 3.1.
Podle vztahu k substrátu lze fosfatázy rozdělit do dvou základních skupin:
a) enzymy specifické pro jeden typ substrátu (např. fosfomonoesterázy, fosfodiesterázy a
pyrofosfatázy)
b) enzymy specifické k více substrátům (např. adenosintrifosfatázy, hexózodifosfatázy)
Fosfomonoesterázy obecně katalyzují hydrolýzu monoesterů kyseliny fosforečné podle
schématu:
Fosfodiesterázy obecně katalyzují hydrolýzu esterické vazby kyseliny fosforečné v diesterech
podle schématu:
Fosfomonoesterázy se rozdělují do čtyř skupin (klasifikační číslo EC 3.1.3.1. až EC 3.1.3.4.),
z nichž nejvýznamnější jsou enzymy EC 3.1.3.1. alkalické fosfatázy a EC 3.1.3.2. kyselé
fosfatázy. V závislosti na producentském organizmu vykazují alkalické fosfatázy vysokou
aktivitu v širokém rozmezí hodnoty pH (pH=7,2 až 10,5). Kyselé fosfatázy vykazují nejvyšší
fosfatázovou aktivitu při hodnotě pH okolo 5. Alkalická fosfatáza u mikroorganizmů bývá
velice často vázaná na struktury buňky, pouze malá část je sekretována do prostředí.
O
||
R ­ P ­ O ­ OH + H2O <====> R ­ OH + H3PO4
|
OH
O
||
R1 ­ P ­ O ­ O ­ R2 + H2O <====> R2 ­ OH + H3PO4
|
OH
40
8.1 Stanovení fosfatázové aktivity nativních bakteriálních buněk
Princip metody
Principem stanovení fosfatázové aktivity je měření vznikajícího produktu hydrolýzy esterů.
Metoda je založena na skutečnosti, že při této reakci enzym nerozlišuje mezi organickými
skupinami R a katalyzuje i přeměnu syntetických analogů. Proto lze enzymatickou reakci
provádět s nejrůznějšími substráty. Průběh reakce pak sledujeme spektrofotometricky.
Nejčastěji používaným substrátem pro laboratorní stanovení fosfatázové aktivity je 4-
nitrofenylfosfát (PNPP). Jedná se o chromogenní substrát, který se při reakci mění na žlutě
zbarvený 4-nitrofenolátový anion.
fosfatáza
O2N O PO3
2-
+ H2O O2N OH + HPO4
2-
PNPP PNP
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Agrobacterium tumefaciens CCM 1000
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1; MPA 1; Tris-HCl pufr (0,05M, pH=7,2); 4-nitrofenylfosfát (PNPP) v koncentracích
2000; 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 g.ml-1
; 1M NaOH
ˇ Přístroje:
Vodní lázeň, termostat, chlazená centrifuga, fotometr
Postup
Příprava bakteriálních buněk
20 ml MPB 1 naočkujeme jednou plnou bakteriologickou kličkou kultury buněk
Agrobacterium tumefaciens CCM 1000 ze zásobního šikmého agaru (MPA). Kultivujeme
staticky 24 hodin při 30°C. Odebereme 10 ml připraveného inokula a sterilně přeneseme do
200 ml MPB1 v provzdušňovací láhvi. Za intenzivního provzdušňování kultivujeme 24 hodin
při 30°C. Poté kulturu centrifugujeme v chlazené centrifuze (+4°C) při 6000 otáčkách po
dobu 30 minut (pozor, buňky špatně sedimentují!). Buněčný sediment dvakrát promyjeme
opakovanou centrifugací v Tris-HCl pufru. Promyté buňky resuspendujeme v Tris-HCl pufru
na požadovanou hustotu A620 = cca 75% a stanovíme sušinu (viz 2.2).
Příprava reakční směsi a slepého vzorku
Do 16 zkumavek pipetujeme po 0,6 ml Tris-HCl a 1 ml bakteriální suspenze (A620 =cca 75%).
Do dalších 8 zkumavek pipetujeme po 1,6 ml Tris.HCl pufru (slepé vzorky). Všechny
zkumavky temperujeme ve vodní lázni při 37°C po dobu 5 min. Pro každou koncentraci
PNPP připravujeme 2 vzorky s buňkami a 1 slepý vzorek. Enzymatickou reakci nastartujeme
přídavkem 0,2 ml PNPP v odpovídající koncentraci. Inkubace vzorků probíhá ve vodní lázni
při 37°C po dobu 20 min. Reakci zastavíme alkalizací vzorků přídavkem 2 ml 1 M NaOH.
41
Buňky odstraníme centrifugací (10000 ot.min-1
po dobu 5 min). Žluté zbarvení supernatantu
měříme při  = 400 nm na kalibrovaném fotometru (faktorizace fotometru provedena pro
koncentraci 100 g PNP.ml-1
).
Vyhodnocení a závěr
Výpočet sušiny ve vzorku.
Graf závislosti aktivity enzymu (nmol PNP.mg-1
.min-1
) na koncentraci PNPP (nmol.ml-1
).
Stanovení hodnoty KM.
Literatura
Barnes, E.H., Morris, J.F. (1951). A quantitative study of the phosphatase activity of
Micrococcus pyogenes. J. Bacteriol. 73: 100-104.
Hoďák, K., Němec, M. (1985). Praktikum z fyziologie bakterií, Skriptum UJEP Brno
8.2 Stanovení fosfatázové aktivity HEP
Příprava acetonového prášku (HEP) s fosfatázovou aktivitou
Princip metody
Buňky Agrobacterium tumefaciens vykazují vysokou fosfatázovou aktivitou při pH=7,2.
Rychlým vysušením a částečnou perforací buněk ledovým acetonem můžeme připravit hrubý
enzymatický preparát (HEP), který lze dlouhodobě využívat pro studium fosfatáz vázaných na
zbytky buněk. HEP ve formě prášku uchováváme v uzavřených ampulích při +4°C.
Enzymatická aktivita preparátu je stabilní minimálně po dobu 6 měsíců.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Agrobacterium tumefaciens CCM 1000
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1; Tris-HCl pufr (0,05M, pH=7,2); aceton; éter; destilovaná voda; 4-nitrofenylfosfát
(PNPP) v koncentracích 2000; 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 g.ml-1
ˇ Přístroje:
termostat, centrifuga, olejová vývěva
42
Postup
20 ml MPB1 naočkujeme jednou plnou bakteriologickou kličkou kultury buněk
Agrobacterium tumefaciens CCM 1000 ze zásobního šikmého agaru. Kultivujeme staticky 24
h při 30°C. 10 ml připraveného inokula sterilně přeneseme do 200 ml MPB 1
v provzdušňovací láhvi. Za intenzivního provzdušňování kultivujeme 24 h při 30°C. Poté
kulturu zcentrifugujeme v chlazené centrifuze (+4°C) při 6000 ot.min-1
po dobu 20 minut.
Buněčný sediment dvakrát promyjeme v Tris-HCl pufru (dodržíme stejné podmínky jako při
předchozí centrifugaci). Sediment resuspendujeme v malém množství destilované vody a
přelijeme do skleněné baňky o objemu 1 litr.(Další pracovní postup provádíme v rukavicích
v digestoři vybavené odtahem vznikajících par!). Postupně přiléváme vychlazený aceton (-5
°C) a stále protřepáváme. Sledujeme vznik sraženiny. Objem přidaného acetonu volíme
individuálně podle kvality srážení buněk, obvykle se pohybuje v rozmezí 200 až 400 ml.
Sražené buňky necháme 5 až 10 minut sedimentovat. Potom přistoupíme k filtraci vysušených
a částečně perforovaných buněk přes dvojitý filtr (typ filtračního papíru 2R/80g). Filtr
umístíme do Büchnerovy nálevky a aceton odsajeme s pomocí olejové vývěvy.Buňky
zachycené na filtračním papíru dosušíme malým množstvím éteru (cca 30 ml).Vysušené
buňky zachycené na filtračním papíru musejí mít čistě bílou barvu. Pokud pozorujeme barvu
spíše nažloutlou, zopakujeme vysušení éterem. Filtrační papír s buňkami vyjmeme
z Büchnerovy nálevky pinzetou a necháme sušit v digestoři při pokojové teplotě do druhého
dne. Vytvořený prášek (hrubý enzymový preparát- HEP) seškrábeme z filtračního papíru
skalpelem, homogenizujeme v třence a uchováváme v lednici ve skleněné uzavřené nádobě
(pro dlouhodobější experimenty nejlépe v zatavených ampulích se sorbentem vody).
Stanovení fosfatázové aktivity HEP při pH=7,2
Připravíme reakční směs obsahující l ml roztoku HEP (0,1 mg.ml-1
) a 0,6 ml 0,05M Tris-HCl.
Temperujeme při 37°C po dobu 5 min . Reakci nastartujeme přidáním 0,2 ml PNPP o různé
koncentraci a inkubujeme při 37°C po dobu 10 min (dobu inkubace můžeme zkrátit na 5 min
nebo prodloužit na 15 min podle rychlosti uvolňování PNP). Další postup je uveden v bodě
8.1.
Pozn.Vzorky není třeba před měřením centrifugovat!
Vyhodnocení a závěr
Graf závislosti aktivity HEP (nmol PNP.mg-1
.min-1
) na koncentraci PNPP (nmol.ml-1
)
Stanovení hodnoty KM.
8.3 Stanovení vlivu teploty na fosfatázovou aktivitu buněk S. aureus
SA 812
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Staphylococcus aureus SA 812
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1; Tris-HCl pufr (0,05M, pH=7,2); PNPP (0,4 g ve 100 ml vody); 1M NaOH
ˇ Přístroje:
termostat, chlazená centrifuga, vodní lázně, spetrofotometr
43
Postup
Jednou plnou bakteriologickou kličkou naočkujeme 20 ml MPB 1 a necháme kultivovat
v termostatu 18 h při 30 °C. Tímto inokulem (20 ml) naočkujeme 1 litr MPB1
v provzdušňovací láhvi a opět kultivujeme 18 h při 30 °C za intenzivního provzdušňování.
Bakteriální kulturu zcentrifugujeme v chlazené centrifuze (6000 ot.min-1
, 10 min).
Supernatant odlijeme a buňky resuspendujeme v Tris-HCl pufru. Opět zcentrifugujeme při
dodržení stejných parametrů jako při předchozí centrifugaci. Buněčný sediment zředíme
v Tris-HCl pufru a hustotu buněk nastavíme na A620=75%. Stanovíme sušinu buněčné
suspenze (viz 2.2.).
Reakční směs připravíme do skleněných zkumavek o objemu 10 ml. Pro každou inkubační
teplotu (37 °C, 45 °C, 50 °C) použijeme 12 zkumavek pro vzorek a 12 zkumavek pro kontrolu
možného spontánního štěpení PNPP. Do všech 12 zkumavek pro vzorek pipetujeme po 1 ml
buněčné suspenze (A620=75%) a 0,6 ml Tris-HCl pufru. Buňky krátce temperujeme a přidáme
0,4 ml PNPP. Do dalších 12 zkumavek (kontrola) pipetujeme místo buněk stejný objem pufru
a přidáme 0,4 ml PNPP pro sledování možného rozkladu při určité teplotě inkubace v čase.
Enzymatickou reakci ve vzorcích i spontánní štěpení v kontrole zastavíme po 0, 5, 10, 15, 20
a 30 min inkubace přídavkem 2 ml 1M NaOH k reakční směsi. Pro každý časový interval
použijeme dvě opakování. Bakteriální buňky odstraníme centrifugací (6000 ot. min-1
, 10 min).
Supernatant přelijeme do skleněných zkumavek a stanovíme koncentraci uvolněného PNP na
spektrofotometru při  = 400 nm (faktorizace spektrofotometru při 100 g PNP.ml-1
)
Vyhodnocení a závěr
Sestrojíme křivku závislosti koncentrace uvolněného PNP (g.ml­1
) na době inkubace (min)
pro jednotlivé inkubační teploty (po odečtu hodnot spontánního rozkladu PNPP). Posoudíme
vliv zvolené teploty na fosfatázovou aktivitu buněk studovaného kmene.
Literatura
Čoupková, D., Hoďák, K. (1975). Phosphatase activity of Staphylococcus aureus strains.
Folia Fac.Sci.Nat.Univ.Purk.Brunensis XVI: 79-88.
44
9 Oxidační aktivita bakteriálních buněk
Úvod
Kyslíková elektroda je široce využívána v biochemii a fyziologii bakterií k měření rychlosti
spotřeby kyslíku na oxidaci substrátu. Tato metoda je velmi citlivá a rychlá v porovnání
s metodami manometrickými. Měření spotřeby kyslíku probíhá kontinuálně a je
dokumentováno záznamem.Výhodou tohoto měření je skutečnost, že spotřebu kyslíku
můžeme sledovat od prvních okamžiků kontaktu buněk se substrátem. Měření spotřeby
kyslíku probíhá za přítomnosti CO2, tedy za podmínek, které jsou velice blízké podmínkám
přirozeným. Spotřeba kyslíku je stanovena na základě elektrochemické reakce, nikoliv na
výměně plynů mezi tekutou a plynnou fází. S výhodou se využívá modifikované Clarkovy
elektrody Ag/AgCl , kryté polyetylenovou membránou, přičemž jako elektrolyt slouží 0,2M
KCl.
9.1 Vliv složení kultivačního média na oxidační aktivitu bakterií
Princip metody
Stanovení oxidační aktivity buněk Staphylococcus aureus s využitím modifikované Clarkovy
elektrody.
Materiál a zařízení
ˇ Mikrooganizmy:
kmeny Staphylococcus aureus SA812, NCTC 8511, S26, SA66
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB1,MPA 1, MPB1 s glukózou (1% w/v), MPA1 s glukózou (1% w/v), pufr fosfátový
(0,02M, pH=7,2), nasycený roztok Na2SO3, 1% (w/v) roztoky cukrů ve fosfátovém pufru,
elektrolyt 0,2M KCl.
ˇ Přístroje :
chlazená centrifuga, modifikovaná Clarkova elektroda , skleněná reakční nádobka s dvojitou
stěnou a bočním ramínkem, ultratermostat, jednokanálový zapisovač, elektromagnetická
míchačka, zařízení pro provzdušňování, spektrofotometr Spekol 11, magnetická míchačka.
45
Postup
Příprava bakteriální suspenze: Bakteriální buňky odebereme z čerstvé zásobní kultury na
šikmém agaru a kultivujeme v 20 ml MPB 1 nebo v MPB 1 s glukózou při 30°C po dobu 24
h. Připravené inokulum vyséváme po 0,2 ml na Petriho misky s MPA nebo MPA s glukózou,
rozetřeme po povrchu agaru sterilní skleněnou hokejkou a kultivujeme po dobu 38 h při
teplotě 30°C (použijeme asi 10-15 misek pro každé médium). Po kultivaci setřeme nárůst
buněk hokejkou do kádinky, přidáme 20 ml 0,2 M fosfátového pufru a lžičku skleněných
kuliček. Buňky protřepeme a vytvoříme buněčnou suspenzi. Doplníme do objemu 100 ml
0,2M fosfátovým pufrem a centrifugujeme v chlazené centrifuze při 5000 ot.min-1
po dobu 15
min. Sediment buněk resuspendujeme v malém objemu fosfátového pufru a buňky se stěny
centrifugační zkumavky odstraníme silnou tyčinkou se zaoblenými konci nebo dnem
zkumavky. Přidáme pufr do objemu 100 ml a buňky opět centrifugujeme. Tento proces
,,promývání buněk" ve fosfátovém pufru opakujeme nejméně dvakrát. Buněčný sediment
z posledního promytí resuspendujeme opět v malém objemu 0,2M fosfátového pufru a shluky
buněk odstraníme protřepáním se skleněnými kuličkami. Buňky zředíme ve fosfátovém pufru
tak, aby 1 ml husté suspenze obsahoval přibližně 20 mg sušiny (na spektrofotometru při
vlnové délce 600 nm nastavíme hustotu suspenze na 99,5%). Oxidační aktivita buněk se
podstatně nemění během 24 h (suspenze uložena při +4°C).
Měření spotřeby O2 bude prováděno modifikovanou Clarkovou elektrodou (chyba měření
připravenou elektrodou se má pohybovat kolem 3% a je stanovena v prostředí bez kyslíku po
přidání nasyceného roztoku Na2S2O3). Polarizační napětí volíme 800 mV, citlivost elektrody
je 5 mV a rychlost posunu záznamového papíru nastavíme na 2 cm . min-1
. Čistá elektroda je
pokryta polypropylenou membránou upevněnou kroužkem. Reakční nádobku upevníme do
stojanu tak, aby byla v kontaktu s magneticku míchačkou. Nádobka obsahuje 3,5 ml dokonale
provzdušněného fosfátového pufru a je temperována na teplotu 30°C napojením pláště na
ultratermostat. Elektrodu ponoříme do naplněné reakční nádobky s míchadlem. K vyrovnání
koncentrace O2 v pufru mícháme obsah nádobky po dobu 2 min. Potom přidáme 0,05 ml
bakteriální suspenze (bočním ramínkem nádobky) a po dobu 3 min sledujeme spotřebu
kyslíku nutného k oxidaci endogenního substrátu. Spotřebu kyslíku zaznamenáváme pomocí
jednokanálového zapisovače. Po 3 minutách sledování oxidace endogenního substrátu
přidáme 0,05 ml exogenního uhlíkatého substrátu a pokračujeme v měření po dobu dalších 3
min. Měření provedeme pro buňky kultivované na MPA a na MPA s glukózou. Jako exogenní
substráty doporučujeme použít D-glukózu, D-arabinózu, glycerol, Na-mléčnan a Na-acetát.
Vyhodnocení a závěr
Naměřené hodnoty spotřeby kyslíku pro oxidaci endogenního substrátu a po přídavku
exogenního substrátu zaznamenáme do tabulky. Výpočet spotřeby kyslíku pro oxidaci
jednotlivých substrátů vyjádříme hodnotou QO2 . Za podmínek našeho pokusu provedeme
výpočet podle následující rovnice:
a × V × p × 60
QO2 = , kde
D × t × v × sušina
a = l O2 v 1 ml fosfátovém pufru při 30°C (v 1 litru 0,02M fosfátového pufru při 30°C je
obsaženo 7,14 mg O2) ,
V = celkový objem kapaliny v reakční nádobce (v ml),
v = celkový objem přidané buněčné suspenze a substrátu (v ml),
p = pokles obsahu kyslíku v mm (odečteme ze záznamu zapisovače)
46
d = délka záznamu na zapisovači v mm
t = doba vyjádřená na záznamu v mm
sušina = suchá hmotnost bakteriální suspenze v mg.ml-1
Do tabulky zaznamenáme hodnoty QO2 pro bakteriální buňky kultivované na MPA a na MPA
s glukózou. Vyhodnoťte vliv glukózy v kultivačním médiu na oxidační aktivitu bakteriálních
buněk.
Literatura
Hanovcová,I., Hoďák,K., Němec,M. (1975). Staphylococcal oxidation of hydrocarbons
measured by oxygraphy. Folia Fac.Sci.Nat.Univ.Purk.Brunensis XVI (49) : 33-47.
9.2 Stanovení vlivu teploty na oxidační aktivitu kvasinek
Úvod
Kvasinka Yarrowia lipolytica je striktně aerobní a využívá n-alkany jako zdroj uhlíku. Bylo
zjištěno, že může oxidovat vznikající 1-alkenol specifickou, membránově vázanou alkohol
oxidázou. Rovněž velmi dobře byla popsána NAD(P) dependentní alkoholdehydrogenáza,
glycerol-3-P dehydrogenáza (NAD) a glycerol-3-P dehydrogenáza (FAD). Bylo zjištěno, že
poslední dvě jmenované oxidorektutázy jsou inducibilní. Na rychlosti oxidace glycerolu se
může značnou měrou podílet teplota reakční směsi, hodnota pH prostředí a doba uchovávání
kvasinkové suspense (při +4°C).
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy :
Yarrowia lipolytica CCM 4510
ˇ Chemikálie a roztoky:
MEB, MEA, fosfátový pufr (0,05 M, pH=7,2), činidlo Coomassie Brilliant Blue G250,
standardy pro stanovení bílkovin (viz 2.1.), 1% (w/v) glycerol v destilované vodě
ˇ Přístroje:
termostat, třepačka s vodní lázní, chlazená centrifuga, modifikovaná Clarkova elektroda,
velká skleněná reakční nádobka s dvojitou stěnou a bočním ramínkem, ultratermostat,
jednokanálový zapisovač, elektromagnetická míchačka, zařízení pro provzdušňování,
spektrofotometr Spekol 11, spektrofotometr.
Postup
Příprava inokula a buněčné suspenze. 50 ml MEB naočkujeme plnou kličkou buněk
Y.lipolytica ze zásobního šikmého agaru MEA. Buňky kultivujeme po dobu 24 h při 30°C. 1,5
ml připraveného inokula přeneseme do 150 ml MEB a kultivujeme na třepačce ve vodní lázni
po dobu 20 h při teplotě 30°C. Narostlou kvasinkovou kulturu centrifugujeme při 5000
ot.min.-1
po dobu 40 min (teplota +4°C). Buněčný sediment opakovaně promyjeme v 0,05M
fosfátovém pufru (pH=7,2). Buněčnou suspenzi po posledním promytí ředíme ve fosfátovém
pufru na hustotu OD620 = 90% a stanovíme koncentraci bílkovin metodou Bradfordové.
Stanovení oxidázové aktivity. Měření provádíme modifikovanou Clarkovou elektrodou
47
(nastavení viz 9.1.).Teplotu reakční směsi měníme tak, že nastavíme ultratermostat na teplotu
30, 37, 40, 45, 47 resp 50°C. Do reakční nádobky s 3,2 ml vytemperovaného fosfátového
pufru (nasycený kyslíkem) pipetujeme 20 l buněčné suspenze. Po dobu 2 minut sledujeme
spotřebu kyslíku na oxidaci endogenního substrátu. Potom přidáme 10 l vytemperovaného
1% glycerolu a zaznamenáme spotřebu kyslíku po přidání tohoto exogenního substrátu (2
minuty). Spotřebu kyslíku korigujeme rozpustností kyslíku v pufru za dané teploty.
Vyhodnocení a závěr
Naměřené hodnoty spotřeby kyslíku na oxidaci endogenního substrátu a exogenního substrátu
zaznamenáme do tabulky. Oxidační aktivitu vyjádříme v mmol O2 . mg-1
bílkoviny. min-1
.
Průkaznost vlivu teplot na oxidační aktivitu buněk vyhodnotíme statisticky.
Literatura
Formánek,P., Horáková,D. (2000). Oxidase activity of Yarrowia lipolytica W1 cells. Scripta
Fac.Sci.Nat.Univ.Masaryk.Brun. 26: 3-11.
48
10 Lipolytická aktivita
Úvod
Lipolytické enzymy jsou definovány jako karboxylesterázy, které hydrolyzují acylglyceroly.
Lipolytické enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly s uhlíkatým řetězcem mastných kyselin
kratším než 10 C, jsou považovány za esterázy nebo karboxylázy (EC 3.1.1.1). Enzymy, které
hydrolyzují acylglyceroly obsahující řetězce mastných kyselin s počtem uhlíků 10, jsou
označovány jako lipázy nebo také jako triacylglycerol acylhydrolázy (EC 3.1.1.3). Esterázy
jsou aktivní ve vodných roztocích, zatímco ,,pravé" lipázy jsou aktivnější spíše na rozhraní
voda-lipid než ve vodní fázi (tzv. interfacial activation phenomenon).
Specifita lipolytického enzymu je kontrolována
a) molekulárními vlastnostmi enzymu,
b) strukturou substrátu,
c) faktory ovlivňujícími vazbu enzymu k substrátu.
Lipolytické enzymy jsou děleny do tří skupin:
První skupina je nespecifická. Lipolytické enzymy této skupiny uvolňují mastné kyseliny ze
všech tří pozic acylglycerolu a kompletně hydrolyzují triacylglyceroly na mastné kyseliny a
glycerol.
Druhá skupina lipolytických enzymů je 1,3-specifická. Uvolňuje mastné kyseliny z vnějších
pozic triacylglycerolu a dává vznik 1,2-diacylglycerolům, 2,3-diacylglycerolům a 2-
monoacylglycerolům za uvolnění mastných kyselin. Dlouhá inkubace triacylglycerolu s 1,3-
specifickými lipázami vede většinou k úplné hydrolýze triacylglycerolů na mastné kyseliny a
glycerol.
Třetí skupina zahrnuje lipolytické enzymy, které preferují určité mastné kyseliny. Jde
například o lipázu B izolovanou z kvasinkovité houby Geotrichum candidum. Tyto lipázy se
však u bakterií nevyskytují.
Většina bakteriálních lipáz patří mezi extracelulární enzymy, které jsou uvolňovány do
prostředí během pozdní exponenciální a časné stacionární růstové fáze. Většina
mikroorganizmů může produkovat více než jeden typ extracelulárních lipáz, které hydrolyzují
různě dlouhé řetězce mastných kyselin. Produkci lipáz ovlivňuje celá řada vnějších faktorů,
zejména teplota, pH prostředí, zdroje dusíku a tuků, koncentrace anorganických solí a
dostupnost kyslíku. Stanovení lipolytické aktivity u některých bakterií je důležitý
diagnostický test. Kvantitativní stanovení aktivity lipáz je možné provádět titrimetricky,
fotometricky nebo fluorescenčními metodami, např. s využitím 4-metyl-umbelliferon
heptanoátu. Fotometrické stanovení je založeno na uvolnění chromogenní složky substrátu,
např. 4-nitrofenylpalmitátu, po působení enzymu. Základem titrimetrického průkazu
lipolytické aktivity je přesné stanovení množství uvolněných mastných kyselin. Jako substrát
je obvykle používán olivový olej nebo jiné přirozené tuky. Důležitým faktorem ovlivňujícím
přesnost stanovení je příprava dokonale emulgovaného a stabilního substrátu.
10.1 Izolace a aktivita lipáz u buněk S.aureus
Princip metody
Titrační stanovení volných mastných kyselin uvolněných v procesu působení částečně
purifikovaných lipáz na Tween 80 .
49
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
S.aureus CCM 5771, S. aureus SA 812, S. aureus SA 66, S. aureus NCTC 8511
ˇ Chemikálie a roztoky:
kultivační médium KM, MPB 1; Tris-HCl pufr (0,05M, pH=7,2); 96% etanol; ledová
kyselina octová; 0,1M NaOH; 0,05M NaOH; 0,1M HCl; Tween 80 (polyoxyetylenesorbitan
monooleat, 1% emulze v 0,05M Tris-HCl pufru, homogenizovaný); směs 96% etanol : aceton
v poměru 1:1; deionizovaná voda;
ˇ Přístroje:
termostat s provzdušňovacím zařízením, chlazená centrifuga, pH metr s elektrodou upravenou
pro nevodné prostředí, vodní lázeň, magnetická míchačka, byreta
Postup
Izolace lipázy
Ze zásobní kultury naočkujeme cca 108
buněk bakterií do 20 ml MPB 1 a kultivujeme 18
hodin při 30 °C. Kultivační médium (500 ml) naočkujeme 20 ml narostlého inokula a
pokračujeme v kultivaci 24 h při stejné teplotě za intenzivního provzdušňování. Po skončené
kultivaci buňky odcentrifugujeme na chlazené centrifuze (+4 °C) při 8000 ot..min-1
po dobu
20 min. Čirý supernatant umístíme na 6 hodin do chladničky a potom provedeme izolaci
lipáz. Při izolaci postupujeme podle následujícího schématu:
500 ml ochlazeného supernatantu (pH upraveno ledovou kys. octovou na hodnotu 4,3)
+
500 ml 96% etanolu (+4°C)

uložit na 24 h do +4 °C

centrifugace (6000 otáček .min-1
, 30 min, +4°C)

sediment + 400 ml deionizované vody (pH upravit na 8,9 pomocí 0,1M NaOH)

centrifugace (3000 otáček .min-1
, 20 min, +4 °C)

supernatant- pomalu upravit pH na 4,3 pomocí 0,1M HCl

centrifugace 1500 otáček .min-1
, 20 min, +4 °C

sediment rozpustit ve 40 ml 0,05M Tris-HCl pufru
Stanovení lipolytické aktivity. Do Erlenmayerových baněk (100 ml) napipetujeme 5 ml Tris-
HCl pufru, 0,4 ml vzorku a temperujeme 15 min ve vodní lázni (37 °C). Potom přidáme 5 ml
1% Tween 80 vytemperovaného na 37 °C. Enzymatickou reakci zastavíme po 20 min
přidáním 20 ml směsi aceton: etanol (1:1). Množství uvolněných mastných kyselin stanovíme
titrací 0,05M NaOH. Jako kontrola slouží Tris-HCl pufr (5,4 ml) s 5 ml 1% Tween 80.
Stanovení volných mastných kyselin provedeme titrací 0,05M NaOH do hodnoty pH=12.
K měření hodnoty pH používáme elektrodu upravenou pro nevodné prostředí (úprava
elektrody podle Hoďák, Němec, 1985). Spotřeba 0,05M NaOH vyjádříme v molech (po
odečtu spotřeby 0,05 M NaOH při titraci kontroly).
Koncentraci bílkovin ve vzorku stanovíme metodou dle Bradfordové (viz 2.1)
50
Vyhodnocení a závěr
Porovnáme aktivitu lipáz jednotlivých kmenů S.aureus na základě :
1) Stanovení objemové aktivity (mol spotřebovaného NaOH : objemu vzorku v reakční
směsi),
2) Stanovení specifické aktivity (objemová aktivita vztažena na mg bílkoviny vzorku).
Hodnoty vyneseme do tabulky a statisticky vyhodnotíme průkaznost rozdílů v aktivitě lipázy
u studovaných kmenů.
Literatura
Ota,Y., Yamada,K.(1967). Lipase from Candida lipolytica.Part III.Further studies on the
activation of the enzyme systems with bile or calcium salts. Agric.Biol.Chem.31:809-810.
Hoďák,K., Němec,M. (1985). Praktikum z fyziologie bakterií.Skriptum UJEPBrno.
10.2 Stanovení exolipáz s využitím chromogenního substrátu
Princip metody
Fotometrické stanovení lipolytické aktivity s využitím štěpení umělého chromogenního
substrátu.
Materiál a metody
ˇ Mikroorganizmy :
Serratia marcescens CCM 303
ˇ Chemikálie a roztoky:
Minimální médium M9, 4-nitrofenylpalmitát, izopropanol, pufr fosfátový (0,05 M,
pH=8,0),deoxycholát sodný, arabská guma.
ˇ Přístroje:
termostat s provzdušňovacím zařízením, chlazená centrifuga, pH metr s elektrodou pro
nevodné prostředí, vodní lázeň, magnetická míchačka, byreta
Postup
Kultivace mikroorganizmů. Minimální syntetické médium M9 naočkujeme buňkami kmene
S.marcescens tak, aby výsledná hustota buněk dosáhla hodnoty 0,5% při 580 nm. Kultivujeme
na třepačce ve vodní lázni při teplotě 30°C po dobu 24 h . Buňky odstřeďujeme (+4°C) 15
min při 5000 ot.min-1
. Supernatant použijeme pro stanovení aktivity exolipáz.
Příprava chromogenního substrátu. 10 ml izopropanolu obsahujícím 30 mg 4-nitrofenyl-
palmitátu smícháme s 90 ml 0,05M fosfátového pufru (pH=8,0), který obsahuje 207 mg
deoxycholátu sodného a 100 mg arabské gumy.
Stanovení lipázové aktivity. 2,4 ml čerstvého roztoku chromogenního substrátu temperujeme
na teplotu 37°C. Poté přidáme 0,1 ml supernatantu. Inkubujeme 15 min při teplotě 37°C.
Reakci zastavíme přidáním 2,5 ml 1M NaOH. Koncentraci uvolněného 4-nitrofenolu
stanovíme na fotometru při vlnové délce 400 nm (faktorizace proti 4-nitrofenolu). Naměřené
hodnoty korigujeme kontrolou, ve které supernatant nahradíme čerstvým kultivačním médiem
M9.
Vyhodnocení a závěr
Výpočet aktivity exolipázy. Jedna jednotka enzymu je definována jako 1 nmol 4-nitrofenolu
(enzymaticky uvolněný ze substrátu) ml-1
.min-1
.
51
Literatura
Beisson,F.,Tiss,A.,Riviere,C.,Verger,R. (2000). Methods for lipase detection and assay: A
critical review. European Journal of Lipid Science and Technology,102(2): 133-153.
Chen,L.,Daniel,R.M., Coolbear,T. (2003). Detection and impact of protease and lipase
activities in milk and milk powders. Internatiol Dairy Journal 13(4) : 255-275 .
Jaeger,K.E.,Ransac,S.,Dijkstra,B.W., Colson,C.,van Heuvel, M., Misset,O.(1994).
Bacterial lipases. FEMS Microbiol.Rev.,15(1) :29-63
52
11 Enzymatická aktivita půdního vzorku
11.1 Stanovení proteázové aktivity
Úvod
Proteázy, detekované u mikroorganizmů, rostlin a živočichů, katalyzují hydrolýzu proteinů na
peptidy a oligopeptidů na aminokyseliny. Z důvodu vysoké molekulové hmotnosti proteinů se
uskutečňuje první enzymatický stupeň degradace proteinů na vnější straně mikrobiální buňky.
Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, jako např. aminokyseliny, mohou být
transportovány do buněk specifickými transportními systémy. Zde jsou potom aminokyseliny
deaminovány. Projevem degradace proteinů v půdě je uvolňování amoniaku. Proteázy v půdě
jsou přítomné jak v živých a aktivních buňkách, tak i v mrtvých buňkách nebo ve formě
volných enzymů adsorbovaných k organickým, anorganickým nebo organominerálním
částicím. Nejvyšší proteázová aktivita v půdě může být zaznamenána při pH =8 a teplotním
optimu okolo 55 °C. Při teplotě blížící se 60 °C jsou však enzymy již denaturovány. Při sušení
nebo skladování různých vzorků půd na vzduchu (teplota ­8 až 22 °C) dochází k výraznému
snížení jejich proteázové aktivity. V přírodě dochází ke změnám proteázové aktivity půdy
v závislosti na ročním období, tedy bez výrazné korelace se změnami mikrobiální populace.
Proteázová aktivita se snižuje v hlubších vrstvách půdy a naopak vzrůstá po obohacení půdy
organickými sloučeninami přidanými např. ve formě slámy. Proteázy můžeme z půdy
extrahovat a stanovit jejich aktivitu. Pro stanovení proteázové aktivity v půdě lze využít různé
substráty jako kasein, azokasein, želatinu, peptidy, albuminy a různé postupy lišící se
v inkubačních podmínkách vzorků a v délce inkubace (2 až 16 h).
Princip metody
Metoda podle Ladd and Butler (1972) je založena na stanovení TCA-rozpustných derivátů
tyrozinu uvolněných po inkubaci půdy s kaseinátem sodným po dobu 2 h při 50 °C s využitím
Folin-Ciocalteu činidla. Metoda stanovení proteázové aktivity půdního vzorku může být
modifikována změnou hodnotou pH prostředí a teplotních podmínek reakce. Různé typy půd
vykazují významné rozdíly v proteázové aktivitě i za podmínek metody podle Ladd a Butler
(1972)
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
půdní vzorky
ˇ Chemikálie a roztoky:
Tris-HCl pufr (0,05 M, pH=8,1), 2% kaseinát sodný, 15% trichloroctová kyselina (TCA),
činidlo alkalické, činidlo Folin-Ciocalteu (33%), standardní roztok tyrozinu (500 g.ml-1
)
ˇ Přístroje:
spektrofotometr, vodní lázeň s třepačkou, centrifuga
53
Postup
Příprava vzorku. Vlhkou půdu přesijeme přes síto (průměr otvorů 2 mm). 1 g takto
homogenizované půdy nasypeme do centrifugační zkumavky se závitem (25 ml) a přidáme 5
ml 0,05M Tris-HCl pufru (pH=8,1) a 5 ml 2% kaseinátu sodného. Zkumavky uzavřeme,
obsah protřepeme a vzorek inkubujeme 2 h při 50 °C ve vodní lázni s třepačkou. Na konci
kultivace přidáme 5 ml 15% TCA a obsah důkladně protřepeme.
Příprava kontroly. Navážíme 1 g homogenizované půdy a přidáme 5 ml 0,05 Tris-HCl pufru
(pH=8,1). Zkumavky důkladně protřepeme a inkubujeme společně se vzorkem půdy ve vodní
lázni s třepačkou při teplotě 55°C. Ke kontrolnímu vzorku přidáme na konci kultivace 5 ml
2% kaseinátu sodného a ihned přidáme 5 ml 15% TCA.
Stanovení. Vzorek i kontrolu centrifugujeme při 10 000 ­ 12 000 ot. min-1
po dobu 10 min. Ze
zkumavek opatrně odpipetujeme 5 ml čirého supernatantu , přidáme 7,5 ml alkalického
činidla a inkubujeme 15 min při pokojové teplotě. Potom přidáme 5 ml Folin-Ciocalteu
činidla, směs zfiltrujeme přes papírový filtr do skleněné zkumavky. Absorbanci vzorku i
kontroly změříme nejdříve po 1h při vlnové délce 700 nm (naměřené hodnoty absorbance jsou
pak konstantní po dobu několika dalších hodin).
Příprava kalibrační křivky. Do skleněných zkumavek pipetujeme 0,1,2,3,4,5 ml standardního
roztoku tyrozinu. Do každé zkumavky přidáme 5 ml kaseinátu sodného a všechny zkumavky
doplníme do objemu 10 ml 0,05M Tris-HCl pufrem. Přidáme 5 ml 15% roztoku TCA a
provedeme měření jako u vzorku a kontroly. Kalibrační křivku připravujeme pro každou
analýzu!!
Pozn. Supernatanty můžeme uchovávat max. po dobu 5 h při teplotě +4°C.Fumigace chloroformem nemá vliv na
proteázovou aktivitu půdních vzorků.
Vyhodnocení a závěr
Naměřené hodnoty pro vzorky korigujeme hodnotami naměřenými v kontrole. Výpočet
provedeme ze vztahu :
C × 15
proteázová aktivita = sušina (g tyrozinu .g-1
sušina 2 h-1
)
kde sušina je suchá váha 1 g vlhké půdy, 15 je konečný objem roztoku přidaného k půdnímu
vzorku,C je naměřená koncentrace tyrozinu (g . ml-1
supernatantu nebo filtrátu).
Literatura
Alef,K.,Nannipieri,P. (1995). Protease activity. In Methods in Applied Soil Microbiolgy and
Biochemistry (Alef,K.,Nannipieri,P.Eds.), Academic Press,Harcourt Brace and Company
Publishers,London : 313-315.
Ladd, J.N., Butler, J.H.A. (1972). Short-term assays of soil proteolytic enzyme activities
using proteins and dipeptide derivatives as substrates. Soil Biol. Biochem. 4: 19-30.
54
11.2 Stanovení ureázové aktivity I.
Úvod
Enzym ureáza katalyzuje hydrolýzu močoviny na CO2 a NH3 v průběhu reakce založené na
tvorbě karbamátů jako intermediátů.
H2NCONH2 + H2O  2NH3 + CO2
Enzym je produkován nejen mikrobiálními buňkami, ale i rostlinnými a živočišnými
buňkami. Může katalyzovat také hydrolýzu hydroxymočoviny, dihydroxymočoviny a
semikarbazidu. Tento enzym obsahuje nikl a jeho molekulová hmotnost se pohybuje
v rozmezí 151 000 až 480 000 Da. Pro stanovení ureázové aktivity půdy byla navržena celá
řada metod. Principem těchto stanovení je nejčastěji sledování uvolněného amoniaku. Jiné
metody stanovují zbytkovou močovinu po hydrolýze půdy. Autoři navržených metod nejsou
jednotní v názoru na pH optimum ureázové aktivity v půdě. Za pH optimum bývá považována
jak hodnota pH v rozmezí 6 až 7, tak i v rozmezí 8,8 až 10. Ureáza v půdě bývá vázaná na
půdní organickou hmotu a půdní minerály. Teplotní optimum pro enzymatickou reakci se
pohybuje kolem 60 °C a ureáza samotná je denaturovaná při 70 °C. Inkubační teplota vzorků
pro stanovení ureázové aktivity se rovněž pohybuje v širokém teplotním rozmezí 15° až 42 °C
(nejčastěji 30 °C). Ureáza extrahovaná z půdy je rezistentní k teplotní a proteolytické
denaturaci, neboť často vytváří vysokomolekulární komplexy s organickými složkami půdy.
Aktivita ureázy v půdě je velmi stabilní a málokdy je ovlivňována sušením půdy na vzduchu,
zářením nebo skladováním půdy při teplotě v rozmezí ­60°C až + 22°C. Aktivita ureázy
v půdě významně nekoreluje s obsahem půdní biomasy a může být různým způsobem
ovlivňována těžkými kovy, koncentrací kyslíku a obsahem dusíku v různých typech půd.
Značná pozornost je věnována studiu inhibitorů ureázové aktivity, které mohou být využívány
v zemědělství k zabránění průběhu rychlé hydrolýzy močoviny po hnojení.
Princip metody
Metoda je založena na stanovení amoniaku uvolněného po inkubaci půdních vzorků
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
půdní vzorky
ˇ Chemikálie a roztoky:
toluen, Tris-HCl pufr (0,05 M ,pH=9,0), standard NH4-N (50g NH4-N ml-1
), činidla ke
stanovení NH4-N, roztok ke stanovení ureázy, 0,2 M močovina, MgO vysušený při 600-
700°C po dobu 2 h (po vychlazení uložit do exikátoru se silikagelem), 0,005 M H2SO4
ˇ Přístroje:
pH-metr, titrační zařízení (nejlépe automatické), inkubátor, zařízení k destilaci parou.
55
Postup (provádíme v digestoři s odtahem)
Příprava vzorku. 5 g vlhké homogenizované půdy vsypeme do odměrné baňky o objemu 50
ml, přidáme 0,2 ml toluenu a 9 ml Tris-HCl pufru (pH=9,0). Obsah v baňce promícháme a
přidáme 1 ml močoviny (0,2M) Intensivně protřepeme (cca 5 s). Potom baňku uzavřeme
zátkou a inkubujeme po dobu 2 h při teplotě 37 °C. Po inkubaci půdního vzorku přidáme
přibližně 35 ml roztoku ke stanovení ureázy (KCl + Ag2SO4). Intenzivně třepeme 5s a potom
baňku ponecháme stát přibližně po dobu 5 min v digestoři při pokojové teplotě. Objem vzorku
upravíme na 50 ml dalším přídavkem roztoku pro stanovení ureázy.
Příprava kontroly. Celý postup je shodný jako ve vzorku. Pouze po přidání 35 ml roztoku pro
stanovení ureázy přidáme 1 ml 0,2 M močoviny.
Pozn. Doporučuje se provádět stanovení alespoň ve třech opakováních. Reakce má lineární
průběh po dobu 5 h.
Stanovení uvolněného amoniaku. Do Erlenmayerovy baňky pipetujeme 5 ml indikátoru
s kyselinou boritou. Do destilační baňky (objem 100 ml) napipetujeme 20 ml vytvořené půdní
suspenze a přidáme 0,2g MgO. Destilujeme parou, destilát jímáme do Erlenmayerovy baňky
s indikátorem do objemu 30 ml. Destilát titrujeme 0,005 M H2SO4 (1 ml 0,005M kyseliny
sírové odpovídá 70 g NH4-N).
Vyhodnocení a závěr
Provedeme výpočet uvolněného NH4-N po korekci naměřených výsledků kontrolou.Výpočet
provedeme podle vztahu :
C × 50
Ureázová aktivita = (g NH4-N .g-1
sušina 2 h-1
)
sušina × 5
kde sušina je suchá váha 1 g vlhké půdy, 50 je celkový objem půdní suspenze, 5 je hmotnost
použité půdy v testu, C je naměřená koncentrace NH4-N(g NH4-N ml ­1
půdní suspenze ).
Literatura
Tabatabai, M.A., Bremner, J.M. (1972). Assay of urease activity in soil. Soil
Biol.Biochem.4 : 479-487.
11.3 Stanovení ureázové aktivity II.
Princip metody
Metoda je založena na kolorimetrickém stanovení amoniaku po inkubaci půdních vzorků
s močovinou.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
půdní vzorky
56
ˇ Chemikálie a roztoky:
močovina (2,4 g ve 500 ml destilované vody), roztok salicylátu sodného, roztok KCl,0,3M
NaOH, 0,1 % roztok dichloroisokyanidu sodného, borátový pufr (pH=10), standardy NH4-N
(I + II).
ˇ Přístroje:
pH-metr,spektrofotometr, třepačka
Postup
Postup pro ,,nepufrovanou metodu"
5 g půdního vzorku (homogenizovaná vlhká půda) vysypeme do Erlenmayerovy baňky o
objemu 100 ml. Přidáme 2,5 ml roztoku močoviny. Uzavřenou baňku inkubujeme po dobu 2 h
při 37°C. Po inkubaci přidáme 50 ml roztoku KCl a baňku umístíme na 30 min. do třepačky.
Vzniklou suspenzi filtrujeme přes papírový filtr a ve filtrátu stanovíme koncentraci
uvolněného amoniaku. Kontrolní vzorek připravíme tak, že močovinu přidáme těsně před
přidáním roztoku roztoku KCl (tedy až na konci kultivace).
Pozn. Doporučují se vždy tři opakování.
Stanovení amoniaku:1 ml čistého filtrátu pipetujeme do Erlenmayerovy baňky o objemu 50
ml. Přidáme 9 ml destilované vody, 5 ml roztoku Na-salicylát/NaOH a 2 ml roztoku
dichlorokyanidu sodného. Baňku ponecháme 30 min. stát při pokojové teplotě.
Kolorimetrické stanovení provádíme při vlnové délce 690 nm.
Postup pro ,,pufrovanou metodu"
Do Erlenmayerovy baňky o objemu 100 ml navážíme 5g vlhké půdy (viz výše), přidáme
2,5ml roztoku močoviny a 20 ml borátového pufru. Další kroky odpovídají postupu
popsanému pro ,,nepufrovanou metodu" s tím rozdílem, že na konci inkubace přidáme jen 30
ml roztoku KCl.
Kalibrační křivky
1 ml standardu NH4-N (II ) ve zkumavkách zředíme 9 ml destilované vody a vypočteme
koncentrace (0, 1, 1,5, 2, 2,5 g NH4-N ml ­1
)
Vyhodnocení a závěr
Naměřené výsledky korigujeme slepým vzorkem a vypočteme ureázovou aktivitu podle
vztahu :
g NH4-N .ml ­1
× V × 10
= ureázová aktivita (g NH4-N g-1
sušina 2 h-1
)
sušina × 5
kde sušina je suchá hmotnost 1g vlhké půdy, V je celkový objem extraktu (52,5 ml), 10 je
ředící faktor a 5 je hmotnost půdy, která byla použita k analýze.
Pozn. Ureázová aktivita půdy je vyšší při stanovení ,,pufrovanou metodou".
Literatura
Kandeler,E., Gerber,H. (1988). Short-term assay of soil urease activity using colorimetric
determination of ammonium. Biol.Fertil. Soils, 6: 68-72.
57
11.4 Stanovení celulázové aktivity I
Úvod
Celulóza je obvyklým strukturálním polysacharidem ve stěnách rostlinných buněk.
Mikrobiální degradace celulózy patří k významným přírodním procesům, které se podílejí na
likvidaci rostlinných zbytků. Po chemické stránce je celulóza lineárním polymerem D-
glukózy s (1-4) glukosidickými vazbami. Molekulová hmotnost celulózy se podle zdroje
pohybuje mezi 50 000 a 250 000. Je zajímavé, že celulóza má vysokou afinitu k vodě, ale je
v ní zcela nerozpustná. Enzym celuláza katalyzuje hydrolýzu celulózy na D-glukózu a je
tvořena nejméně třemi enzymy : endo--1,4-glukanáza (EC 3.2.1.4); exo--1,4-glukanáza
(EC 3.2.1.91) a -glukosidáza (EC 3.2.1.22). Exocelulázy se váží ke krystalické celulóze a
štěpí celulooligosacharidy od neredukovaného konce celulózové molekuly. Endocelulázy
štěpí glukosidické vazby mezi nekrystalickými částmi celulózy, -glukosidáza odštěpuje
glukózu z celulooligosacharidů a aryl--glukosidů. Citlivost celulózy k enzymatickému ataku
je dána stupněm její krystalizace, charakterem navázaných látek a velikostí povrchu.
Degradace celulózy v půdě probíhá velmi pomalu. Rychlost degradace celulózy je ovlivněna
zejména obsahem vody v půdě, hodnotou pH a teplotou prostředí. Všeobecně se uvádí, že
celulázy vykazují optimální aktivitu při pH 5-6 a teplotě v rozmezí 30 ­ 50°C. Celulázy
v půdě jsou nejčastěji produkovány houbami. Pouze 5 druhů rodu Actinomyces může na
celulóze růst a využívat ji jako jediný zdroj uhlíku. Významnými celulolytickými
mikroorganizmy v půdě jsou rovněž zástupci rodu Clostridium, kteří štěpí celulózu za
anaerobních podmínek.
Princip metody
Metoda je založena na stanovení redukujících cukrů po inkubaci půdního vzorku
s karboxymetylcelulózou po dobu 24 h při teplotě 50°C. Může být stanovena pouze aktivita
endonukleázy a -glukosidázy.
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
půdní vzorky
ˇ Chemikálie a roztoky:
Acetátový pufr (2M, pH= 5,5 ), roztok karboxymetylcelulózy (KMC), činidla pro stanovení
redukujících cukrů I, roztok glukozomonohydrátu (28 mg v 1000 ml dest.vody)
ˇ Přístroje :
spektrofotometr, inkubátor, vodní lázeň do 100°C
58
Postup
Příprava vzorků a kontroly.Vlhkou ornici a vlhkou lesní půdu odděleně protlačíme přes síto o
velikosti ok 2 mm. Do Erlenmayerovy baňky navážíme 10 g vlhké homogenizované ornice a
5 g lesní půdy. Přidáme 15 ml acetátového pufru a 15 ml KMC. Baňku uzavřeme a
inkubujeme 24 h při teplotě 50°C. Po inkubaci vytvořenou půdní suspenzi filtrujeme.
Současně připravíme kontrolu, ke které přidáváme 15ml KMC až po inkubaci bezprostředně
před filtrací. Filtrát ředíme tak, že 1 ml vzorku z orné půdy přidáme do 20 ml destilované
vody a 1 ml vzorky z lesní půdy přidáme do 30 ml destilované vody. Vzorky rozpipetujeme
po 1 ml do zkumavek, přidáme 1 ml činidla A a 1 ml činidla B (pH vzorků musí být vyšší než
10,5!) Uzavřeme zkumavky, promícháme a vaříme ve vodní lázni (100°C) po dobu 15 min.
Vzorky ochladíme ve vodní lázni na 20°C (chlazení cca 5 min.) a přidáme 5 ml činidla C (pH
nižší než 2). Promícháme a ponecháme při pokojové teplotě po dobu 60 min.Vzorky
proměříme na spektrofotometru při vlnové délce 690 nm (zbarvení je trvalé po dobu přibližně
30 min.!!)
Kalibrační křivka. Do zkumavek pipetujeme 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0 ml
glukózy (28 mg v 1000 ml dest.vody). Doplníme destilovanou vodou na 1 ml a stanovíme
redukující cukry (jako u vzorku).
Vyhodnocení a závěr
Vypočet ekvivalentů glukózy provedeme podle vztahu :
C × V × f
= ekvivalenty glukózy (g g-1
sušiny 24h-1
)
sw × sušiny
kde C je naměřená hodnota koncentrace glukózy (mg glukózy . ml-1
filtrátu), V je objem
suspenze (v tomto systému V=30 ml), f je ředící faktor (20 pro ornici a 40 pro lesní půdu), sw
je hmotnost mokré půdy (10g nebo 5 g), sušina představuje suchou hmotu 1 g vlhké půdy.
Porovnáme aktivitu celuláz sledovaných vzorků.
Pozn.Metoda je doporučena hlavně pro lesní půdy. Pro ornou půdu dává relativně nízké
hodnoty. Vysoušení vzorků na vzduchu snižuje enzymatickou aktivitu půdy.
Literatura
Schinner,F.,Von Mersi ,W. (1990). Xylanase-,CM-cellulase- and invertase activity in soil:
an improved method. Soil Biol.Biochem.22:511-515.
11.5 Stanovení celulázové aktivity II
Princip metody
Stanovení redukujících cukrů uvolněných po inkubaci půdních vzorků s celulózou. Touto
metodou lze stanovit celkovou celulázu (endoglukanázu, exoglukanázu a -glukosidázu).
Materiál a zařízení
ˇ Materiál:
půdní vzorky
ˇ Chemikálie a roztoky:
Acetátový pufr (0,1M, pH= 5,5), mikrokrystalická celulóza (MCC), činidla pro stanovení
redukujících cukrů II, roztok arzenát-molybdenát, standard glukózy.
59
ˇ Přístroje :
spektrofotometr, inkubátor,vodní lázeň do 100°C, centrifuga
Postup
Příprava vzorků a kontroly. 1 g vlhké půdy navážíme do Erlenmayerovy baňky (25 ml) a
přidáme 5 ml acetátového pufru a 0,5 g MCC. Uzavřeme baňku a inkubujeme na třepačce ve
vodní lázni při teplotě 40°C po dobu 16 h . Reakci zastavíme tak, že vzorek centrifugujeme
při 2500g po dobu 10 min. Kontrolu připravíme tak, že MCC přidáme až po inkubaci,
bezprostředně před centrifugací. Reakce provádíme vždy ve dvou opakováních. Stanovíme
redukující cukry v supernatantu: do testovací zkumavky pipetujeme 1 ml supernatantu a
přidáme 1 ml činidla . Zkumavky uzavřeme a vaříme (vroucí vodní lázeň) po dobu 20 min. Po
ochlazení přidáme 1 ml roztoku arzenát-molybdenan a dobře protřepeme. Přidáme 3 ml
destilované vody a měříme při vlnové délce 520 nm.
Kalibrační přímka: viz stanovení celulázové aktivity I.
Vyhodnocení a závěr
Zaznamenáme naměřené hodnoty pro vzorky a tyto korigujeme hodnotami pro kontrolu.
Provedeme výpočet :
C × V
= ekvivalenty glukózy (g . g-1
sušiny 16 h-1
)
sušina
kde C je naměřená koncentrace glukózy (g . ml-1
supernatantu), V je objem suspenze půdy
(v tomto experimentu V= 5,5 ml) a sušina je suchá hmotnost 1 g vlhké půdy.
Pozn.Enzymatická reakce je lineární po dobu 16h. Inkubace půdní suspenze s azidem brání
asimilaci glukózy půdními mikroorganizmy.
Literatura
Hope,C.F.A., Burns,R.G. (1987). Activity, origins and location of cellulase in a silt loam
soil. Biol.Fertil.Soils 5 :164-170.
60
12 Stanovení biodegradability ropných látek
Úvod
Na procesech biologické degradace ropných látek se podílí více než 70 rodů mikroorganizmů.
Bylo prokázáno, že v prostředí, které je kontaminováno ropnými uhlovodíky, procentuální
zastoupení degradátorů ropy a ropných uhlovodíků prudce stoupá. Vysoká rychlost
biodegradce je typická pouze pro nasycené uhlovodíky a lehké aromatické uhlovodíky.
Extrémně nízkou rychlostí jsou degradovány vysokomolekulární aromáty, asfaltické
uhlovodíky a pryskyřice. Anaerobní degradace uhlovodíků v přírodě probíhá jen velmi
pomalu. Pro úplnou mineralizaci uhlovodíků je vždy nutný tzv."respirační stupeň". Za
aerobních podmínek slouží kyslík jednak jako terminální akceptor elektronů, které jsou
uvolňovány během oxidace organického substrátu, jednak jako reaktant, při primárním ataku
uhlíkatého substrátu. Využívání molekulového kyslíku v mikrobiálních katabolických
reakcích je podmíněno specifickými enzymy ­ oxygenázami (monooxygenázy a
dioxygenázy). Předpověď degradace polutantu v aerobním prostředí vychází často
z laboratorní studie biodegradability, při níž může být sledována např. spotřeba kyslíku na
oxidaci kontaminující látky nebo produkce CO2 při úplné mineralizaci uhlíkatého substrátu.
Často je sledován i úbytek polutantu v závislosti na době inkubace vzorku, podmínkách
prostředí (pH, teplota, poměr uhlíku, dusíku a fosforu v prostředí, přítomnost aktivátorů
apod.), či stanovení primárních reakčních meziproduktů biodegradace.
12.1 Stanovení biologické rozložitelnosti hexadekanu s využitím
metody Oxi-Top
Princip metody
Manometrická metoda měření spotřeby kyslíku v průběhu oxidace organického substrátu
hexadekanu, který slouží jako jediný zdroj uhlíku.
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy :
Yarrowia lipolytica CCM 4510, Pseudomonas putida CCM 4307, Geotrichum
candidum CCM 8170.
ˇ Chemikálie a roztoky:
MPB 1, MEB, definované minerální medium DMA, hexadekan (zdroj uhlíku), NaOH,
pufr Tris-HCl (0,05M ,pH= 7,2) ,nitrifikační inhibitor NHP600 (WTW)
ˇ Přístroje :
zařízení Oxi-Top (WTW), kalibrované láhve WTW, měřící hlavy, gumová nádobka
na NaOH (odstranění CO2 z prostředí), vodní lázeň, termostat, chlazená centrifuga,
magnetická míchačka, termobox.
61
Postup
Příprava bakteriální suspenze. Ze zásobního šikmého agaru přeočkujeme cca 10 8
buněk (jedna
plná očkovací klička) do 20 ml MPB 1 (resp.MEB pro kvasinky). Kultivujeme při 30°C po
dobu 24 h. 2 ml připraveného inokula očkujeme 250 ml MPB1 (resp.MEB) a kultivujeme 16h
při teplotě 26°C za intenzivního třepání (125 kyvů .min-1
, amplituda 6). Narostlé buňky
centrifugujeme při 6000 ot.min-1
po dobu 20 min. Sediment buněk resuspendujeme ve
stejném objemu Tris-HCl a centrifugujeme. Promývání buněk opakujeme nejméně třikrát.
Buněčný sediment naředíme v DMA tak, aby zákal buněčné suspenze při vlnové délce 600
nm odpovídal 85%. Ze suspenze odebereme vzorky pro stanovení sušiny (viz.2.2).
Příprava vzorku. Do kalibrovaných láhví o objemu 500 ml pipetujeme 22,6 ml buněk v DMA
(O.D.600 = 85%), přidáme 0,1 ml sterilního hexadekanu a několik zrnek nitrifikačního
inhibitoru. Do láhve umístíme sterilní teflonové míchadlo a láhev uzavřeme gumovou
nádobkou se 3 čočkami NaOH a měřící hlavou. Láhev umístíme na magnetickou míchačku
umístěnou v termoboxu. Měření spotřeby kyslíku zahájíme přibližně po 2 hodinách inkubace
(temperování vzorků a stabilizace prostředí). Měření provádíme dvakrát denně po dobu 5 dnů.
Přesně zaznamenáme hodnoty na displeji a dobu měření.
Příprava kontroly: Do láhve pipetujeme 22,7 ml buněk v DMA. Další postup jako u vzorků.
Vyhodnocení a závěr
Naměřené hodnoty uspořádáme do tabulky. Provedeme přepočet pro objem 22,7 ml tak, že
naměřené hodnoty vynásobíme faktorem 100 (přepočítávací faktor podle metodiky výrobce).
Hodnoty spotřeby kyslíku v mg O2.l-1
vztáhneme na sušinu vložené biomasy a výsledky
korigujeme spotřebou kyslíku v kontrole. Hodnoty zaznamenáme do tabulky a sestrojíme graf
závislosti spotřeby kyslíku na době inkubace. Degradační schopnost jednotlivých kmenů
porovnáme výpočtem mg O2 .mg -1
sušiny.den-1
.
Literatura
Robertz,M., Muckenheim,T., Eckl,S., Webb,L. (2000). Cost-effective method of
determining soil respiration in contaminated and uncontaminated soils for scientific and
routine analysis.In Remediation engineering of contaminated soils Wise,D.L. et al. (Eds.),
Marcel Dekker, Inc. New York-Basel, pp. 573- 583.
12.2 Využití mikroorganizmů k degradaci kontaminovaných půdních
vzorků
Princip metody
Čištění půd kontaminovaných ropou a ropnými deriváty je v praxi urychlováno aplikací
mikrobiálních preparátů s vysokou degradační aktivitou. Mikrobiální preparáty mohou být
tvořeny jedním nebo několika kmeny degradujících mikroorganizmů. O vhodnosti aplikace
těchto preparátů do terénu se můžeme přesvědčit laboratorním pokusem s využitím metody
Oxi-Top.
62
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy:
Pseudomonas putida CCM 4307, Geotrichum candidum CCM 8170
ˇ Chemikálie a roztoky:
vzorek kontaminované půdy, MPB 1, MEB, DMA (zdroj dusíku, fosforu a hořčíku), NaOH,
Tris-HCl (0,05M, pH=7,2), nitrifikační inhibitor NTH600 (WTW)
ˇ Přístroje :
zařízení Oxi-Top (WTW), kalibrované láhve WTW, měřící hlavy,gumová nádobka na
NaOH (odstranění CO2 z prostředí), vodní lázeň, termostat, chlazená centrifuga, magnetická
míchačka, termobox.
Postup
Příprava bakteriální suspenze jako u 12.1.
Příprava vzorku. Půdu protlačíme přes síto o průměru ok 2 mm. Do reakční láhve navážíme
10 g homogenizované půdy a přidáme 10 ml DMA. Vzniklou suspenzi doplníme do objemu
20 ml DMA. Vzorek doplníme 2,7 ml bakteriální suspenze (pro každý kmen připravíme 2
reakční láhve) a přidáme několik zrnek inhibitoru nitrifikace. Do láhve umístíme teflonové
míchadlo a láhev uzavřeme gumovou nádobkou s NaOH a měřící hlavou Oxi-Top. Láhev
umístíme na magnetickou míchačku do termoboxu temperovaného na 26°C. Po 2 hodinách
zahájíme měření půdní respirace vynulováním hodnot na displeji. Odečet hodnot provádíme
po dobu 5 dnů.
Příprava ,,fertilizované" kontroly 1. Do reakční láhve navážíme 10 g homogenizované půdy a
přidáme 10 ml DMA (zdroj dusíku a fosforu). Vzniklou suspenzi doplníme do objemu 22,7
ml DMA. Dále jako u vzorku. Kontrola slouží pro sledování půdní respirace ,,fertilizovaného"
vzorku kontaminované půdy.
Příprava kontroly 2. Připravíme jako kontrolu 1 s tím rozdílem, že místo DMA přidáme
sterilní destilovanou vodu.
Vyhodnocení a závěr
Naměřené hodnoty uspořádáme do tabulky. Provedeme přepočet pro objem 22,7 ml tak, že
naměřené hodnoty vynásobíme faktorem 100 (přepočítávací faktor podle metodiky výrobce).
Hodnoty spotřeby kyslíku vyjádříme v mg O2.l-1
, zaznamenáme do tabulky a sestrojíme graf
závislosti spotřeby kyslíku (k oxidaci organického substrátu ve vzorku resp. kontrole) na době
inkubace. Posoudíme možnost využití aplikovaného mikroorganizmu pro praktickou aplikaci
v odběrové lokalitě.
Literatura
Robertz,M., Muckenheim,T., Eckl,S., Webb,L. (2000). Cost-effective method of
determining soil respiration in contaminated and uncontaminated soils for scientific and
routine analysis.In Remediation engineering of contaminated soils Wise,D.L.et al.
(Eds.),Marcel Dekker, Inc. New York-Basel, pp. 573- 583.
63
13 Stanovení akutní toxicity
Úvod
Bakteriální bioluminiscenční test toxicity (BBTT), v laboratořích známý pod komerčním
názvem Microtox TM
, byl již v 70. let využíván ke stanovení toxicity chemicky definovaných
vzorků a později také ke stanovení toxicity vzorků z prostředí. Monitorování xenobiotik v
životním prostředí je v současné době hlavní oblastí využití BBTT, kdy se mohou v plné míře
uplatnit výhody tohoto testu ­ jednoduché provedení, rychlost odpovědi (je možné měřit
rychlost odpovědi od začátku kontaktu toxikantu s testovacím organizmem) a dobrá
reprodukovatelnost výsledků. Široké uplatnění získává BBTT jako screeningová metoda při
monitorování podzemních, povrchových, odpadních i průmyslových vod, chemických
individuí, komplexů a směsí látek (dobře rozpustných ve vodě). Problematičtější je stanovení
toxicity půdy. V tomto případě musí být nejprve provedena extrakce vzorku a výluh, obvykle
vodní, je potom použit ke stanovení toxicity pomocí BBTT. A právě proces extrakce je
významným zdrojem chyb, protože použitým extrakčním postupem nemusí být vyloužena
všechna xenobiotika přítomná ve vzorku. Metoda BBTT je také označována jako "test akutní
toxicity". V komerčním provedení jsou požívány jako testovací organizmy Photobacterium
phosphoreum nebo Vibrio fisheri.
13.1 Stanovení změn akutní toxicity půdního výluhu v průběhu
biodegradace
Princip metody
Principem metody BBTT je změna v luminiscenci světélkujících bakterií vlivem negativního
působení toxického vzorku. Množství emitovaného světla se měří luminometrem před a po
přidání testované látky a ze změny, zpravidla poklesu, intenzity světla se počítá toxický
účinek. Ten obvykle závisí nejen na koncentraci účinné látky, ale také na době působení.
Proto se provádí měření v sérii zkumavek obsahujících různá ředění toxikantu, která se měří
v čase.
Emise světelného kvanta je spojena s přechodem excitovaných elektronů z vyšších
energetických hladin na nižší. U prokaryot se procesu bioluminiscence účastní specifický
membránový enzym - luciferáza ­ využívající jako koenzym flavinmononukleotid (FMN).
Substrátem je alifatický aldehyd, který je za účasti kyslíku a redukovaného flavinového
koenzymu (FMNH2) excitován a po vyzáření světelného kvanta oxidován na mastnou
kyselinu. Kyslík jako akceptor vodíku elektronů z FMNH2 je redukován na vodu.
Mg2+
FMNH2 + O2 + R-CHO FMN + R-COOH + H2O + h.
Luciferáza
64
Materiál a zařízení
ˇ Mikroorganizmy :
Photobacterium phosphoreum LX ­ 1, Geotrichum candidum CCM 8170
ˇ Chemikálie a roztoky :
MEB, DMA, pufr Tris-HCl (0,05M; pH=7,2), deionizovaná voda, 2% NaCl v deionizované
vodě
ˇ Přístroje :
Luminometr m90a, magnetická míchačka, termostat, stopky, třepačka, centrifuga,
ultratermostat LAUDA
Postup
Příprava bakteriální suspenze. Ze zásobního šikmého agaru Geotrichum candidum CCM 8170
přeočkujeme cca 108
buněk (jedna plná očkovací klička) do 20 ml MEB. Kultivujeme při
30o
C po dobu 24 h a 2 ml připraveného inokula přeočkujeme do 250 ml MEB a pokračujeme
v kultivaci dalších 16h při teplotě 26o
C za intenzivního třepání (125 kyvů min-1
, amplituda 6).
Narostlé buňky centrifugujeme při 6000 ot.min-1
po dobu 20 min. Sediment buněk
resuspendujeme ve stejném objemu Tris-HCl a centrifugujeme. Promývání buněk opakujeme
nejméně třikrát. Buněčný sediment naředíme v DMA tak, aby zákal buněčné suspenze při
vlnové délce 600 nm odpovídal 90%.
Příprava vzorku. Vzorek kontaminované půdy protlačíme přes síto o velikosti ok 2 mm. Do
reagenční láhve odvážíme 10 g homogenizované půdy a přidáme DMA do celkového objemu
20 ml. Vzorek doplníme 2,7 ml promyté suspenze Geotrichum candidum CCM 8170( A600=
85%), do láhve umístíme teflonové míchadlo a láhev opatříme uzávěrem s uhlíkovou vložkou
(k zamezení výdechu nežádoucích plynů). Celkově připravíme 6 lahví. Tři budou sloužit ke
stanovení původní toxicity vzorku a další tři se umístí na míchačku do termostatu
temperovaného na 26 o
C a kultivujeme po dobu 14 dní. Po této době stanovíme toxicitu
vzorků.
Extrakce vzorku. Do reagenční láhve napipetujeme 85 ml deionizované vody a třepeme
intenzivně 24 h při pokojové teplotě. Potom necháme stát 2 h a supernatant centrifugujeme při
8000 ot.min-1
. Ke stanovení toxicity použijeme supernatant, který zředíme podle potřeby
ředící řadou (např. 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10, 1:20) v 2% NaCl.
Resuscitace testovacího kmene. Otevřeme lyofilizovanou kulturu Photobacterium
phosphoreum LX ­ 1, přidáme 0,6 ml 2% NaCl vytemperovaného na +1 o
C a
homogenizujeme otáčením zkumavkou. Doba resuscitace je minimálně 15 min v ledové vodní
lázni (0 ­ 2 o
C).
Příprava pracovní suspenze bakterií pro BBTT. K 6,5 ml 2% NaCl (vytemperovaného na
+15 o
C) přidáme 0,1 ml resuscitovaných buněk. Do 12 připravených měřících zkumavek po
důkladném promíchání napipetujeme po 0,4 ml pracovní suspenze a zkumavky umístíme do
inkubačního bloku luminometru a temperujeme dalších 15 min. při teplotě +15o
C.
Měření bioluminiscence : Nejprve změříme aktuální luminiscenci v první zkumavce a
vložíme zpět do inkubačního boxu, přidáme 0,4 ml vytemperovaného 2% NaCl (slouží jako
kontrola) několikanásobným odebráním kapaliny a opětovným vstříknutím důkladně
promícháme. Potom změříme intenzitu luminiscence ve druhé zkumavce a přidáme 0,4 ml
vzorku ředěného 1:20 a promícháme. Postupně měříme počáteční luminiscenci v ostatních
zkumavkách a vždy po změření přidáme 0,4 ml zvolených ředění vzorku. V temperaci
pokračujeme dalších 5, 15 respektive 30 minut a změříme intenzitu emitovaného světla
postupně ve všech zkumavkách. Kontrolní zkumavky a ředění vzorku připravujeme ve dvou
opakováních v jedné sadě měření.
65
Vyhodnocení a závěr
Mírou toxicity daného vzorku je tzv. efektivní koncentrace, která způsobí definovanou změnu
bioluminiscence, obvykle úbytek. K posouzení toxicity se používá většinou hodnoty EC50 ­
tj. koncentrace způsobující 50% úbytek bioluminiscence ve srovnání s kontrolou v daném
čase [tedy EC50 (5,15,30)], pokud byl vzorek s kulturou v kontaktu 5, 15 respektive 30 minut
za takto definovaných podmínek. Při praktickém měření však nelze ředění dosáhnout právě
takové koncentrace, která způsobí 50% úbytek bioluminiscence. Sleduje se proto toxicita
látky v ředící řadě. Pro jednotlivé vzorky se tedy změří hodnoty luminiscence v čase 0 a t ­
I(0) a I(t), pro kontrolu IB(0) a IB(t). Kontrola sleduje přirozené vyhasínání bioluminiscence a
je vyjádřena koeficientem R (t) = IB(t) / IB(0). Ke kvantitativnímu vyhodnocení se používá
hodnota (t,15) = [I(t0) - I(t15)] / I(t15). Logaritmus  se vynáší proti logaritmu koncentrace a
ze získané závislosti lze na ose x odečíst log EC50. Výpočty hodnoty  se provádí pomocí
programu MICROTOX pro MS-DOS (I.Janda, 1992). Pro hodnocení velmi heterogenních
vzorků (půda, vzorky ze skládek apod.) se obvykle používá jen hodnota  s konstatováním,
že vzorky vykazující hodnotu  větší než 1, 000 jsou považovány za akutně toxické.
Literatura
Bullich, A.A., Tung,K-K. and Schneider, G. (1990). The luminiscent bakteria toxicity test :
its potential as an in vitro alternative. J.Biol.Chem., 5 : 71-77
Damborský, J. a Němec, M. (1996). Použití bakteriálního bioluminiscenčního testu toxicity.
Vodní hospodářství 1:23-25
DIN 38412, Teil 34. Testverfahren mit Wasserorganismen (Gruppe L)
Text byl jazykově upraven podle:
Petráčková,V., Kraus,J. a kol. (1998). Akademický slovník cizích slov, Academia Praha.